הערכה של מספר נפרורון בכליה שלמה באמצעות שיטת השימוש באסיד

Summary

הערכות של מספר כליות נפרורון מלאה הם חשובים קלינית וניסויים, כפי שיש האגודה ההופכית בין מספר נפרורון וסיכון משופר של מחלות כליות וכלי דם. להלן, השימוש בשיטת החומצה המקורית, המספקת הערכות מהירות ואמינות של מספר כליות מלאה של הכליה, מומחש.

Abstract

הקרן לנפרורון מתייחסת למספר הכולל של הנליות שאדם נולד עם, כנפרוגנזה בבני אדם מסתיימת ב-36 שבועות של הריון, ואין הנפרות חדשות נוצרות לאחר הלידה. מספר נפרורון מתייחס למספר הכולל של הנליות שנמדדות בכל נקודה בזמן שלאחר הלידה. שני הגורמים הגנטיים והסביבתיים משפיעים הן על הקרן והן על המספר. הבנת האופן שבו גנים או גורמים ספציפיים להשפיע על תהליך של נפרורופגנזה ו נפרורון אובדן או מוות הוא חשוב כמו אנשים עם הקרן לנפרורון נמוך או מספר נחשבים להיות בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות כליות או קרדיו. הבנת האופן בו חשיפות סביבתיות במהלך חייו של אדם משפיעים גם על מספר הנפרורון חיוני בקביעת הסיכון למחלות עתידיות. כך, את היכולת להעריך את מספר כליות נפרון שלם במהירות ובאמינות היא דרישה ניסיונית בסיסית כדי להבין טוב יותר מנגנונים התורמים או לקדם הפסד נפרוגנזה או נפרורון. כאן, אנו מתארים את שיטת החומצה להערכת מספר כליות נפרון שלם על בסיס ההליך המתואר על ידי דדדיאן, שאוורי, ו בריקר, עם שינויים קלים. שיטת החומציות מספקת הערכות מהירות ואמינות של מספר נפרורון (כפי שמוערך על ידי ספירת פקולי) הנמצאות בטווח של 5% מאלה שנקבעו באמצעות שיטות מתקדמות יותר, אם כי יקרות, כגון דימות תהודה מגנטית. יתרה מזאת, שיטת החומציות היא שיטת תפוקה גבוהה מעולה להערכת מספר נפרורון במספר רב של דגימות או תנאים ניסיוניים.

Introduction

הנפרון הוא גם המבנה הבסיסי והיחידה הפונקציונלית של הכליה¹. מבנית, הנפרורון מורכב הפקעית (נימים ופודוקציטים) ממוקם בתוך הקפסולה של באומן וכדורית כליות, המורכב של הכדורית האבותית, לולאה של הנלה, ואת הכליה המרוחק שמסיים את תעלת האיסוף. מבחינה פונקציונלית, תפקידה של הנפרורון הוא סינון וספיגה חוזרת של מים ואלקטרוליטים והפרשת פסולת. באופן כללי, כליירוגנזה הושלמה ב 36 שבועות של הריון בבני אדם וזמן קצר לאחר הלידה במספר מינים כגון העכבר והחולדה². הקרן לנפרורון מתייחסת למספר הכולל של הנליות שאדם נולד בו, ואילו מספר הנפרורון הוא המספר הכולל של הנליות שנמדדו בכל עת שלאחר לידה³. המונח מספר נפרורון ומספר פקריפיות משמשים לעתים קרובות לסירוגין. כי יש רק חד-עין אחד לנפרורון, הערכה של מספר גלואראולי הוא תחליף חשוב להערכת מספר נפרורון.

הערכה של מספר נפרורון ו נפרורון הוא העניין הקליני כמו מחקרים הוכיחו קשר בין הקרן הנרון לבין מספרים נפרורון מופחת עם שכיחות מוגברת של מחלות לב וכלי דם^{4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15}. מבוסס על ממצאים בכליות בנתיחה שלאחר המוות, ברנר ציין כי יתר לחץ דם שהוצגו עם מספר כולל נמוך יותר של הנליות מאשר normotensive אנשים¹⁶. לפיכך, ברנר שיערו שיש קשר הפוך בין מספר נפרורון והסיכון לפתח לחץ דם מאוחר יותר בחיים. ברנר שיערו גם שירידה במספר הנפרון הייתה מפוצה על ידי הנליות שנותרו. על מנת לשמור על שיעור הסינון הרגיל בכליה, שיורית לפצות מפצה על ידי הגדלת השטח שלהם לפני הפקיית העין (היפרפרופילציה), ובכך לעבוד כדי להמתיק כל השפעה שלילית של הפסד נפרורון על תפקוד הכליה^{4 ,בן 16}

בעוד המגן בטווח הקצר, היפרפרהפרפרס, בטווח הארוך, מוביל הגדלת נתרן ונוזלים מוגברת, נפח נוזלים מוגבר, ומגדיל את לחץ הדם העורקי, המוביל למחזור קסמים של עליות נוספות ב לחץ נימי-דם, היפרסינון, וצלקות נפרון (טרשת נפוצה) ופציעה^4,16.

קבלת הערכות או ספירות של מספר נפרורון להציע כמה יתרונות ניסיוניים: 1) הוא מספק מידע לגבי תהליך של נפרוגנזה, אשר יכול להיות מקושר לגנים או גורמים ספציפיים בסביבה או העובר האימהי-העוברי, ו 2) יש אסוציאציה של מספר נפרורון עם מחלות לב וכלי דם, ולכן יש פוטנציאל כי האומדנים של מספר נפרורון יכול לשמש כדי לחזות את הסיכון וכלי דם עתידיים^2,17,18, מיכל ^{בן 19 ,} מיכל בן ^{20 ,} מיכל ^{בן 21 , 22}. בנוסף לסביבה אימהית-עוברית, מחלות שונות משפיעות ישירות מספר נפרורון ותפקוד הכליות, כולל טרשת עורקים, סוכרת, יתר לחץ דם, ואפילו הזדקנות נורמלית^{2,9, . עשר,11,12,22,23} לפיכך, הערכה של מספר כליות מלאה הכליה חשוב להבין הן את הגורמים הגנטיים והסביבתיים המשפיעים על כליירוגנזה (כלומר, הקרן הנפרון) ומספר נפרורון במהלך חייו של אדם וההשפעות הנובעות על תפקוד הכליות ובריאות לב וכלי דם.

כיום, ישנן מספר שיטות זמין לקביעת וכימות של מספר נפרורון, כל אחד עם יתרונות ומגבלות משלו^{24,25,26,27,28 ,29,30}. שיטות מתוחכמות לקביעת כליה כולה מספר נפרורון כוללות שיטות סטריאולוגיות, כגון שיטת הניתוח/שבירה, ודימות תהודה מגנטית^25,26. לעתים קרובות נחשב בתקן הזהב לקביעת מספר כליות נפרון שלם, שיטת הניתוח/שבירה היא יקרה וגוזלת זמן. ההתקדמות והשיפור האחרונים בדימות תהודה מגנטית ובעיבוד סיפקו את הכלים לספירת כל הנפרון בנפרד. עם זאת, דימות תהודה מגנטית הוא לא רק זמן רב אלא גם יקר מאוד. בנוסף, גם השיטה הבתר-שבירה והדמיה מגנטית מחייבת מומחיות טכנית מתקדמת, ובכך מגבילה את השימוש בשיטות שכאלה ברוב מעבדות המחקר.

רוב השיטות של קביעת מספר נפרון לעשות ספירות או הערכות המבוססות על זיהוי של פקולי, כפי שהם בקלות לזיהוי מבנית. במאמר זה, את שיטת החומצה להערכת מספר נפרורון בכליה כולה מתוארת והפגינו²⁷. שיטת החומצה היא מהירה, אמינה, ומשמעותית פחות יקר משיטות אחרות, כגון שיטת הניתוח/השבר והדמיה של תהודה מגנטית. יתר על כן, שיטת ההאטה של החומצה מספקת הערכות לשחזור מאוד של מספר נפרורון שדווחו להיות בטווח של אלה שנקבעו באמצעות דימות תהודה מגנטית²⁶.

Protocol

אספקה וריאגנטים המפורטים להלן לקביעת הכליה כולה מספר נפרורון בעכבר אחד, כלומר, שתי כליות. שינויים לשימוש בשיטת החומצה לחולדה מזוהים עם כוכביות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים תאמו את המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי.

1. נוהל בידוד כליה

1. שוקלים את העכבר (או מינים אחרים) והמתת אותו באמצעות isofלוריאן (5%-8%) מנת יתר או פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג הזרקת הצפק).
2. לאחר העכבר מורדמים, פתח את חלל הבטן שלו באמצעות מספריים כירורגי משובח לאורך קו האמצע.
3. הרימו בזהירות את המעיים ואדיפוז הרבייה לצד הימני של חלל הבטן. , באמצעות ניתוח מגעיל. תבודדי את הכליה השמאלית בעזרת מספריים כירורגיים משובחים, חותכים את עורק הכליה השמאלי ואת הווריד ומסירים בזהירות את הכליה השמאלית, וממקמת את הכליה בתווית כראוי (מספר/מזהה העכבר) שוקלים סירה המכילה מתמיסת זרחן באגירה (PBS).
4. חזור על ההליך של הכליה הנכונה.
5. להסיר כל כליה מהסירה שוקלים בהתאמה ולמקם אותו על גזה כירורגית הרטיב מראש עם PBS.
6. השארת הכליה על גזה כירורגית, להסיר במהירות כל רקמה שאינה כליות חסיד (כגון perirenal האדיפוז או בלוטת יותרת הכליה) ואחריו הסרת כמוסת הכליה. שוקלים כל כליה בנפרד, הקלטת את המשקל של הכליה השמאלית והימנית בנפרד במחברת מעבדה.

2. הומוגון, דגירה והליכי מאמץ

1. לאחר כל כליה הוא שוקל, לנקז כל הסירה שוקלים של PBS ולמקם את הכליות בחזרה לתוך הסירה בעלת תווית כראוי שוקל. , משתמש בסכין גילוח נקייה. חותכת את הכליה לחצי, לאורכו מניחים כל כליה חצי פונה למטה וחותכים כל חצי לחתיכות 2-mm או קטן.
2. באמצעות סכין גילוח זהה, בזהירות לאסוף ולמקם את חתיכות כליה קצוצים לתוך שפופרת מסומן 15-mL חרוט ( מספר העכבר/מזהה; שמאל לעומת הכליה הימנית).
3. חזור על ההליך עבור הכליה הנגדית, באמצעות להב תער חדש. הניחו את הכליה הקצוצה בשפופרת חרוט בעלת תווית של 15 מ ל בנפרד.
4. ב מאוורר היטב המאוורר, להוסיף 5 מ ל 6 מ ' חומצה הידרוכלורית (HCl) 15-mL כל 1-מ"ל צינור חרוט.
5. החליפו את המכסה לצינור החרוט, הכשלו בעדינות את תערובת הכליות/HCl, והניחו את צינור ה-15-mL לאמבט מים מחומם מראש ב-37 ° c עבור 90 דקות (* 120 דקות לכליות חולדה).
6. בקצרה מתפרעים כל 15-mL צינור כל 15 דקות במהלך הדגירה כדי להבטיח כי כל הרקמה נחשפת חומצה HCl.
7. הכנס מחט של 18 גרם לתוך מזרק של 5 מ ל (* 10-mL מזרק לחולדה) והסר בזהירות את המזרק. הניחו את המזרק בשפופרת חרוט ב50-mL (צינור1) בתוך מכסה המנוע.
8. הסר את הפתרון כליה/HCl מאמבט המים ושפוך את פתרון הרקמה לקצה הפתוח של המזרק והגדר את הצינורית החרוטית של 15 מ"ל בתוך מתלה מבחנה. בזהירות להחליף את הבוכנה ולדחוף לאט את הבוכנה כדי להפוך את הפתרון דרך המחט לתוך הצינור1.
9. שטפו את צינור ה-15 מ"ל עם 5 מ ל של פתרון PBS. מערבולת הPBS ב-15-mL שפופרת חרוט כדי לפתרון כל רקמת הכליה הנותרת.
10. שוב, להסיר בזהירות את הבוכנה ממזרק 5-mL המכיל את המחט 18-G ולשפוך את התוכן מצינור ה-15-mL החרוט לקצה הפתוח של המזרק. החלף בזהירות את הבוכנה ורוקן את המזרק על-ידי דחיפת בעדינות על הבוכנה, לתוך צינור1. חזור על התהליך 2x (שבוצע בסכום כולל של 3 x).
11. הכנס מחט 21-G לתוך מזרק חדש 5-mL (* 10-mL מזרק לחולדה) ולהסיר בזהירות את המזרק מזרק. מניחים את המזרק עם מחט 21-G המצורפת לשפופרת 50-mL חדשה (צינור2).
12. יוצקים את התוכן מהצינור1 לקצה הפתוח של המזרק המכיל את המחט 21-G. הכנס בזהירות את הבוכנה ורוקן את המזרק על-ידי דחיפת בעדינות על המזרק והצבת הפתרון המובלטת לתוך2 הצינור.
13. שטוף צינור1 עם 5 מ ל של פתרון PBS. מערבולת הPBS ב1 שפופרת כדי לפתרון כל רקמת הכליה הנותרת.
14. שוב, בזהירות להסיר את הבוכנה ממזרק 5-mL המכיל את המחט 18-G ויוצקים את התוכן מצינור1 לקצה הפתוח של המזרק. בזהירות להחליף את הבוכנה ולשטוף את המזרק על ידי דוחף בעדינות למטה על הבוכנה, הבלטת ממד הפתרון לתוך צינור2. חזור על התהליך 2x (שבוצע בסכום כולל של 3 x).
15. הביאו את נפח הצינור הכולל2 עד 50 mL על ידי הוספת PBS נוספים, עד לקו 50-mL ב2 הצינור.
16. שפופרת דגירה2 המכיל את הפתרון רקמת הכליה במדף הצינור על צלחת נדנדה במקרר להגדיר ב 4 ° צ' לילה (מינימום 8-10 h).

3. ספירה לפקולי ולחילוץ מספר הנפרורון

1. הסירו2 הצינור מהמקרר והשהה מחדש את רקמת הפלטד על ידי היפוך עדין של הצינורית מספר פעמים כדי ליצור פתרון הומוגנית. אנו ממליצים לספור בתוך 5 d לאחר העיבוד.
2. בזהירות סדרת מחלקים 500 μl של פתרון הכליה לתוך באר אחת של 12-היטב צלחת. חזור על 2x זה, הצבת כל סדרת מחלקים לתוך באר נפרדת, כך שיש שלוש בארות של פתרון כליות לכל כליה, לניתוח בטרילקאט.
3. הוסף 500 μL של PBS לכל אחת משלוש הבארות המכילות את פתרון הכליה, עבור דילול 1:1.
4. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לספור את מספר הגלואראולי לטובה. הספירה מסייעת באמצעות רשת של 16 סעיפים נפרדים הממוקמים בתחתית כל באר. לספור את מספר הגלואראולי לכל מקטע הרשת ולאחר מכן לסכם את הספירה למטה כדי לקבל את המספר הכולל של גלואראולי לחלוטין. לפקאולי ניתן לזהות בקלות. על ידי המבנה הכדורי שלהם מזהים נוספים כללו גוון אדמדם בגלל נימים ממולאים בדם, כמו גם טרום-או לאחר-העורקים הנותרים מחוברים לגוף של פקולי בודדים (איור 1).
5. הוסף את המספר הכולל של גלואראולי שנספר לכל אחת משלוש הבארות ולאחר מכן תחלק אותם בשלושה עבור המספר הממוצע של הפקולי לכל 500 μL של פתרון כליות. אם השונות במספר הממוצע של הפקולי לבאר גדולה מ-10%, חזרו על ההליך לספירת הנפרורון, והקשיבו היטב לאופי האחיד של פתרון הכליה. הכפל את מספר הפקולי שנספר בכל פעם 100 למספר הממוצע של הפקעות לכל כליה. מספר הנפרון הכולל ניתן לביטוי לכל כליה או באמצעות משקל כליות, לכל מ ג או g של רקמה.

תוצאות

להלן האומדנים מייצגים של מספר כליות נפרורון שלם ממודל עכבר מבוסס של יתר לחץ דם ומודל חולדה גנטית של מחלת כליות כרונית הקשורה לגיל. מפתח מאפיינים מזהים של גלואראולי, כגון מבנה כדורית עם או בלי מחוברים pre-או post-arteriolar או מבנים הכרישים, מסומנים עבור אלה חדש השיטה חומצה (

Discussion

עם הטכניקה הניסיונית טובה, שיטת החומצה המקורית אידיאלית להערכת מספר נפרון בכליה שלמה. למרות הכליה היא מומס חומצה, פקולי להישאר במידה רבה והוא מזהה בקלות, מה שהופך את הספירה של פקולי בודדים יחסית קל ופשוט. טכניקת החומצה היא יתרון במיוחד מכמה סיבות. ראשית, שיטת החומציות היא שיטה מהירה ונוחה ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable