절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

요약

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

초록

Proteinuria fenestrated endothelium, 사 지하실 막 그리고 podocytes 그들의 슬릿 격 막으로 구성 된 사 필터의 붕괴에서 유래한 다. 사 필터, 특히 슬릿 격 막의 섬세 한 구조는 다양 한 세포 표면 단백질의 상호 작용에 의존합니다. 공부 하는이 세포 표면 단백질은 생체 외에서 연구 또는 조직학 분석을 제한 되었습니다 지금까지. 여기, 우리 murine vivo에서 biotinylation 라벨 생리 및 pathophysiologic 조건 사 세포 표면 단백질의 연구를 수 있는 방법 제시. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 사 셀 표면 풍부의 반 정량이 새로운 방법, 그리고 모든 단백질 biotin 관류에 액세스할 수와 함께 쉽게 사용할 수 이며 immunoprecipitation 공부 될 수 있다. 또한, 격리 또는 biotinylation 없이 glomeruli의 기본 사 세포 배양 (즉, 기본 podocyte 세포 배양) 뿐만 아니라 사 RNA와 단백질의 분석을 추가 있습니다.

서문

Proteinuria 사 상해의 상징 이며 일반적으로 사 필터¹의 장애를 동반 한다. 사 필터 fenestrated endothelium, 사 지하실 막, 및 podocytes 구성 됩니다. 사 필터의 섬세 한 분자 구조는 매우 역동적이 고 모두 건강 하 고 병에 걸린 신장^{2,3,,45,6에에서 거래 하는 세포 표면 단백질에} . 세포 표면 단백질 endocytosis podocytes⁷의 생존을 위해 필수적인 것으로 표시 되었습니다. Nephrin와 podocalyxin는 막 횡단 단백질 podocytes에 표현. Podocalyxin은 sialoglycoprotein podocytes^8,,910의 보조 발 프로세스 코팅 Nephrin은 사 슬릿 격 막의 중추 이다. Endocytic 매매 이전 표시 되었습니다 nephrin와 podocalyxin^{3,11,12,,1314}에 대 한.

우리의 지식의 베스트에 세포 표면 단백질 endocytosis 하지 아직 설명 하고있다 문학에서 사 내 피 세포에. 그러나, 내 피 세포는 일반적 endocytosis (즉, clathrin 종속, 뗏목 종속 endocytosis)^15,16의 다른 종류에 대 한 모든 필요한 단백질을 표현 한다. 따라서, 내 피 세포 표면 매매 수로 공부 될이 메서드를 사용 하 여, 예를 들어 혈관 내 피 (VE)-cadherin 및 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 셀으로 표면 사 내 피 세포¹⁷ 마커 단백질 .

불행히도, 아니 정확 하 게 체 외에서 모델 필터에 대 한 섬세 한 3 계층화 사 어느 셀에 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다 이다. 이 방법의 목표는 이렇게 사 단백질 밀매 vivo에서공부 하. 또한,이 프로토콜 glomeruli, 추가 분석 사 RNA, 단백질, 세포의 활성화를 격리 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 유사한 사 격리 기법으로 다른 설명 되었습니다^18,19그룹화 합니다.

이전에 우리와 다른 비보 전 사 세포 표면 단백질의 biotinylation^2,,34,,2021에 의해 라벨 사용 했습니다. 그러나,이 비보 전 방법, 격리 glomeruli endocytic 인신 매매에 영향을 미칠 수 있습니다 기계적 스트레스에 노출 되었다. 또는, 사 세포 표면 단백질의 면역 형광 라벨은 광범위 하 게 사용 되었습니다 문학^2,20,22에. 그러나이 방법으로 단백질 수가 적은 하나의 슬라이드 내에서 분석 될 수 있다, 그리고 면역 형광 이미지의 정량은 종종 어려운.

사 세포 표면 단백질 풍부 하 고 매매 정확 하 게에 건강 하 고 병에 걸린 신장, 공부를 신뢰할 수 있는 도구를 제공 하는이 소설은 vivo에서 방법 그리고 면역 형광 시험에 추가로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

마우스는 프랑스에서 1 월 실험실 또는 현지 동물 보호 시설에서 자체 품종으로 획득 했다. 조사 관리 및 실험 동물 사용 (미국 국립 연구소의 건강 게시 번호 85-23, 개정 1996)에 대 한 가이드에 설명 된 지침에 따라 실시 했다. 모든 동물 실험 관련 기관 승인에 따라 수행 했다 (주 정부 LANUV 참조 번호 AZ:84-02.04. 2016.A435)입니다.

1. 악기, 솔루션, 및 장비 준비

1. 1mm 염화 마그네슘 (MgCl₂)과 0.1 m m 칼슘 염화 물 (CaCl₂) 보충 버퍼링 인산 염 분의 1 L를 준비 (PBSCM) 하 고 살 균 필터를 통해 필터링.
2. 관류에 대 한 마우스 당 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 얼음에 그것을 배치.
3. 각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM 0.5 mg/mL 비오 틴 보충의 5 mL을 준비 합니다.
4. 각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 10⁸ 자석 구슬 x 0.8을 추가 (예. 200, 전처리 없이 4 × 10⁸ 구슬/mL 해결책의 µ L)는 glomeruli의 색전술에 대 한. 원래 관 살 균 자석 구슬을 유지 하기 위해 셀 문화 벤치에서이 솔루션을 준비 합니다. 얼음에이 솔루션을 배치 합니다.
5. PBSCM (5 mL 당 마우스)를 100 mM 글리신을 추가 하 여 냉각 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
6. 콜라 솔루션 (0.378 U/mL 콜라 A 메 마른 PBSCM에) 확인 합니다. 마우스, 당 2 mL 튜브에 콜라 솔루션의 1 mL를 플라스틱 하 고 얼음에 그것을 놓습니다.
7. 세척, 살 균 PBSCM 준비 (단계 1.1 참조) 50 ml에서 튜브를 얼음에.
8. 관류, 2.0 mL/min의 흐름으로는 주사기 펌프를 사용 합니다.
9. 21g 바늘으로 10 mL 주사기를 준비 합니다. 20-30 센티미터 긴 카 테 테 르 바늘의 팁 장소 (내경, ID = 0.58 m m). 카 테 터 연결 (0.58 m m ID) 10cm 짧은 카 테 테 르와 (0.28 m m ID) 마우스 대동맥에 쉽게 삽입에 대 한 간접 작은 카 테 터의 끝을 잘라.
10. 수술 동안에 합자 절차, 잘라 마우스 당 3 5-7 cm 실크 스레드 (6-0 4-0).
11. 수술, 3 수술 클램프, 2 수술가 위, 핀셋 2, 2 고급 핀셋, 1 좋은 위, 및 면봉을 준비 합니다. 마 취 (예: 복 마 취 마 취 제 100 mg/kg bodyweight 및 xylazine 5 mg/kg 체중)을 준비 합니다.
12. 두 개의 신장 glomeruli의 격리, 100 µ m 셀 스 트레이너, 2 개의 50 ml 튜브, 그리고 자석 포 수를 사용 하 여.
13. 세포의 용 해 버퍼 챕 준비: 20 m m 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (챕); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 m m sodiumchorlide (NaCl); 50 m m sodiumfluoride (NaF); 15 m m 나₄P₂O₇; 0.1 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; 그리고 2 m m adenosinetriphosphat (ATP)입니다.
14. 4 ° c.에 멋진 원심 분리기

2입니다. 수술 현미경

1. Anesthetize는 마우스 (예를 들어, 케 타 민/xylazine와 intraperitoneally, 단계 참조 1.11). 발가락-핀치 테스트 확인 하는 적절 한 마 취를 수행.
2. 70% 소 프로 파 놀과 마우스의 복 부 측을 치료.
3. 흉 골을 골반에서 피부를 통해 중간 컷을 수행 하 고 핀셋을 사용 하 여 복 부 근 막에서 피부를 제거 합니다. 수술가 위로 복 부 중간 양쪽에는 피부를 잘라.
4. 수술 도구를 변경 합니다. 복 부 근육 층을 통해 방광에 칼에서 중간 컷을 적용 하 고 핀셋과 수술가 위를 사용 하 여 4 개의 사분면으로 나눕니다. 마우스의 목 쪽으로 2 개의 외과 클램프와 클램프 상단 두 옆으로 첨부 합니다.
   참고: 복 지금 열립니다.
5. 따로 멸 균 면봉으로 내장 기관 넣고 잘가 위 키 모 인할지 인 대를 잘라.
6. 2 개의 정밀한 핀셋으로 부 신 샘의 높이에 신장 동맥의 근 위 대동맥 주위 (실크 스레드 4-0 6-0)와 함께 결 찰을 준비 합니다. 핀셋으로 혈액 흐름을 폐지 하 고 인접 대동맥 결 찰을 조입니다.
7. 근 막, 지방, 그리고 다른 조직에서 원심 대동맥 및 미세 수술 핀셋을 사용 하 여 신장 동맥의 두개골 키 모/mesenteric 동맥 주위 결 찰을 준비 합니다.
8. 결 찰 (실크 스레드 4-0 6-0)와 원심 대동맥 주위 신장 동맥의를 준비 하 고 분기의 높이에서 베 나 정 맥과 대동맥을 클램프.
9. 작은 구멍으로 잘라 대동맥 원심 신장 동맥에 구멍은 대동맥의 절반 직경. 대동맥으로 카 테 터를 넣고 준비 된 합자와 그것을 해결.
   주의: 공기 색 전 증을 방지 하기 위해 관류 시스템에서 거품을 피하십시오.
10. 2 mL/min의 유량에 얼음 처럼 차가운 PBSCM로 재 관류를 시작 합니다.
11. 미세 수술가 위 신장 동맥의 수준에서 신장 혈관에 구멍을 삭감 하 고 간장 및 mesenteric 동맥 주위 결 찰 조입니다.
    참고: 신장 한다 돌 창백한는 관류를 시작 후.

3. Vivo에서 Biotinylation

1. 변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 0.5 mg/mL biotin 라벨, 표면에 대 한 보충 하 고 신장 2 mL/min의 유량에 5 mL와 함께 perfuse.
   참고: 혼합 PBSCM 솔루션 (예를 들어, 50 mL 튜브 여) 솔루션 내에 거품 형성 방지를 부드럽게. 주사기 내 솔루션의 포부, 후 주사기에서 어떤 거품 또는 공기를 철수. 주사기에 여분의 정 (21 G)를 사용 하 여 정 맥 카 테 터 시스템에 연결 된에서 공간을 채우기 위해. 마지막으로, 거품 없이 카 테 터와 정 맥에 주사기를 스틱.
2. 거품 없는 주사기는 glomeruli 담금질 2 mL/min의 흐름에 5 mL와 함께 perfuse를 100 mM 글리신 보충 차가운 PBSCM 변경 합니다.
3. 변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 200 μ 자석 구슬/mL으로 보충 하 고 신장 2 mL/min에서 perfuse.
   참고: 신장 표면에 갈색 자석 구슬 glomeruli의 색전술 표시 됩니다.

4입니다. 두 개의 신장에서 Glomeruli의 격리

1. 신장은 hilum에서 제거 하 고 캡슐을 제거. 10 cm 세포 배양 접시에 PBSCM의 15 mL에 얼음에 신장을 놓습니다. 신장 수확 후 마 취에서 자 궁 경부 전위와 마우스 안락사 수술 및 관류 절차 마지막 약 20 ~ 22 분.
2. 신장으로 잘라 작은 조각 가능한 새로운 더블 가장자리 칼 날. 콜라 A의 1 mL 2 mL 튜브에 조직 이동 (단계 1.6 참조) 및 30 분 동안 37 ° C에서 다이제스트. 전후 소화, 피 펫 컷 1000 μ와 부드럽게 섞는다.
3. 얼음 처럼 차가운 PBSCM를 사용 하 여 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직 린스. 부드럽게 셀-스 크레이 퍼를 사용 하 여 나머지 조직 구 유 셀 스 트레이너를 말하다 고 차가운 PBSCM 50 mL의 총 볼륨에 나중에 그것을 씻어.
4. 5 분 제거는 상쾌한 고 resuspend vortexing 펠 릿 하면서 차가운 PBSCM의 약간 미만의 1.5 mL와 펠 릿 4 ° C 500 x g에서 현 탁 액을 원심. 나중에, 새로운 2 mL 튜브에 사 현 탁 액을 넣어.

5입니다. 세척

1. 자석 포 수를 사용 하 여 한쪽에는 glomeruli를 당겨. glomeruli 자석 쪽으로 이동 하기 전에 1 분을 기다립니다.
2. 2 mL 튜브 자석 포 수에 남아 있는 동안 1000 μ 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. 첫 번째 및 두 번째 세척 중 단계 (단계 5.3 참조), 250 μ glomeruli의 손실을 방지 하기 위해 튜브 표면에 뜨는 남아의. 관 구조는 튜브의 바닥에 침 몰 시키는 피하기 위해 신속 하 게이 프로시저를 수행 합니다.
   참고: 세척 절차 오래 지속 됩니다 그렇지 않으면.
3. 자석 포 수에서 2 mL 튜브를 제거 하 고 PBSCM, (매우 중요), 그 아래로 피 펫의 1 mL을 추가 소용돌이.
4. 자석 포 수 튜브를 다시 넣어 고 5.2 단계부터 다시 시작.
5. 세척 단계를 반복 하 여 glomeruli 순도 90%에 도달 했습니다. 이 위해, 현미경 (40-100 X) 상쾌한의 대표적인 약 수를 검사 합니다.
   참고: Glomeruli 갈색 자석 구슬을 포함 하는 둥근 구조로 표시 됩니다. 길쭉한 구조는 관 조각, 그리고 무료 자석 구슬 갈색 둥근 점으로 표시. 셀 파편은 부피가 큰 구조로 나타날 수 있습니다.
6. 순수성에 도달 하면 glomeruli PBSCM의 1 mL에 용 해 하 여 glomeruli의 수를 견적 한다. 혼합 후, 10 μ의 약 수 고 현미경 glomeruli 계산. 다음 방정식으로 glomeruli의 수를 계산: glomeruli의 최종 번호 = 10 μ aliquot x 100에에서 glomeruli의 수.
7. Glomeruli의 성공적인 절연 리드 10000-40000 glomeruli의 범위.

6. 단백질 추출 및 Immunoprecipitation (IP)

1. 6800 x g 5 분에서 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수집 glomeruli 자석 포 수를 사용 하는 동안은 상쾌한을 제거 하 고 얼음 세포의 용 해 버퍼에 펠 릿을 resuspend (예., 300 μ; 30000 glomeruli 챕, 단계 1.11 참조). 30에 대 한 최고 속도로 조직 균질 화기와 샘플을 균질 s와 30 분 동안 얼음에 그들을 lyse.
2. 15000 x g 30 분 4 ° c에서 원심 분리 하 여 불용 성 물질을 제거 새로운 1.5 mL 튜브에 lysate 셀을 포함 하는 상쾌한 플라스틱 펠 릿을 삭제 합니다.
3. Bicinchoninic (BCA)를 사용 하 여는 상쾌한의 단백질 농도 측정-제조업체의 지침에 따라 방법을 기반으로. 30000 glomeruli의 성공적인 세포 사 단백질 양의 700-1000 µ g/mL를 생성합니다. 세포의 용 해 버퍼와 동일한 단백질 양을 조정 합니다.
4. 10%에 대 한 전체 볼륨의 약 수를 사가지고 lysate Laemmli + 5 분 동안 부 화 하기 전에 dithiothreithol (DTT) x 2 95 ° c.에 추가
5. IP, 오버 헤드 통에 4 ° C에서 하룻밤 streptavidin agarose 구슬 lysate의 나머지를 품 어.
6. Agarose 구슬 4 ° C에서 3 분 1000 x g에서 원심, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 난다 단백질 바인딩 위한 구슬 세포의 용 해 버퍼의 800 μ를 추가.
7. 반복 세척 3 번 하 고는 상쾌한을 완전히 제거.
8. 2x Laemmli + DTT의 30 μ를 추가 하 고 5 분 동안 95 ° C에 품 어.
9. Lysate를 로드 하 고 10 %SDS IP 프로브 젤 70 V 30 분, 다음 20에 SDS 젤을 실행 1.5 헤 대 한 젤 당 mA 나중에, 오 점 200에서 2 h 젤 니트로 멤브레인에 mA.
10. 버퍼를 세척에 니트로 막 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 4 ° C에서 하룻밤을 차단 합니다.
11. 4 ° c.에서 하룻밤의 항 체를 막 품 어 세척 통에 5 분 동안 3 번 버퍼와 세척 하 고 실 온에서 1 h HRP 태그 이차 항 체를 막 품 어. 세척 단계를 반복 합니다.
12. lysate 시각화 및 CCD 카메라와 슈퍼 해상도 chemiluminescent 에이전트를 사용 하 여 막에 조사 하는 immunoprecipitation 있습니다.

결과

격리 glomeruli 정확 하 게, 먼저 murine 신장 PBSCM와 perfuse 필요가 있다. PBSCM와 관류 신장 창백 (그림 1A) 나타났다. 마그네틱 구슬 glomeruli의 색전술 신장 표면 (그림 1B)에 갈색 점 들으로 표시 됩니다. 자석 포 수와 glomeruli의 절연 오염 신장 tubuli (그림 1C)으로 표시할 수 있?...

토론

제시 방법 glomeruli 조사 사 RNA 또는 단백질의 성공적인 격리 수 있습니다. 또한, 기본 사 셀 문화 격리 glomeruli에서 수행할 수 있습니다. Biotin 사 격리 하기 전에 적용 되는 경우 사 세포 표면 단백질의 라벨을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로, vivo에서 사 세포 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다, 그리고 단백질 풍부의 반 정량 가능 합니다. 사 세포 표면 단백질 풍부를 성공적으로 테스트를 위?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot