JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Оценки по целому количеству почек нефрона важны клинически и экспериментально, так как существует обратная связь между числом нефрона и повышенной опасностью почечных и сердечно-сосудистых заболеваний. При этом демонстрируется использование метода кислотного мацерации, который обеспечивает быструю и надежную оценку всего количества почек нефррона.

Аннотация

Облечение нефрона относится к общему количеству нефронов, с которыми рождается человек, поскольку нефрогенез у человека завершается 36 неделями гестации, и после родов не образуются новые нефроны. Число нефрона относится к общему количеству нефраонов, измеряемых в любой момент после родов. Как генетические, так и экологические факторы влияют на одаренность нефрона и их количество. Понимание того, как конкретные гены или факторы, влияющие на процесс нефрогенеза и потери нефрон или кончины важно, как лиц с меньшим облечения нефрона или числа, как полагают, на более высокий риск развития почечной или сердечно-сосудистых заболеваний. Понимание того, как воздействие на окружающую среду в течение жизни человека влияет на число нефрон также будет иметь жизненно важное значение в определении будущего риска заболевания. Таким образом, способность оценивать быстро и надежно количество всей почки нефрона является базовым экспериментальным требованием для лучшего понимания механизмов, способствующих или способствующих нефрологенезу или потере нефрона. Здесь мы описываем метод кислотного мацерации для оценки количества почек нефррона, основанного на процедуре, описанной Дамадкой, Шавайри и Брикер, с небольшими изменениями. Метод кислотного мацерации обеспечивает быструю и надежную оценку числа нефрона (оцениваемых путем подсчета клубочков), которые находятся в пределах 5% от тех, которые определяются с использованием более продвинутых, хотя и дорогостоящих, методов, таких как магнитно-резонансная томография. Кроме того, метод кислотного мацерации является отличным методом высокой пропускной способности для оценки номера нефрона в большом количестве образцов или экспериментальных условиях.

Введение

Нефрон является как основной структурной, так и функциональной единицей почки1. Структурно нефрон состоит из клубочек (капилляров и додокитов), расположенных в пределах боуменовой капсулы и почечной трубочки, состоящей из проксимальной трубочки, петли Хенле и дистальной трубочки, которая прекращается в собирающий проток. Функционально, роль нефрона заключается в фильтрации и реабсорбции воды и электролитов и секреции отходов. В целом, нефрогенез завершается в 36 недель гестации у людей и вскоре после рождения в нескольких видах, таких как мышь и крыса2. Облечение нефрона относится к общему количеству нефронов, с которыми рождается индивидуум, в то время как число нефрона составляет общее количество нефронов, измеряемых в любое время после рождения3. Термин «нефрон» и номер клубочковой часто используются как взаимозаменяемые. Поскольку существует только один клубочек на нефрон, оценка клубочков числа является важным суррогатом для оценки числа нефрон.

Оценка фонда нефрона и числа нефрона представляет клинический интерес, поскольку исследования продемонстрировали связь между одаренностью нефрона и сокращениями нефрона с увеличением заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. Основываясь на результатах в почках при вскрытии, Бреннер заметил, что гипертензивные особи представлены с меньшим общим числом нефронов, чем нормотенсивные особи16. Таким образом, Бреннер предположил, что существует обратная зависимость между числом нефрона и риском развития гипертонии в дальнейшей жизни. Бреннер также предположил, что сокращение числа нефрона компенсируется нефронами, которые остались. Для того чтобы поддерживать нормальный тариф фильтрации в почках, остаточные нефроны компенсируют путем увеличивать их клубочковой поверхностную OBLASTь (гипертрофия клубочковой), таким образом работая для того чтобы уменьшить любое неблагоприятное влияние потери нефрона на функции почек4 ,16.

Хотя защитные в краткосрочной перспективе, клубочковой гипертрофия, в долгосрочной перспективе, приводит к увеличению натрия и жидкости удержания, увеличение объема внеклеточного жидкости, и увеличение артериального давления, что приводит к порочный круг дальнейшего увеличения клубочковой капилляра давление, клубочковой гиперфильтрации, и нефрон рубцов (склероз) и травмы4,16.

Получение оценок или отсчетов нефрона предлагают несколько экспериментальных преимуществ: 1) он предоставляет информацию о процессе нефрогенеза, которые затем могут быть связаны с конкретными генами или факторами в эмбрионе или матери и плода окружающей среды, и 2) существует Ассоциация номера нефрона с сердечно-сосудистыми заболеваниями, и, таким образом, существует вероятность того, что оценки числа нефрона могут быть использованы для прогнозирования будущих сердечно-сосудистых рисков2,17,18, в 19 , 20 , 21 год , 22. в дополнение к окружающей среде матери и плода, некоторые заболевания оказывают непосредственное влияние на число нефрона и функции почек, включая атеросклероз, диабет, гипертонию и даже нормальное старение2,9, 10,11,12,22,23. Таким образом, оценка числа ненефрона в целом почки имеет важное значение для понимания как генетических, так и экологических факторов, влияющих на нефрогенез (например, облечение нефрон) и числа нефрона в течение жизни человека и результирующий эффект на функции почек и сердечно-сосудистой системы.

В настоящее время существует несколько методов определения и количественной оценки числа нефрон, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения24,25,26,27,28 ,29,30. Изощренные методы для определения целого ряда почек нефрона включают стереологических методов, таких как метод дезсектора/фракционитор, и магнитно-резонансная томография25,26. Часто считается золотым стандартом для определения всей почечной число нефрон, диссектор/фракционитор метод является дорогостоящим и трудоемким. Недавние достижения и совершенствование магнитно-резонансной томографии и обработки предоставили инструменты для подсчета каждого нефрона индивидуально. Однако магнитно-резонансная томография является не только трудоемкой, но и чрезвычайно дорогостоящей. Кроме того, метод дезсектора/фракционирующих и магнитно-резонансной томографии требует наличия передовых технических знаний, что ограничивает использование таких методов в большинстве исследовательских лабораторий.

Большинство методов определения количества нефрона делают подсчет или оценку на основе идентификации клубочков, поскольку они легко идентифицируемые структурно. В данной статье описан и продемонстрирован27метод кислотного мацерации для расчета числа нефрона в целом почках. Метод кислотного мацерации быстр, надежен и значительно дешевле, чем другие методы, такие как метод дезсектора/фракционификатора и магнитно-резонансная томография. Кроме того, метод кислотного мацерации обеспечивает высоковоспроизводимые оценки числа нефрона, которые, как сообщалось, находятся в диапазоне тех, которые определяются с помощью магнитно-резонансной томографии26.

протокол

Материалы и реагенты, перечисленные ниже, предназначены для определения целой почки нефрона в одной мыши, то есть две почки. Модификации для применения метода кислотного мацерации для крыс отождествляется со звездочками. Все экспериментальные протоколы соответствовали национальным институтам здравоохранения руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены институционального ухода за животными и Комитета по использованию в университете штата Миссисипи медицинский центр.

1. почечная изоляция процедура

  1. Взвешивание мыши (или других видов) и усыпить его с изофлуран (5%-8%) передозировки или пентобарбатал (150 мг/кг интраперитонеальная инъекции).
  2. Как только мышь усыпляют, откройте ее брюшную полость, используя тонкие хирургические ножницы вдоль средней линии.
  3. Осторожно поднимите кишечник и репродуктивную жировой ткани на правую сторону брюшной полости. По грубой рассечения, изолировать левую почку. Используя тонкие хирургические ножницы, вырезать левую почечную артерию и Вену и аккуратно удалить левую почку, поместив почки в надлежащим образом помечены (мышь номер/идентификатор) весят лодку, содержащую фосфорно-буферизованные физиологический раствор (PBS).
  4. Повторите процедуру для правой почки.
  5. Извлекайте каждую почку от своего соответственно взвесьте шлюпку и положите ее на хирургическую марлю предварительно смоченную с PBS.
  6. Оставляя почки на хирургическую марлю, быстро удалить любые приверженец не-почечной ткани (например, perirenal жировой или надпочечников), а затем удаление почечной капсулы. Взвешивайте каждую почку индивидуально, фиксировав вес левой и правой почки отдельно в лабораторном блокноте.

2. процедуры гомогенизации, инкубации и напряжения

  1. После того, как каждая почка взвешивается, слейте каждый вес лодки PBS и поместите почки обратно в надлежащим образом помечены весят лодку. Использование чистого лезвия бритвы, вырезать почки пополам, продольно. Поместите каждую почку наполовину вниз и разрезать каждую половину на 2-мм или более мелкие кусочки.
  2. С помощью той же бритвы, тщательно собирать и размещать нарезанные кусочки почки в помечены 15 мл конической трубки (мышь номер/идентификатор; слева против правой почки).
  3. Повторите процедуру для противоположной почки, используя новое лезвие бритвы. Поместите нарезанную почку в отдельно обозначенный 15-мл коническую трубку.
  4. В хорошо проветриваемом вытяжной вытяжке, добавьте 5 мл 6 м соляного (совместимого) кислоты в каждую 15-мл конической трубки.
  5. Замените крышку на коническую трубку, мягко агитировать почки/совместимого смеси, и поместить 15-мл конической трубки в предварительно разогретой водяной бане на 37 ° c для 90 мин (* 120 мин для крыс почек).
  6. Кратко агитируйте каждую 15-мл трубку каждые 15 минут во время инкубации, чтобы гарантировать, что все ткани подвергается совместимого кислоты.
  7. Вставить 18-G иглы в шприц 5-мл (* 10-мл шприца для крыс) и осторожно снимите плунжера шприца. Поместите шприц в 50-мл конической трубки (трубка #1) в вытяжной капюшон.
  8. Удалите почку/совместимого раствора от водяной бане и вылейте раствор ткани в открытый конец шприца и установите 15-мл конической трубки в сторону в стойке пробирки. Осторожно замените поршень и медленно нажмите поршень, чтобы выдавде раствор через иглу и в трубку #1.
  9. Вымойте 15-мл конической трубки с 5 мл раствора PBS. Водоворот PBS в 15-мл конической трубки, с тем чтобы раствориться любой оставшейся ткани почек.
  10. Опять же, осторожно удалите поршень из 5-мл шприца, содержащего 18-G иглы и залить содержимое из 15-мл конической трубки в открытый конец шприца. Осторожно замените поршень и промойте шприц, осторожно нажав на поршень, в трубку #1. Повторите этот процесс 2x (выполняется 3x в общей сложности).
  11. Вставьте 21-G иглы в новый 5-мл шприца (* 10-мл шприца для крыс) и осторожно снимите плунжера шприца. Поместите шприц с иглой 21-G, прикрепленной к новой 50-мл конической трубки (трубка #2).
  12. Вылейте содержимое из трубки #1 в открытый конец шприца, содержащего иглу 21 г. Осторожно вставьте поршень и промойте шприц, осторожно нажав на шприц поршень и размещение экструдированного раствора в трубку #2.
  13. Вымойте трубку #1 с 5 мл раствора PBS. Водоворот PBS в трубке #1 таким образом, чтобы раствориться любой оставшейся ткани почек.
  14. Опять же, осторожно удалите поршень из 5-мл шприца, содержащего 18-G иглы и залить содержимое трубки #1 в открытый конец шприца. Осторожно замените поршень и промойте шприц, осторожно нажав на поршень, выдав раствор в трубку #2. Повторите этот процесс 2x (выполняется 3x в общей сложности).
  15. Довести общий объем трубки #2 до 50 мл, добавив дополнительные PBS, до 50 мл линии на трубке #2.
  16. Инкубировать трубку #2 содержащие раствор ткани почки в трубку стойки на плите рокер в холодильник установлен на 4 °C ночь (минимум 8-10 h).

3. Подсчет клубочков и экстраполяция номера нефрона

  1. Удалите трубку #2 из холодильника и ресуспензируем ткань, мягко переворавая трубку несколько раз для того, чтобы создать однородное решение. Мы рекомендуем считать клубочков в течение 5 d после обработки.
  2. Тщательно Алиготе 500 мкл раствора почки в один колодец 12-хорошо пластины. Повторите это 2x, помещая каждого Алиготе в отдельный колодец, так что есть три скважины почечного раствора на почку, для анализа в трех экземплярах.
  3. Добавьте 500 мкл PBS к каждому из трех скважин, содержащих раствор почки, для разведения 1:1.
  4. Использование перевернутого микроскопа, подсчитать количество клубочков per хорошо. Подсчет помогает с помощью сетки из 16 отдельных разделов, размещенных на дне каждого хорошо. Подсчитывайте количество клубочков в каждом разделе сетки, а затем суммированные подсчет в сетке, чтобы получить общее количество клубочков per хорошо. Клубочков легко узнаваемы по их сферической структуре. Дополнительные идентификаторы включали красноватый оттенок из-за заполненных кровью капилляров, а также пред-или пост-артериол, которые остаются прикрепленными к телу отдельных клубочков (рис. 1).
  5. Добавьте общее количество клубочков подсчитанных в каждый из 3 скважин и после этого разделите их 3 для среднего числа клубочков в 500 мкл разрешения почки. Если дисперсия в среднем количестве клубочков на скважины превышает 10%, повторите процедуру подсчета нефрона, уделяя пристальное внимание однородной природе раствора почек. Умножьте число клубочков подсчитанных в также времена 100 для среднего числа клубочков в почку. Общий номер нефрона может быть выражен в почках или, с использованием веса почки, на мг или г ткани.

Результаты

Ниже приведены репрезентативные оценки по целому количеству почек нефрона от установленной модели мыши гипертонии и генетической модели крыс возрастных хронических заболеваний почек. Ключевые идентификационные характеристики клубочков, такие как сферическая стру...

Обсуждение

При хорошей экспериментальной технике метод кислотного мацерации идеален для оценки количества нефрона в целой почке. Хотя почка растворяется в кислоте, клубочков остаются в значительной степени нетронутыми и легко поддаются идентификации, что делает подсчет индивидуальных клубочк?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана в части национальными институтами здоровья, национальное сердце, Лунг, и институт крови (R01HL107632).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Isoflurane anesthesiaAbbott Laboratories05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gaugeBraintree ScientificVP IInclude medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LEDLeica MicrosystemsDMIL LEDAny make also suitable
Digital water bathFisher Scientific2239Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissorsFine Science Tools14058-1125 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.Biomed Res Instruments, Inc10-1760Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.any source suitablen/aAny make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dishFisher Scientific02-2002-100Any make also suitable
Razor bladesFisher Scientific12-640Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 plyFisher ScientificMSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)Sigma AldrichP5493-4LDilute to 1x 
6 N Hydrocholric acid solutionSigma Aldrich3750-32
15 mL conical centrifuge tubeFisher Scientific14-959-70CAny make also suitable
50 mL conical centrifuge tubeFisher Scientific14-959-49AAny make also suitable
Disposable 5 mL syringeCole PalmerEW-07944-06Any make also suitable
18G1.5 disposable needleFisher Scientific14-826-5DAny make also suitable
21G1.5 disposable needleFisher Scientific14-826-5BAny make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lidCole Palmer#FW-01959-06Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rackCole Palmer#EW-06733-00Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable

Ссылки

  1. Hall, J. E., Guyton, A. C. . Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , (2016).
  2. Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
  3. Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
  4. Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
  5. Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
  6. Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
  7. Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension?. American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
  8. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  9. Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
  10. Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
  11. Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
  12. Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  13. Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
  14. Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
  15. Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
  16. Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other?. American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
  17. Clark, A. T., Bertram, J. F. Molecular regulation of nephron endowment. American Journal of Physiology. 276 (4 Pt 2), F485-F497 (1999).
  18. Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
  19. Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
  20. Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
  21. Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
  22. Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
  23. Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
  24. Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
  25. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  26. Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  27. Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
  28. Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
  29. Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
  30. Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
  31. Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
  32. Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  33. Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
  34. Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
  35. Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены