Estimativa do número de néfron em rim inteiro usando o método de maceração ácida

Resumo

As estimativas do número inteiro do nephron do rim são importantes clìnica e experimentalmente, porque há uma associação inversa entre o número do nephron e um risco aumentado de doença renal e cardiovascular. Nisto, o uso do método ácido da maceração, que fornece estimativas rápidas e de confiança do número inteiro do nephron do rim, é demonstrado.

Resumo

O investidura de nephron refere o número total de néfrons um indivíduo é carregado com, porque o nefrogênese nos seres humanos é terminado por 36 semanas da gestação e nenhum néfrons novo é dado forma ao borne-nascimento. O número de néfron refere-se ao número total de néfrons medidos em qualquer momento pós-parto. Tanto os fatores genéticos quanto os ambientais influenciam tanto a investidura de néfron quanto o número. Entender como genes ou fatores específicos influenciam o processo de nefrogênese e perda ou morte de néfron é importante, já que indivíduos com menor investidura ou número de néfron são pensados para estarem em maior risco de desenvolver doenças renais ou cardiovasculares. Compreender como as exposições ambientais no decorrer da vida de uma pessoa afeta o número de néfron também será vital para determinar o risco de doença futuro. Assim, a capacidade de avaliar o número de néfron de rim inteiro de forma rápida e confiável é um requisito experimental básico para compreender melhor os mecanismos que contribuem para ou promovem a nefrogênese ou perda de néfron. Aqui, nós descrevemos o método ácido da maceração para a estimativa do número inteiro do nephron do rim baseado no procedimento descrito por Damadian, por Shawayri, e por Bricker, com modificações ligeiras. O método de maceração ácida fornece estimativas rápidas e confiáveis do número de néfron (conforme avaliado pela contagem de glomérulos) que estão dentro de 5% daqueles determinados usando métodos mais avançados, embora caros, como a ressonância magnética. Além disso, o método de maceração ácida é um excelente método de alta taxa de transferência para avaliar o número de néfron em grandes quantidades de amostras ou condições experimentais.

Introdução

O nephron é a unidade estrutural básica e funcional do rim¹. Estruturalmente, o nephron consiste no glomérulo (capilares e podocytes) situados dentro da cápsula de Bowman e do túbulo renal, consistindo no túbulo proximal, no laço de Henle, e no túbulo longe do ponto de origem que termina no duto de coleta. Funcionalmente, o papel do nephron é a filtração e a reabsorção de água e eletrólitos e a secreção de resíduos. Em geral, a nefrogênese é concluída em 36 semanas de gestação em seres humanos e logo após o nascimento em várias espécies, como o rato e o rato². A investidura de nephron refere-se ao número total de néfrons que um indivíduo nasce com, enquanto o número de néfron é o número total de néfrons medidos a qualquer momento pós-parto³. O termo número de néfron e número glomerular são freqüentemente usados alternadamente. Porque há somente um glomérulo por o nephron, a avaliação do número dos glomérulos é um substituto importante para estimar o número do nephron.

A avaliação da investidura de néfron e do número de néfron é de interesse clínico, pois estudos demonstraram uma associação entre a investidura de néfron e os números de nefrons reduzidos com uma incidência aumentada de doença cardiovascular^{4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15}. com base nos achados em rins na autópsia, Brenner observou que os hipertensos apresentavam um número total menor de néfrons do que indivíduos normotensos¹⁶. Assim, Brenner hipótese que há uma relação inversa entre o número do nephron e o risco de desenvolver a hipertensão mais tarde na vida. Brenner igualmente supor que uma redução no número do nephron estêve compensada para pelos néfrons que remanesceu. A fim de manter a taxa de filtração normal no rim, os nefrons residuais compensam aumentando sua área de superfície glomerular (hipertrofia glomerular), assim trabalhando para mitigar todo o efeito adverso da perda do nephron na função renal^{4 ,16}.

Enquanto protetora no curto prazo, a hipertrofia glomerular, a longo prazo, leva ao aumento da retenção de sódio e fluidos, aumento do volume do fluido extracelular, e aumentos na pressão arterial, levando a um ciclo vicioso de aumentos adicionais em pressão capilar glomerular, hiperfiltração glomerular e cicatriz de néfron (esclerose) e lesão^4,16.

A obtenção de estimativas ou contagens de número de néfron oferecem algumas vantagens experimentais: 1) fornece informações sobre o processo de nefrogênese, que pode então ser ligada a genes ou fatores específicos no embrião ou no ambiente materno-fetal, e 2) Há uma associação do número de nephron com doença cardiovascular e, assim, há o potencial que as estimativas do número do nephron poderiam ser usadas para prever o risco cardiovascular futuro^{2,17,18, 19} anos de ^{, 20} anos de ^{, 21} anos de ^{, 22}. além do ambiente materno-fetal, várias doenças impactam diretamente o número de néfron e a função renal, incluindo aterosclerose, diabetes, hipertensão, e até mesmo o envelhecimento normal^{2,9, 10,11,12,22,23}. Assim, a avaliação do número de nephron do rim inteiro é importante compreender ambos os fatores genéticos e ambientais que afetam o nefrogênese (istoé, o Endowment do nephron) e o número do nephron sobre o curso da vida de uma pessoa e os efeitos resultantes sobre a função renal e a saúde cardiovascular.

Atualmente, existem vários métodos disponíveis para a determinação e quantificação do número de nefrons, cada um com suas próprias vantagens e limitações^24,25,26,^{27,28 ,29,30}. Métodos sofisticados para determinar o número de nefrons renais inteiros incluem métodos estereológicos, como o método do dissector/fraccionador, e a ressonância magnética^25,26. Considerado frequentemente o ouro-padrão para determinar o número inteiro do nephron do rim, o método do dissector/fractionator é caro e demorado. Os avanços e a melhoria recentes na imagem latente e no processamento de ressonância magnética forneceram as ferramentas para contar cada um e cada nephron individualmente. Entretanto, a imagem latente de ressonância magnética é não somente demorada mas igualmente extremamente cara. Além disso, tanto o método do dissector/fraccionador como a ressonância magnética requerem conhecimentos técnicos avançados, limitando assim o uso de tais métodos na maioria dos laboratórios de pesquisa.

A maioria de métodos de determinar o número do nephron fazem contagens ou estimativas baseadas na identificação dos glomérulos, porque são prontamente identificáveis estruturalmente. Neste papel, o método ácido da maceração para estimar o número do nephron no rim inteiro é descrito e demonstrado²⁷. O método ácido da maceração é rápido, de confiança, e significativamente menos caro do que outros métodos, tais como o método do dissector/fractionator e a imagem latente de ressonância magnética. Além disso, o método ácido da maceração fornece estimativas altamente repetíveis do número do nephron que foram relatados para estar dentro da escala daquelas determinadas usando a imagem latente de ressonância magnética²⁶.

Protocolo

Suprimentos e reagentes listados abaixo são para a determinação de todo o número de nefrons renais em um rato, ou seja, dois rins. As modificações para o uso do método ácido da maceração para o rato são identificadas com asteriscos. Todos os protocolos experimentais conformados com o guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro médico da Universidade do Mississippi.

1. procedimento de isolamento renal

1. Pesar o rato (ou outras espécies) e eutanizar-lo com um isoflurano (5%-8%) dose excessiva ou pentobarbital (150 mg/kg de injeção intraperitoneal).
2. Uma vez que o rato é eutanasiado, abra sua cavidade abdominal usando tesouras cirúrgicas finas ao longo da linha média.
3. Levante cuidadosamente os intestinos e a adiposo reprodutiva para o lado direito da cavidade abdominal. Por dissecção bruta, isole o rim esquerdo. Usando tesouras cirúrgicas finas, corte a artéria e a veia renais esquerdas e remova com cuidado o rim esquerdo, coloc o rim em um barco apropriadamente etiquetado (número/identificador do rato) que contem o Saline do fósforo-tamponado (PBS).
4. Repita o procedimento para o rim direito.
5. Retire cada rim de seu respectivo barco de pesagem e coloque-o sobre uma gaze cirúrgica pré-umedecida com PBS.
6. Deixando o rim na gaze cirúrgica, remova rapidamente todo o tecido não-renal aderente (tal como o adiposo perirrenal ou a glândula ad-renal) seguido pela remoção da cápsula renal. Pesar cada rim individualmente, registrando o peso do rim esquerdo e direito separadamente em um caderno de laboratório.

2. homogeneização, incubação, e straining procedimentos

1. Uma vez que cada rim é pesado, escorra cada barco de pesagem de PBS e coloque os rins de volta no barco de pesagem apropriadamente rotulado. Usando uma lâmina de barbear limpa, corte o rim ao meio, longitudinalmente. Coloque cada metade do rim virada para baixo e corte cada metade em pedaços de 2 mm ou menores.
2. Usando o mesmo Razorblade, cuidadosamente recolher e colocar os pedaços de rim picado em um rotulado 15-mL tubo cônico (número do mouse/identificador; esquerda versus rim direito).
3. Repita o procedimento para o rim oposto, usando uma lâmina de barbear nova. Coloque o rim picado em um tubo cônico de 15 mL rotulado separadamente.
4. Em uma capa de fumaça bem ventilada, adicione 5 mL de ácido clorídrico (HCl) de 6 M a cada tubo cônico de 15 mL.
5. Substitua a tampa ao tubo cônico, agitar suavemente a mistura rim/HCl, e coloque o tubo cônico de 15 mL em um banho de água pré-aquecido fixado em 37 ° c por 90 min (* 120 min para rins de rato).
6. Agitar brevemente cada tubo de 15 mL a cada 15 min durante a incubação, a fim de garantir que todo o tecido é exposto ao ácido HCl.
7. Insira uma agulha de 18 G numa seringa de 5 mL (* seringa de 10 mL para rato) e Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa. Coloque a seringa num tubo cônico de 50 mL (tubo #1) numa capa de fumos.
8. Retire a solução de rim/HCl do banho de água e despeje a solução de tecido na extremidade aberta da seringa e defina o tubo cônico de 15 mL de lado em um rack de tubo de ensaio. Substitua cuidadosamente o êmbolo e empurre lentamente o êmbolo de modo a expulsar a solução através da agulha e no tubo #1.
9. Lave o tubo cônico de 15 mL com 5 mL de solução de PBS. Gire o PBS no tubo cônico de 15 mL para solubilizar qualquer tecido renal remanescente.
10. Novamente, Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa de 5 mL que contém a agulha de 18 G e despeje o conteúdo do tubo cônico de 15 mL na extremidade aberta da seringa. Substitua cuidadosamente o êmbolo e lave a seringa empurrando suavemente para baixo no êmbolo, no tubo #1. Repita este processo 2x (executado 3x no total).
11. Insira uma agulha de 21 G numa nova seringa de 5 mL (* seringa de 10 mL para rato) e Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa. Coloque a seringa com a agulha de 21 G presa num novo tubo cônico de 50 mL (tubo #2).
12. Despeje o conteúdo do tubo #1 na extremidade aberta da seringa contendo a agulha de 21 G. Insira cuidadosamente o êmbolo e lave a seringa empurrando suavemente o êmbolo da seringa e colocando a solução extrudada no tubo #2.
13. #1 de tubo de lavagem com 5 mL de solução de PBS. Gire o PBS no tubo #1 de forma a solubilizar qualquer tecido renal remanescente.
14. Novamente, Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa de 5 mL que contém a agulha de 18 G e despeje o conteúdo do tubo #1 na extremidade aberta da seringa. Substitua cuidadosamente o êmbolo e lave a seringa empurrando suavemente para baixo no êmbolo, expulsando a solução para o tubo #2. Repita este processo 2x (executado 3x no total).
15. Traga o volume total do tubo #2 até 50 mL adicionando PBS adicional, até a linha 50-mL no tubo #2.
16. Incubar #2 tubo contendo a solução de tecido renal em uma cremalheira do tubo em uma placa de balancim em um refrigerador ajustado em 4 ° c durante a noite (mínimo 8-10 h).

3. contagem de glomérulos e extrapolação do número de Nefrons

1. Retire a #2 do tubo da geladeira e ressuspender o tecido peletizado, invertendo suavemente o tubo várias vezes, a fim de criar uma solução homogênea. Recomendamos a contagem de glomérulos dentro de 5 d após o processamento.
2. Alíquota com cuidado 500 μl da solução do rim em um único poço de uma placa de 12 poços. Repita este 2x, colocando cada alíquota em um poço separado de modo que existam três poços de solução renal por rim, para análise em triplicado.
3. Adicionar 500 μL de PBS a cada um dos três poços contendo a solução de rim, para uma diluição de 1:1.
4. Usando um microscópio invertido, conte o número de glomérulos por poço. A contagem é auxiliada usando uma grade de 16 seções separadas colocadas na parte inferior de cada poço. Conte o número de glomérulos por cada seção em grade e, em seguida, somar a contagem por grade para obter o número total de glomérulos por poço. Os glomérulos são prontamente identificáveis por sua estrutura esférica. Identificadores adicionais incluíram um matiz avermelhado devido a capilares cheios de sangue, bem como pré ou pós-arteríolas que permanecem presas ao corpo de glomérulos individuais (Figura 1).
5. Adicionar o número total de glomérulos contados por cada um dos três poços e, em seguida, dividi-los por três para o número médio de glomérulos por 500 μL de solução renal. Se a variância no número médio de glomérulos por poço for superior a 10%, repita o procedimento de contagem de nefrons, prestando muita atenção à natureza homogênea da solução renal. Multiplicar o número de glomérulos contados por bem vezes 100 para o número médio de glomérulos por rim. O número total de néfron pode ser expresso por rim ou, usando peso renal, por mg ou g de tecido.

Resultados

Estão abaixo as estimativas representativas do número inteiro do nephron do rim de um modelo estabelecido do rato da hipertensão e de um modelo genético do rato da doença de rim crônica idade-relacionada. As principais características de identificação dos glomérulos, como uma estrutura esférica com ou sem estruturas anexadas pré ou pós-arteriolar ou Tubular, são destacadas para aqueles que são novos no método de maceração ácida (Figura 1).<...

Discussão

Com boa técnica experimental, o método de maceração ácida é ideal para estimar o número de néfron em rim inteiro. Embora o rim seja dissolvido em ácido, os glomérulos permanecem em grande parte intactos e são prontamente identificáveis, tornando a contagem de glomérulos individuais relativamente fáceis e diretas. A técnica de maceração ácida é particularmente vantajosa por várias razões. Primeiro, o método de maceração ácida é um método rápido e conveniente que requer relativamente pouco em te...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable