Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Резюме

Здесь мы представляем протокол для мышиных в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков с биотин. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса.

Аннотация

Протеинурия результаты от нарушения клубочковых фильтр, который состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes с их щели диафрагмы. Деликатный структура клубочковых фильтра, особенно щели диафрагмы, опирается на взаимодействие различных клеток поверхности белков. Изучая эти клетки поверхности белки до настоящего времени была ограничена в vitro исследования или гистологический анализ. Здесь мы представляем мышиных в vivo biotinylation маркировки метод, который позволяет исследование белков клубочковых клеток поверхности физиологического и патофизиологические условиях. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса. Полуфинал количественный поверхностного залегания клубочковых клеток легко доступны с этот новый метод и все белки доступным для перфузии биотина и иммунопреципитации могут быть изучены. Кроме того изоляция клубочков, с или без biotinylation позволяет далее анализ клубочковых РНК и белка, а также первичных клубочковых клеток культуры (т.е. первичной Подоцит клеток).

Введение

Протеинурия является отличительной чертой клубочковых травмы и обычно сопровождает нарушение клубочковых фильтра¹. Клубочковой фильтрации состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes. Деликатный молекулярной структуры клубочковой фильтрации очень динамичный и подвергать белка клеточной поверхности оборота как здоровые и больные почки^2,3,4,5,6 . Эндоцитоза поверхностных белков клеток было показано, быть необходимым для выживания podocytes⁷. Трансмембранные белки, выраженные на podocytes Nephrin и podocalyxin. Nephrin является основой клубочковых щели диафрагмы, в то время как podocalyxin является sialoglycoprotein, покрытие процессов вторичного ноги podocytes^8,9,10. Endocytic оборот ранее было показано, для nephrin и podocalyxin^{3,11,12,,1314}.

В меру наших знаний эндоцитоза белков клеток поверхности не еще был описан в клубочковых клеток эндотелия в литературе. Однако эндотелиальные клетки в целом выразить все необходимые белки для различных типов эндоцитоза (то есть, зависящих от Клатрин, плот зависимая эндоцитоза)^15,16. Таким образом, эндотелиальных клеток поверхности людьми может быть изучена с помощью этого метода, используя, например, сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины и внутриклеточных Межмицеллярная молекула (ICAM-2) как клетка поверхности белка маркера для клубочковых клеток эндотелия¹⁷ .

К сожалению не существует точного в vitro модели для деликатной трехслойное клубочковых фильтра, в котором ячейки могут быть изучены людьми поверхности белка. Цель этого метода является таким образом изучить клубочковых белка торговли людьми, в естественных условиях. Кроме того этот протокол содержит информацию о том, как изолировать клубочков, позволяя дальнейшего анализа клубочковых РНК, белки или клетки. Подобные клубочковых изоляции, что методы были описаны различные группы^18,19.

Ранее мы и другие использовали ex vivo маркировки клубочковых клеток поверхности белков biotinylation^2,3,4,,2021. Однако в этом методе ex vivo , изолированные клубочков были подвержены механическому воздействию, которое может повлиять на endocytic людьми. Кроме того Этикетировочный иммунофлуоресценции клубочковых клеток поверхности белков широко использовалась в литературе^2,20,22. С помощью этого метода однако, только небольшое количество белков могут быть проанализированы в течение одного слайда, и количественный иммунофлюоресценции изображений часто бывает трудно.

Этот роман в vivo метод предлагает надежный инструмент для изучения клубочковых клеток поверхности белка изобилия и людьми точно в здоровые и больные почки, и он может использоваться как дополнение к иммунофлюоресценции тесты.

протокол

Мышей были получены как внутренний породы от местных животных ухода объекта или Жанвье лабораторий во Франции. Согласно руководящим принципам, изложенным в руководстве для ухода и использования лабораторных животных (США национальных институтов из здравоохранения публикация № 85-23, редакция 1996) были проведены расследования. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с соответствующих институциональных утверждений (правительство штата LANUV ссылка номер AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. Подготовка документов, решений и оборудования

1. Подготовка 1 Л-фосфатный буфер дополнена хлорид магния 1 мм (₂MgCl) и хлорид кальция 0,1 мм (₂CaCl) (PBSCM) и процеживают через стерильную фильтр.
2. Подготовить 5 мл стерильной PBSCM на мышь для перфузии и поместите его на льду.
3. Для каждой мыши Подготовьте 5 мл стерильной PBSCM дополнена биотина 0.5 мг/мл.
4. Для каждой мыши, подготовить 5 мл стерильной PBSCM и добавить 0,8 x 10⁸ магнитные бусы (например., 200 мкл раствора 4 x 10⁸ шариков/мл, без предварительной обработки) для эмболизации клубочков. Готовить это решение под скамейкой культуры клеток держать магнитные шарики в оригинальной трубки стерильные. Место это решение на льду.
5. Приготовляют раствор закалки, добавив 100 мм глицин PBSCM (5 мл на мыши) и держать его на льду.
6. Сделайте раствор коллагеназы (0,378 ед/мл коллагеназы A в стерильные PBSCM). На мышь Пипетка 1 мл раствора коллагеназы в 2-мл пробирку и поместите его на льду.
7. Для стирки, подготовить стерильные PBSCM (см. шаг 1.1) в 50 мл трубки и поместите его на льду.
8. Для перфузии используйте шприцевый насос с потоком 2.0 мл/мин.
9. Подготовки шприц 10 мл с иглой 21G. Место кончике иглы в 20-30 см длиной катетер (внутренний диаметр, ID = 0,58 мм). Подключите катетера (ID 0,58 мм) с катетером короткие 10 см (ID 0,28 мм) и отрезать кончик катетера меньше косой для легко вставки в аорту мыши.
10. Лигатура процедур во время операции сократить три 5-7 см шелковой нити (4-0 6-0) на мышь.
11. Для хирургии Подготовьте 3 хирургические зажимы, 2 хирургические ножницы, 2 пинцета, 2 штрафа пинцет, 1 штраф ножниц и тампоны. Подготовьте анестезии (например, внутрибрюшинного анестезии кетамином 100 мг/кг веса тела и ксилазина 5 мг/кг веса тела).
12. Для изоляции клубочков почек используйте стрейнер ячейки 100 мкм, две трубы 50 мл и магнит зрелище.
13. Подготовить главы литического буфера: 20 мм 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (главы); 20 мм (гидроксиметил) трис-aminomethan (Tris) рН 7,5; 50 мм sodiumchorlide (NaCl); 50 мм sodiumfluoride (NaF); 15 мм Na₂O₄P₇; 0,1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0; sodiumorthovanadate 2 мм; и 2 мм adenosinetriphosphat (АТФ).
14. Прохладный центрифуги до 4 ° C.

2. хирургии под микроскопом

1. Анестезировать мыши (например, с кетамином/Ксилазина внутрибрюшинно, см. шаг 1.11). Выполните тест мыс пинча для подтверждения надлежащего анестезии.
2. Продезинфицируйте вентральной стороне мыши с 70% изопропиловый спирт.
3. Выполните срединного разреза через кожу от таза до грудины и удалить кожу от брюшной фасции с помощью пинцета. Вырежьте кожу с обеих сторон в середине живота с Ножницы хирургические.
4. Изменить хирургические инструменты. Применять средний отрезок от мечевидного в мочевой пузырь через слой мышц живота и разделить их на четыре квадранта, используя хирургические ножницы и щипчики. Прикрепите верхнюю сторону два с зажимами к шее мыши с двух хирургических зажимов.
   Примечание: Живот теперь открыт.
5. Положите висцеральных органов сторону с помощью стерильного тампона и сократить печеночно диафрагмального связки с тонкой ножницами.
6. Подготовьте перевязки (с шелковой нитью 4-0 6-0) вокруг аорты проксимальных почечных артерий на высоту надпочечников с двумя хорошо пинцетом. Затяните проксимального отдела аорты лигирование отменить поток крови с помощью пинцета.
7. Бесплатный дистальной части аорты из фасции, жир и другие ткани и подготовить лигирование вокруг печени/верхней брыжеечной артерии черепной почечных артерий, с помощью тонкой хирургического пинцета.
8. Подготовить перевязки (с шелковой нитью 4-0 6-0) вокруг аорты дистальных почечных артерий и зажим верхней полой вены и аорты на высоте бифуркации.
9. Вырежьте небольшое отверстие в аорту дистальных почечных артерий так, чтобы отверстие половину диаметра аорты. Поместить катетер в аорту и исправить ее с подготовленной лигатур.
   Предупреждение: Во избежание пузырей в системе перфузии во избежание эмболии.
10. Начните с ледяной PBSCM при скорости потока 2 мл/мин перфузии.
11. Вырезать отверстие в почечной Вены на уровне почечных артерий с тонкой Ножницы хирургические и затяните лигирование вокруг печени и верхней брыжеечной артерии.
    Примечание: Почки должны повернуть бледно после запуска перфузии.

3. в Vivo Biotinylation

1. Изменение шприц, пузырь бесплатно ледяной PBSCM дополнена 0.5 мг/мл биотина для маркировки поверхности и perfuse почками с 5 мл со скоростью потока 2 мл/мин.
   Примечание: Mix PBSCM решения (например, повернув 50 мл трубки) осторожно, чтобы избежать образования пузырьков в рамках решения. После аспирации раствор в шприц эвакуировать или пузырьков воздуха из шприца. Использование дополнительных канюля (21G) на шприц для заполнения пространства в канюли, которая подключена к системе катетера. Наконец вставьте шприц в канюлю с катетер без пузырьков.
2. Измените шприц пузырей на ледяной PBSCM дополнена 100 мм глицин утолить клубочков и perfuse с 5 мл на поток 2 мл/мин.
3. Изменение шприц, пузырь бесплатно ледяной PBSCM дополнена 200 мкл магнитных шариков/мл и perfuse почками в 2 мл/мин.
   Примечание: На поверхности почек, эмболизация клубочков с коричневой магнитные бусы будет видимым.

4. изоляция клубочков из двух почек

1. Почки в рубчик и удалите капсулы. Место на льду в 15 мл PBSCM в 10 см блюдо культуры клеток почек. Усыпить мыши с шейки матки дислокации после сбора урожая почки под наркозом. Процедур хирургии и перфузии длится примерно 20-22 мин.
2. Нарежьте почки наименьшее возможно с новой двойной край лезвия. Переместите ткани в 2-мл пробирку с 1 мл раствора коллагеназы A (см. шаг 1.6) и дайджест при 37 ° C за 30 мин. До и после переваривания осторожно перемешать с 1000 мкл, вырезать пипеткой.
3. Промойте переваривается ткани через стрейнер ячейки 100 мкм, с помощью ледяной PBSCM. Аккуратно используйте клетки скребок для фарш оставшиеся корыта ткани клеток сетчатый фильтр и промойте его с ледяной PBSCM потом к общим объемом 50 мл.
4. Центрифуга подвеска на 4 ° C 500 x g 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с чуть менее 1,5 мл ледяной PBSCM во время vortexing гранул. Впоследствии Положите клубочковых подвеска в новом 2-мл пробирку.

5. мытье

1. Использование магнита зрелище тянуть клубочков в одну сторону. Подождите 1 мин до клубочков перешли к магниту.
2. Удалите супернатант с 1000 мкл пипетки 2-мл пробирку остается в магнит зрелище. Во время первой и второй стирки шаги (см. шаг 5.3), 250 мкл супернатанта остается в трубе, во избежание потери клубочков. Выполните эту процедуру быстро, чтобы избежать давая трубчатых структур опускаться на дно трубки.
   Примечание: Процедура стирки будет длиться дольше, в противном случае.
3. Снять 2-мл пробирку с магнит зрелище и добавить 1 мл PBSCM, Пипетка вверх и вниз (очень важно), затем вихря.
4. Положить трубку обратно в магнит зрелище и начать с шага 5.2.
5. Повторите шаги Стиральная чистоту клубочков достигла 90%. Для этого проверьте представитель Алиготе супернатант под микроскопом (40-100 X).
   Примечание: Клубочков будет отображаться как круглые структуры, содержащие коричневый магнитные бусы. Удлиненные структуры трубчатых фрагменты, и свободный магнитные шарики появляются как коричневый круглыми точками. Ячейки мусор может появиться как громоздкие структуры.
6. Если достигается чистота, оцените количество клубочков, растворяя клубочков в 1 мл PBSCM. После смешивания, возьмите Алиготе 10 мкл и рассчитывать клубочков под микроскопом. Рассчитать количество клубочков с помощью следующего уравнения: окончательное количество клубочков = количество клубочков в 10 мкл аликвота x 100.
7. Успешной изоляции клубочков приводит к ряду 10000-40000 клубочков.

6. белка добычу и иммунопреципитации (IP)

1. Собирать клубочков центрифугированием при 4 ° C на 6800 х g для 5 минут удалить супернатант при использовании магнит зрелище и Ресуспензируйте гранулы ледяной литического буфера (например., 30000 клубочков в 300 мкл; РЕБЯТА, смотрите шаг 1.11). Однородный образцы с ткани гомогенизатор на максимальной скорости для 30 s и лизируют их на льду за 30 мин.
2. Удаление нерастворимый материал центрифугированием на 15000 x г за 30 мин на 4 ° C. Пипетка супернатанта, которая включает в себя клетки lysate в новой 1,5 мл трубку. Выбросите гранулы.
3. Измерить концентрацию белка супернатант с помощью bicinchoninic (BCA)-на основе метода следуя инструкциям производителя. Успешное лизис 30000 клубочков уступает клубочковых белка, количество 700-1000 мкг/мл. Приспособиться к суммы равной белка с буфера lysis.
4. Возьмите Алиготе 10% от общего объема для клубочковых lysate и добавить 2 x Лэмли + dithiothreithol (DTT) до инкубации в течение 5 мин при 95 ° C.
5. Для IP-адреса Инкубируйте остальной части lysate стрептавидина агарозы бисером на ночь при 4 ° C на накладных шейкер.
6. Центрифуга агарозы бусы на 1000 x g 3 мин при температуре 4 ° C, удалить супернатант и добавить 800 мкл буфера lysis мыть Бусины для связывания неспецифических белков.
7. Повторить 3 раза мыть и полностью удалить супернатант.
8. Добавьте 30 мкл 2 x Лэмли + DTT и Инкубируйте на 95 ° C за 5 мин.
9. Загрузить lysate и IP зонды на 10% SDS гель и Побегите гель SDS 70 V 30 мин, затем 20 мА на гель для 1,5 ч. После этого, пятно гель для 2 h 200 мА на нитроцеллюлозную мембрану.
10. Блокировать нитроцеллюлозную мембрану на ночь при 4 ° C с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в отмывающего буфера.
11. Проинкубируйте мембрану с антителом интерес на ночь при 4 ° C. Промойте отмывающим буфером 3 раза за 5 мин в шейкере и Проинкубируйте мембрану с ПХ тегами вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре. Повторите шаг стирки.
12. Визуализировать lysate и иммунопреципитации зонды на мембрану с помощью супер-резолюции хемилюминесцентный агента с ПЗС-камеры.

Результаты

Чтобы изолировать клубочков точно, надо сначала perfuse мышиных почки с PBSCM. Перфузия с PBSCM поворачивает почки бледно (рис. 1А). Эмболизация клубочков с магнитной бусины будет виден как коричневые точки на поверхности почек (рис. 1

Обсуждение

Представленный метод позволяет успешно изоляции клубочков расследовать клубочковых RNA или протеина. Кроме того культуры первичной клубочковых клеток может выполняться из изолированных клубочков. Если биотина применяется перед клубочковых изоляции, маркировки клубочковых клеток по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot