A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הערכות של מספר כליות נפרורון מלאה הם חשובים קלינית וניסויים, כפי שיש האגודה ההופכית בין מספר נפרורון וסיכון משופר של מחלות כליות וכלי דם. להלן, השימוש בשיטת החומצה המקורית, המספקת הערכות מהירות ואמינות של מספר כליות מלאה של הכליה, מומחש.
הקרן לנפרורון מתייחסת למספר הכולל של הנליות שאדם נולד עם, כנפרוגנזה בבני אדם מסתיימת ב-36 שבועות של הריון, ואין הנפרות חדשות נוצרות לאחר הלידה. מספר נפרורון מתייחס למספר הכולל של הנליות שנמדדות בכל נקודה בזמן שלאחר הלידה. שני הגורמים הגנטיים והסביבתיים משפיעים הן על הקרן והן על המספר. הבנת האופן שבו גנים או גורמים ספציפיים להשפיע על תהליך של נפרורופגנזה ו נפרורון אובדן או מוות הוא חשוב כמו אנשים עם הקרן לנפרורון נמוך או מספר נחשבים להיות בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות כליות או קרדיו. הבנת האופן בו חשיפות סביבתיות במהלך חייו של אדם משפיעים גם על מספר הנפרורון חיוני בקביעת הסיכון למחלות עתידיות. כך, את היכולת להעריך את מספר כליות נפרון שלם במהירות ובאמינות היא דרישה ניסיונית בסיסית כדי להבין טוב יותר מנגנונים התורמים או לקדם הפסד נפרוגנזה או נפרורון. כאן, אנו מתארים את שיטת החומצה להערכת מספר כליות נפרון שלם על בסיס ההליך המתואר על ידי דדדיאן, שאוורי, ו בריקר, עם שינויים קלים. שיטת החומציות מספקת הערכות מהירות ואמינות של מספר נפרורון (כפי שמוערך על ידי ספירת פקולי) הנמצאות בטווח של 5% מאלה שנקבעו באמצעות שיטות מתקדמות יותר, אם כי יקרות, כגון דימות תהודה מגנטית. יתרה מזאת, שיטת החומציות היא שיטת תפוקה גבוהה מעולה להערכת מספר נפרורון במספר רב של דגימות או תנאים ניסיוניים.
הנפרון הוא גם המבנה הבסיסי והיחידה הפונקציונלית של הכליה1. מבנית, הנפרורון מורכב הפקעית (נימים ופודוקציטים) ממוקם בתוך הקפסולה של באומן וכדורית כליות, המורכב של הכדורית האבותית, לולאה של הנלה, ואת הכליה המרוחק שמסיים את תעלת האיסוף. מבחינה פונקציונלית, תפקידה של הנפרורון הוא סינון וספיגה חוזרת של מים ואלקטרוליטים והפרשת פסולת. באופן כללי, כליירוגנזה הושלמה ב 36 שבועות של הריון בבני אדם וזמן קצר לאחר הלידה במספר מינים כגון העכבר והחולדה2. הקרן לנפרורון מתייחסת למספר הכולל של הנליות שאדם נולד בו, ואילו מספר הנפרורון הוא המספר הכולל של הנליות שנמדדו בכל עת שלאחר לידה3. המונח מספר נפרורון ומספר פקריפיות משמשים לעתים קרובות לסירוגין. כי יש רק חד-עין אחד לנפרורון, הערכה של מספר גלואראולי הוא תחליף חשוב להערכת מספר נפרורון.
הערכה של מספר נפרורון ו נפרורון הוא העניין הקליני כמו מחקרים הוכיחו קשר בין הקרן הנרון לבין מספרים נפרורון מופחת עם שכיחות מוגברת של מחלות לב וכלי דם4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. מבוסס על ממצאים בכליות בנתיחה שלאחר המוות, ברנר ציין כי יתר לחץ דם שהוצגו עם מספר כולל נמוך יותר של הנליות מאשר normotensive אנשים16. לפיכך, ברנר שיערו שיש קשר הפוך בין מספר נפרורון והסיכון לפתח לחץ דם מאוחר יותר בחיים. ברנר שיערו גם שירידה במספר הנפרון הייתה מפוצה על ידי הנליות שנותרו. על מנת לשמור על שיעור הסינון הרגיל בכליה, שיורית לפצות מפצה על ידי הגדלת השטח שלהם לפני הפקיית העין (היפרפרופילציה), ובכך לעבוד כדי להמתיק כל השפעה שלילית של הפסד נפרורון על תפקוד הכליה4 ,בן 16
בעוד המגן בטווח הקצר, היפרפרהפרפרס, בטווח הארוך, מוביל הגדלת נתרן ונוזלים מוגברת, נפח נוזלים מוגבר, ומגדיל את לחץ הדם העורקי, המוביל למחזור קסמים של עליות נוספות ב לחץ נימי-דם, היפרסינון, וצלקות נפרון (טרשת נפוצה) ופציעה4,16.
קבלת הערכות או ספירות של מספר נפרורון להציע כמה יתרונות ניסיוניים: 1) הוא מספק מידע לגבי תהליך של נפרוגנזה, אשר יכול להיות מקושר לגנים או גורמים ספציפיים בסביבה או העובר האימהי-העוברי, ו 2) יש אסוציאציה של מספר נפרורון עם מחלות לב וכלי דם, ולכן יש פוטנציאל כי האומדנים של מספר נפרורון יכול לשמש כדי לחזות את הסיכון וכלי דם עתידיים2,17,18, מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , 22. בנוסף לסביבה אימהית-עוברית, מחלות שונות משפיעות ישירות מספר נפרורון ותפקוד הכליות, כולל טרשת עורקים, סוכרת, יתר לחץ דם, ואפילו הזדקנות נורמלית2,9, . עשר,11,12,22,23 לפיכך, הערכה של מספר כליות מלאה הכליה חשוב להבין הן את הגורמים הגנטיים והסביבתיים המשפיעים על כליירוגנזה (כלומר, הקרן הנפרון) ומספר נפרורון במהלך חייו של אדם וההשפעות הנובעות על תפקוד הכליות ובריאות לב וכלי דם.
כיום, ישנן מספר שיטות זמין לקביעת וכימות של מספר נפרורון, כל אחד עם יתרונות ומגבלות משלו24,25,26,27,28 ,29,30. שיטות מתוחכמות לקביעת כליה כולה מספר נפרורון כוללות שיטות סטריאולוגיות, כגון שיטת הניתוח/שבירה, ודימות תהודה מגנטית25,26. לעתים קרובות נחשב בתקן הזהב לקביעת מספר כליות נפרון שלם, שיטת הניתוח/שבירה היא יקרה וגוזלת זמן. ההתקדמות והשיפור האחרונים בדימות תהודה מגנטית ובעיבוד סיפקו את הכלים לספירת כל הנפרון בנפרד. עם זאת, דימות תהודה מגנטית הוא לא רק זמן רב אלא גם יקר מאוד. בנוסף, גם השיטה הבתר-שבירה והדמיה מגנטית מחייבת מומחיות טכנית מתקדמת, ובכך מגבילה את השימוש בשיטות שכאלה ברוב מעבדות המחקר.
רוב השיטות של קביעת מספר נפרון לעשות ספירות או הערכות המבוססות על זיהוי של פקולי, כפי שהם בקלות לזיהוי מבנית. במאמר זה, את שיטת החומצה להערכת מספר נפרורון בכליה כולה מתוארת והפגינו27. שיטת החומצה היא מהירה, אמינה, ומשמעותית פחות יקר משיטות אחרות, כגון שיטת הניתוח/השבר והדמיה של תהודה מגנטית. יתר על כן, שיטת ההאטה של החומצה מספקת הערכות לשחזור מאוד של מספר נפרורון שדווחו להיות בטווח של אלה שנקבעו באמצעות דימות תהודה מגנטית26.
אספקה וריאגנטים המפורטים להלן לקביעת הכליה כולה מספר נפרורון בעכבר אחד, כלומר, שתי כליות. שינויים לשימוש בשיטת החומצה לחולדה מזוהים עם כוכביות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים תאמו את המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי.
1. נוהל בידוד כליה
2. הומוגון, דגירה והליכי מאמץ
3. ספירה לפקולי ולחילוץ מספר הנפרורון
להלן האומדנים מייצגים של מספר כליות נפרורון שלם ממודל עכבר מבוסס של יתר לחץ דם ומודל חולדה גנטית של מחלת כליות כרונית הקשורה לגיל. מפתח מאפיינים מזהים של גלואראולי, כגון מבנה כדורית עם או בלי מחוברים pre-או post-arteriolar או מבנים הכרישים, מסומנים עבור אלה חדש השיטה חומצה (
עם הטכניקה הניסיונית טובה, שיטת החומצה המקורית אידיאלית להערכת מספר נפרון בכליה שלמה. למרות הכליה היא מומס חומצה, פקולי להישאר במידה רבה והוא מזהה בקלות, מה שהופך את הספירה של פקולי בודדים יחסית קל ופשוט. טכניקת החומצה היא יתרון במיוחד מכמה סיבות. ראשית, שיטת החומציות היא שיטה מהירה ונוחה ה...
. למחברים אין מה לגלות
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, לב לאומי, ריאות ומכון בלאד (R01HL107632).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved