JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.

Abstract

פיתחנו כלי הן להעשיר ולהרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. הדבר יכול להיות שימושי במקרים כגון א) להבחין בקיומה של תאי T אנטיגן ספציפי, ב) לחקור את הדינמיקה של אנטיגן ספציפי תגובות, ג) להבין כמה תגובות אנטיגן ספציפי משפיעים על מצב מחלה כגון מחלת חיסון עצמי, ד) להזדהותו הטרוגניות תגובות עבור תאי T אנטיגן ספציפי או E) לנצל תאים אנטיגן ספציפי לטיפול. הכלי מבוסס על חלקיקים מגנטיים כי אנחנו נזווג אנטיגן ספציפי של אותות co-stimulatory תא T, כך שאנחנו טווח כמו מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). כתוצאה מכך, מאז הטכנולוגיה היא פשוט לייצר, זה יכול בקלות להיות שאומצה על ידי מעבדות אחרות; לכן, המטרה שלנו כאן הוא לתאר בפירוט את ייצור ושימוש עוקבות aAPCs. נסביר כיצד לצרף אותות אנטיגן ספציפי, co-stimulatory aAPCs, כיצד לנצל אותם כדי להעשיר עבור תאי T אנטיגן ספציפי וכיצד להרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. יתר על כן, אנו ידגיש הנדסה עיצוב שיקולים בהתבסס על מידע ניסיוני והביולוגיה של הניסיון שלנו עם אפיון בתאי T אנטיגן ספציפי.

Introduction

עם עליית immunotherapies רבים, יש צורך להיות מסוגלים לאפיין ולשלוט תגובות מערכת החיסון. בפרט, התגובה החיסונית מסתגלת היא עניין בשל ירידה לפרטים העמידות של התאים. לאחרונה, טיפולים chimeric אנטיגן-קולטן תא T אושרו לטיפול בסרטן; עם זאת, אנטיגן-הקולטנים מבוססים הנחה נפוצה תא השטח אנטיגן CD19, במקום אנטיגנים ספציפיים סרטן1. מעבר יחודיות, immunotherapies יכול גם סובלים מחוסר שליטה, ומוגבל להבנת התגובה החיסונית דינאמיים בתוך סרטן או מחלת חיסון עצמי.

הוא אחד האתגרים של הלומדים אנטיגן ספציפי תגובות שלהם בתדר נמוך מאוד, למשל., תאי T אנטיגן ספציפי הם 1 מתוך כל 104 עד 106 T תאים2,3. לפיכך, כדי לחקור איזה T תאים קיימים או להגיב, התאים צריכים להיות מועשר או מורחבת, או האות שלהם צריך להיות מוגבר. זה יקר וקשה לשמור על התאים מזין תוך שימוש בטכניקות הנוכחי פוקוס על ההתרחבות של תאים אנטיגן ספציפי. טכניקות הנוכחי התמקד מגביר את האיתות של אנטיגן ספציפי T תאים, כמו assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT), להגביל להשתמש מחדש של התאים אלה T4. לבסוף, בגלל רגישות נמוכה, לעיתים קרובות אלה שתי טכניקות צריך להיות משולבת עבור ספירה אנטיגן ספציפי.

כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו את מגנטיים מבוססי ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן המציג תא (aAPC)5,6,7,8. יכול להיות functionalized את aAPC עם קומפלקס אנטיגן ספציפי אות-פפטיד טעון histocompatibility הגדולות (pMHC) - ומולקולות co-stimulatory -למשל., נוגדן anti-CD28-לשניהם להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי ולאחר מכן לאחר מכן לעורר התרחבותן (איור 1). החלקיקים ולכן יכול להיות מוצר מדף חסכונית יכול להיות הן אישית כדי שיענה אנטיגן ספציפי stimulations עדיין סטנדרטית על פני ניסויים ומטופלים. ביצוע של העשרה והרחבה לעיבוד תוצאות מאות אלפים קיפול להתרחבות תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי ולא יכול לגרום תדרים עד 60 אחוזים לאחר רק שבוע אחד, המאפשר את אפיון או טיפולית השימוש הגדול מספר התאים. במסמך זה, אנו מתארים כיצד ליצור ננו-חלקיק aAPCs, כמה קריטי בעיצוב שיקולים בבחירת המאפיינים ננו-חלקיק, להדגים כמה תוצאות טיפוסיות של ניצול החלקיקים בידוד והרחבת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי נדיר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים היו נשמרים לפי הנחיות שאושרו על-ידי הועד המוסדי של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. לטעון Dimeric מתחם Histocompatibility מייג'ור נוגדן חלבון כימרי (MHC-Ig) עם רצף פפטיד אנטיגן הרצוי.

הערה: אם משתמש H - 2Kb: Ig, ולאחר מכן פעל פרוטוקול מפורט ב 1.1 שלב; אם משתמש H-2Db:Ig, ולאחר מכן פעל פרוטוקול מפורט ב- 1.2 שלב.

  1. פעיל טעינה של פפטיד רצף לתוך H - 2Kb: Ig.
    1. להכין מאגרי הכרחי. הכן את המאגר דנטורציה על ידי ביצוע פתרון של 150 מ מ NaCl ו- 15 מ מ נה2CO3 במים יונים, ולאחר מכן התאמת רמת ה-pH ל 11.5. להכין מאגר renaturation על-ידי ביצוע פתרון של 250 מ מ טריס HCl במים יונים והזזת את ה-pH ל 6.8.
      הערה: בדרך כלל, זה ידרוש בערך 5 מ"ל של מאגרי דנטורציה והן renaturation של 1 מ ג של H - 2Kb: Ig.
    2. Denature H - 2Kb: Ig כדי לאפשר איגוד פפטיד משופרת. . תביא את H - 2Kb: Ig ריכוז בין 0.5-2 mg/mL בתמיסת באגירה פוספט (PBS). ואז לדלל את H - 2Kb: Ig כדי ריכוז סופי של 100-200 µg/mL עם נפח 5-10 מקבילות דנטורציה מאגר וגם תאפשר דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    3. להוסיף 50 טוחנת עודף של פפטיד רצף (בדרך כלל מניות פפטיד נשמרת ב- 1 מ מ ב-80 מעלות צלזיוס) H - 2 Kb: Ig פתרון.
      הערה: בדרך כלל פפטיד אנטיגנים יצטרכו להיות מומס בתוך לפחות 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולאחר מכן נוסף לאט PBS להישאר מסיסים. בהתאם רצף חומצות אמיניות, הכמות של דימתיל סולפוקסיד ייתכן שתצטרך להיות מוגברת.
    4. Renature H - 2Kb: Ig עם פפטיד. מיד לאחר התוספת של פפטיד, להביא את הפתרון pH של 7.4 על-ידי הוספת renaturation מאגר. לאפשר את הפתרון ינוטרלו תקופת דגירה של 48 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    5. להתרכז ולשטוף טעון-פפטיד H - 2Kb: Ig. ניצול concentrator צנטריפוגלי עם ניתוק משקל מולקולרי 50 kDa (MWCO), בצע את הוראות היצרן כדי לשטוף את טעון-פפטיד H - 2Kb: Ig פתרון 3 פעמים עם PBS, להתרכז כדי לפחות 1 מ"ג/מ"ל ולכמת את התרכזות ספקטרופוטומטרים.
  2. פעיל טעינה של פפטיד רצף לתוך H-2Db:Ig.
    1. להכין מאגרי הכרחי. הכן את המאגר דנטורציה על ידי ביצוע פתרון של חומצה ציטרית 131 מ מ 150 מ מ NaCl, 124 מ מ נה2HPO4 מים יונים, ולאחר מכן התאמת רמת ה-pH ל 6.5. להכין מאגר renaturation על-ידי ביצוע פתרון של 120 מ"מ טריס HCl במים יונים והזזת את ה-pH ל 8.8.
      הערה: בדרך כלל, זה ידרוש בערך 5 מ"ל של המאגר דנטורציה של 1 מ"ל של מאגר renaturation עבור 1 מ ג של H-2Db:Ig.
    2. Denature H-2Db:Ig כדי לאפשר איגוד פפטיד משופרת. . תביא את H-ריכוז 2Db:Ig ריכוז סופי של 0.5-2 מ"ג/מ"ל עם PBS. לאחר מכן, לדלל את H-2Db:Ig כדי ריכוז סופי של 100-200 µg/mL במקבילות נפח 5-10 דנטורציה המאגר.
    3. להוסיף 50 טוחנת עודף של פפטיד רצף (בדרך כלל מניות פפטיד נשמרת ב- 1 מ מ ב-80 מעלות צלזיוס) ה-2Db:Ig פתרון ולא מאפשרים תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף β2 microglobulin ו- renature H-2Db:Ig עם פפטיד. הוסף 2-fold טוחנת עודף של β2 microglobulin. לאחר מכן, להביא את הפתרון pH של 7.4 על-ידי הוספת renaturation מאגר. לאפשר פתרון ינוטרלו תקופת דגירה של 24 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    5. להתרכז ולשטוף טעון-פפטיד H-2Db:Ig. ניצול concentrator צנטריפוגלי עם kDa 50 MWCO, ההוראות של היצרן לשטוף את טעון-פפטיד H - 2 Kb: Ig פתרון 3 פעמים עם PBS, להתרכז כדי לפחות 1 מ"ג/מ"ל ולכמת התרכזות ספקטרופוטומטרים.

2. נזווג MHC-פפטיד מתחמי ומולקולות Co-Stimulatory אל פני השטח של חלקיקים מגנטיים כדי ליצור ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן הצגת תאים. להשתמש בשלוש שיטות שונות בהתאם גודל החלקיקים ויישום.

הערה: מספר טכניקות שונות יכול לשמש כדי נזווג את החלבונים אל פני השטח של החלקיקים. במסמך זה, מתוארים 3 גישות נפרדות: אמין מצופים חלקיקי (שלב 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-מצופה חלקיקי (שלב 2.2), אנטי-biotin מצופים חלקיקי (שלב 2.3). תהליכים אלה גם תוארו בפירוט בתוך המקטע שיטות של שני המסמכים שפורסמו6,7. ביצוע כל הצעדים ברדס fume אבטחה עם פתרונות סטרילי כדי לשמור על העקרות של חלקיקים aAPC מניות.

  1. המעיל אותות אנטיגן ספציפי, מופחתים כדי מצופים amine חלקיקים מגנטיים (איור 2). תהליך זה מתואר עבור 100 ננומטר, מצופים amine חלקיקים פאראמגנטי.
    הערה: פרוטוקולים מפורט עבור חיבור הנוגדן השטח של חלקיקים מצופה אמין ניתן למצוא https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, היכן Technote 201 מתאר איך כדי thiolate נוגדנים ואת המספר המשלים כדי maleimide functionalize חלקיקי, 202 מתארים את התהליך הדרוש כדי functionalize מצופים amine חלקיקים עם קבוצות פונקציונליות maleimide. הנה, רק שינויים קלים מודגשים MHC-איג, co-stimulatory אותות המצורפת החלקיקים.
    1. Thiolate הנוגדנים עם ריאגנט של Traut (Technote 201).
      1. הכינו 10 x PBS-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) מאגר (0.1 M PBS ו 100 מ מ- EDTA). להוסיף 10 x PBS-EDTA מאגר הנוגדנים בעשר: 1 יחס כדי למנוע החמצון של תיולים ללא תשלום נוסף את הנוגדנים.
      2. להוסיף 20 טוחנת עודף של ריאגנט של Traut (2-iminothiolane) הנוגדן, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב. למדוד את ריאגנט של Traut (אבקה יבשה) בתוך ברדס fume כימי כדי למנוע נשימה כפי הוא ממיר amine קבוצות קבוצות תיול.
      3. לשטוף ביסודיות עם 1 x מאגר PBS-EDTA 3 פעמים באמצעות רכז צנטריפוגלי kDa 50 MWCO, ואת ההוראות של היצרן, ריכוז עד נפח סופי של 500 µL. למדוד את ריכוז באמצעות פתרון נוגדן ספקטרופוטומטרים.
    2. להמיר את קבוצות פונקציונליות אמין על nanoparticle מגנטי קבוצות maleimide באמצעות sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ציקלוהקסאן-1-carboxylate (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. להוסיף 10 x PBS-EDTA מאגר הנוגדנים בעשר: 1 יחס עם החלקיקים.
      2. להמיס Sulfo-SMCC מים יונים, מערבולת כדי resuspend-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. למדוד את Sulfo-SMCC (אבקה יבשה) בתוך ברדס fume כימי כדי למנוע נשימה כפי הוא ממיר amine קבוצות קבוצות maleimide.
      3. הוסף nmol 0.016 של הפתרון Sulfo-SMCC עבור כל מילימטר מרובע שטח של החלקיקים. 1 מ ג של החלקיקים 100 ננומטר, להשתמש 0.3 מ ג של Sulfo-SMCC. אפשר להגיב על 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
      4. לשטוף את החלקיקים עם 1 x מאגר PBS-EDTA 3 פעמים באמצעות שדה מגנטי עם עמודה מגנטי, resuspend ב µL 500 1 x מאגר PBS-EDTA.
        הערה: אם באמצעות חלקיקים קטנים יותר 200 ננומטר, כגון החלקיקים 100 ננומטר המתוארים בזאת, קרוב לוודאי קבועים magnets לא יהיה חזק מספיק כדי למשוך את החלקיקים לכביסה או ריכוז מטרות. לפיכך, כדי לשטוף את החלקיקים קטנים יותר, להשתמש בעמודת מגנטי מורכב הספירות פרומגנטי כדי להגביר את השדה המגנטי.
    3. מגיבים maleimide functionalized חלקיקים עם נוגדנים thiolated (Technote 201).
      1. להוסיף את החלקיקים בקבוקון זכוכית נצנוץ להוסיף פס מערבבים מיני-מגנטית, מקום רק סנטימטר מעל צלחת מערבבים מגנטי, זירוז ערבוב מגנטי של הפתרון של חלקיקים.
      2. הפיתרון ערבוב, מוסיפים נוגדנים thiolated (0.5 מ ג של נוגדנים עבור כל 1 מ ג של חלקיקים) dropwise. אפשר להגיב ללילה בטמפרטורת החדר.
      3. לשטוף עם מאגר PBS 1 x 3 פעמים באמצעות שדה מגנטי, resuspend ב µL 500 ל- PBS 1 x. תווית ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.
        הערה: מקסימום יעילות ההטיה מתרחשת כאשר חלקיקים maleimide functionalized מעורבבים באופן מיידי עם חלבון thiolated.
  2. המעיל אותות אנטיגן ספציפי, מופחתים כדי מצופים NHS חלקיקים מגנטיים (איור 3). תהליך זה מתואר עבור 200 ננומטר, מצופים NHS חלקיקים פאראמגנטי.
    1. להכין את מאגר resuspension, מאגר שכבתה, מאגר אחסון. Resuspension שמאגר 25 מ מ 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) עם 0.01% Tween 20 מותאם pH 6.0. המאגר quenching היא פתרון 100 מ מ של טריס-HCl ב- pH 7.4. מאגר אחסון הוא פתרון של 10 מ מ PBS ו 0.01% Tween ב- pH 7.4.
    2. Resuspend החלקיקים lyophilized ב 1 מ"ל של מאגר resuspension. מערבולת נמרצות במשך 15 דקות לפחות עד אין אגרגטים גלויים.
    3. מניחים את החלקיקים המגנטיים על דוכן מגנטי כדי להסיר את תגובת שיקוע, resuspend 0.5 מ של מאגר resuspension, העברת בקבוקון זכוכית נצנוץ. מערבולת עד אין אגרגטים גלויים.
    4. הוסף 0.1 מ"ג חלבון הכולל לכל 1 מ ג של חלקיקים resuspended. מערבולת כדי לערבב להגיב בטמפרטורת החדר במשך 2.5 h תוך כדי ערבוב.
    5. להוסיף 0.1 מ"ל שהקשה מאגר ולהגיב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי ערבוב.
    6. מניחים את הצנצנת נצנוץ על דוכן מגנטי ולשטוף את החלקיקים. המתן עד תגובת שיקוע ברור כדי להסיר. להסיר את החלקיקים מן הדוכן מגנטי, להוסיף 1 מ"ל של מאגר resuspension, מערבולת עד אין אגרגטים גלויים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים, resuspend החלקיקים ב 1 מ"ל resuspension מאגר. אחסן את החלקיקים ב 4 ° C עד 6 חודשים.
  3. המעיל אותות אנטיגן ספציפי, מופחתים כדי מצופים על biotin אנטי חלקיקים מגנטיים (איור 4). תהליך זה מתואר עבור 50-100 ננומטר, האנטי-ביוטין חלקיקים פאראמגנטי.
    1. Biotinylate MHC-Ig או מולקולות co-stimulatory.
      1. התאם את ריכוז חלבון 0.5-2 mg/mL במאגר PBS. Resuspend sulfo-NHS-ביוטין-ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל מים יונים ולהוסיף 20-fold טוחנת נוגדן עודף כדי מופחתים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
      2. לשטוף ביסודיות עם PBS 3 פעמים באמצעות רכז צנטריפוגלי kDa 50 MWCO, בצע את ההוראות של היצרן, ריכוז עד נפח סופי של 500 µL. למדוד את הריכוז של הפתרון נוגדן באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    2. תרכיב biotinylated MHC-Ig ו/או אותות co-stimulatory אל האנטי-ביוטין חלקיקים. µL 500 מניות האנטי-ביוטין חלקיקים, להוסיף 0.5 nmol של נוגדן מופחתים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. רחץ חלקיקים aAPC מצומדת. כי החלקיקים הם קטנים יותר מאשר 200 ננומטר, רטוב עמודה מגנטי ולשים על דוכן מגנטי.
    4. הוסף את המתלים חלקיק/חלבון לעמודה. לאפשר החלבון/החלקיקים לחלוטין להזין את העמודה.
    5. לרחוץ על-ידי הוספת 0.5 מ של PBS שלוש פעמים העמודה.
    6. Elute על ידי הסרת העמודה מדוכן מגנטי, הוספת 0.5 מ של PBS לעמודה באמצעות הבוכנה, יחשוף aAPCs חלקיקים לתוך בקבוקון זכוכית נצנוץ. חנות חלקיקים ב 4 ° C עד 6 חודשים.
      הערה: חלקיקים יציבים ב 4 ° C (כדאי לא להיות קפוא) עד 6 חודשים. טמפרטורות גבוהות יותר להקטין את הפונקציונליות של החלקיקים, כמה אגרגציה נצפו (נתונים לא מוצג). לא לשמור בטמפרטורת החדר במשך פרקי זמן ארוכים כמו זה מקטין באופן משמעותי את חיי המדף של החלקיקים.

3. לאפיין את התוכן חלבונים מלאכותיים אנטיגן הצגת תא חלקיקים באמצעות זיהוי נוגדנים פלורסנט.

הערה: זה בקרת איכות שימושי של אנטיגן מלאכותי המיוצר הצגת תאים. בנוסף, כמות אותות מופחתים משמש לייצור aAPC המקביל מינונים על פני קבוצות וסוגים שונים aAPC (למשל., בגדלים שונים).

  1. מודדים את ריכוז החלקיקים aAPCs מצופה.
    1. השתמש unconjugated חלקיקים מהפתרון מניות ולהפוך טיטור במינון של 1:2 בפתרון של PBS על פני צלחת שהונעו 96-ובכן תרביות רקמה עם µL 100 לכל טוב.
    2. לקרוא את החלקיקים על ספקטרופוטומטרים צלחת-קריאה-405 ננומטר כדי ליצור עיקול רגיל של ריכוז החלקיקים הידועים.
    3. לקחת דגימה של aAPCs מצומדת, לדלל ב- PBS את הנפח הכולל של 100 µL ולקרוא על ספקטרופוטומטרים.
  2. הסר מדגם של aAPCs מפוברק, כתם עם נוגדנים פלורסנט.
    1. כדי לחשב כמה הדגימה כדי להסיר, להעריך את מספר נוגדנים על פני השטח של החלקיק.
      הערה: עבור שיטות אלה, נניח צפיפות של נוגדנים/מיקרומטר בסביבות 10002 של החלקיקים שטח. כדי להיות מסוגל לזהות את פלורסצנטיות, זה דורש כ- 1011 MHC-Ig או מולקולות CD28 הכולל לכל מבחן פלורסנט.
    2. להביא את הנפח הכולל של aAPCs עד 100 µL ב- PBS, להוסיף את הנוגדנים מכתימים לדילול מטריים, תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: דוגמה נוגדנים משתמשים בהצלחה הם FITC מצומדת עכבר עכבר-אנטי איג λ1, λ2, שרשרת אור λ3, שיבוט R26 46 לזהות MHC-Ig, ועכבר FITC מצומדת אנטי-ארמני/סורית אוגר IgG, לשבט G192-1, כדי לזהות אנטי-העכבר CD28.
  3. לשטוף את החלקיקים ולקרוא את זריחה על קורא צלחת פלורסנט.
    1. דיסקות לשטוף (כפי שמתואר בשלב 2) שברים מוכתמים aAPC שלוש פעמים עם 0.5 מ של PBS.
    2. Elute את aAPCs שטוף עם 0.5 מ של PBS.
    3. להוסיף 100 µL של aAPCs eluted צלחת שהונעו 96-ובכן לקרוא את הריכוז באמצעות את ספיגת כמו שלב 3.1.
    4. . קח את µL 400 הנותרים, התחלקו 200 שני µL aliquots ומוסיפים שתי בארות בצלחת שחור, פוליסטירן 96-ובכן, שהונעו. Titrate ביחס של 1:2 את הצלחת על-ידי לקיחת µL 100 של הפתרון ערבוב עם הבאר הבאה כי יש µL 100 ל- PBS בכל אחד לפחות ארבע פעמים.
      הערה: מספר ממוצע משכפל המדידה כדי להפחית את הרעש במדידה.
    5. בלוח 96-ובכן באותו השחור, תעשה סיבוב סטנדרטי של הנוגדן פלורסנט נהגה כתם, על-ידי הוספתו ב 1:200 בבאר עם 200 µL של PBS, titrating למטה ביחס 1:2 לפחות 12-וולס
    6. לאחר aAPC והן פלורסנט נוגדנים הם על הצלחת, לקרוא את הצלחת עם קורא צלחת פלורסנט.
  4. לחשב את כמות החלבונים לכל החלקיקים. לקבוע את הריכוז של נוגדנים על ידי השוואת הערכים, עיקול רגיל, שבו ריכוז נוגדן ידוע, בהנחה יחס 1:1 של צביעת נוגדן ל זיהה נוגדן. אז חלוקת בריכוז זה של נוגדנים שזוהו עם ריכוז החלקיקים נקבעים על-ידי ספיגת וזמינותו ייתן את מספר נוגדנים לכל החלקיקים.

4. להעשיר אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים עם אנטיגן מלאכותי Nanoparticle מוכן הצגת תאים.

  1. בידוד תאי CD8 + T.
    1. המתת חסד החיות על ידי חשיפה לאיזופלוריין ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. הסר את הטחול ואת בלוטות הלימפה wildtype C57BL/6j עכברים ולמקם אותם בפתרון של PBS. Macerate האברים, elute את התאים דרך סטרילי 70 מיקרומטר תא מסננת עם שוטף תכופים של PBS.
    3. לחסל תאים שאינם CD8 + - T, השתמש ערכת בידוד תאי CD8 + T ללא מגע ופעל לפי הוראות היצרן.
      הערה: כל תנאי אנטיגן דורש לפחות 3 x 106 CD8 + T תאים.
  2. הוסף את aAPCs nanoparticle כדי לאגד התאים CD8 + T.
    1. בעקבות הבידוד, להתרכז לאמצעי אחסון של µL 100 ב- PBS עם 0.5% אלבומין שור (BSA) ו- 2 מ מ EDTA.
    2. לקבוע את המספר של aAPCs כדי להוסיף על-ידי חישוב המבוסס על היחס של 1011 מאוגד aAPC, פפטיד-נטען MHC-Ig עבור כל 106 CD8 + T תאים.
    3. דגירה חלקיקים aAPC ולהסתובב CD8 + T תאים עבור h 1 ב 4 ° C עם ערבוב מתמיד בפוליסטירן סטרילי מ של הרכבת התחתית התחתונה.
  3. להכין מדיה שהושלם פקטורי גדילה תא T (TCGF) elute, התרבות תאי CD8 + T.
    1. עבור מדיה שהושלם, תוספת מלאה RPMI 1640 מדיה (עם גלוטמין) עם 1 x חומצות אמינו שאינן הכרחיות, 1 מ מ נתרן פירובט, 0.4 x ויטמין פתרון, 92 מיקרומטר מרקפטואתנול, 10 מיקרומטר ציפרופלוקסאצין ו 10% סרום שור עוברית (FBS).
    2. כדי להפוך את TCGF, בצע את הפרוטוקולים כבר הוקמה, המופנה כאן9.
      הערה: TCGF היא מקוקטייל הבית של ציטוקינים מערכת החיסון האנושית שהיא הכרחית כדי לספק אותות לגירוי נוסף הדרוש כדי לגדל תאי T. TCGF יכול להירכש בעד ציטוקינים מופחתים תא T ידועות כגון il-2, IL-7, או IL-15; עם זאת, כל אחד עשוי polarize התגובה תא T בהתאם. פרוטוקול המתוארים בזאת לא הותאם עם קוקטיילים אלה; לכן טכניקות אחרות יש להתייעץ עם ריכוזים, שילובים אם TCGF לא נעשה שימוש בדוגמאות המפורטות10,11.
  4. רוחצים את להעשיר aAPC ו CD8 + T תאים תערובת.
    1. לשטוף את aAPCs חלקיקים מגנטיים כפי שמתואר בשלב 2. עם זאת, לשטוף תחילה באמצעות המאגר הציבורי עם EDTA BSA ו- 2 מ מ 0.5% באמצעות השניה בתוספת מדיה, באמצעות השלישי בתוספת מדיה עם 1% TCGF.
    2. Elute aAPCs ותאי CD8 + T מועשר ב- 500 µL של המדיה שהושלם עם 1% TCGF.
    3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת, צלחת עם תחתית U 96 ב µL 160 לכל טוב של המדיה שהושלם עם 1% TCGF-ריכוז של 2.5 x 105 CD8 + T תאים למ"ל.
    4. אם לבודד באמצעות aAPCs עם רק פפטיד-טעון MHC-Ig על פני השטח (אין אותות co-stimulatory), 4.5 שלב ואז להשלים. אם לבודד באמצעות aAPCs עם שני נטען-פפטיד MHC-Ig על האותות משטח, co-stimulatory, לאחר מכן המשך בשלב 5.
  5. הוסף את החלקיקים מגנטי מצופה אותות co-stimulatory על פני השטח את השבר מועשר והוסף שדה מגנטי כדי שיתוף אשכול את האותות מופחתים על פני השטח של תאי T.
    1. כדי שברים מועשר, הוסף של equimolar (או גדול בהתאם היישום-ראה סעיף על מאפייני aAPC כדי לשלוט) של נוגדן מופחתים למספר טעון-פפטיד MHC-Ig על החלקיק.
    2. לאפשר co-stimulatory חלקיקים מגנטיים לאגד מועשר CD8 + T תאים עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף שדה מגנטי על-ידי הצבת לצלחת תרבות בין שני דיסקים N52 נאודימיום מגנטים של 1.9 ס מ (0.75 אינץ ') אורך.
      הערה: מגנטים דיסק N52 יש שדה חזק מאוד. כדאי לשים לב גם לאחסן אותם עם מפרידי בין מגנטים, גם ככה קשה להסיר אחד מהשני, וכאשר לשים אותם על לוחות תרבות. כדי למזער את המגנטים מפני את מרכיבי החממה מתכת, למקם אותם במיכלים 50 מ ל צינור חרוטי קלקר על התחתון והן העליון.

5. הרחב ' מזהה אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים עם אנטיגן מלאכותי Nanoparticle מוכן הצגת תאים.

  1. להוסיף 96 להטלטל U טוב לצלחת עם aAPCs ותאי CD8 + T % 5 humidified CO2, חממה 37 º C למשך 3 ימים. ביום 3, להאכיל את התאים עם 80 µL לכל טוב של מדיה שהושלם עם 2% TCGF והמקום בחזרה לתוך החממה עד ליום 7.
  2. ביום 7, לקצור את התאים מאולצת לתוך mL 5 סיבוב התחתית התחתונה עבור ספירה.
  3. כל פעם פתרון האיסוף, ספין למטה לתאים שנקטפו resuspend ב 0.5 מ של PBS עם אזיד הנתרן 0.05% ו-2% FBS. ספירת התאים קיימא על ידי צביעת עם trypan blue סומכים על hemocytometer.
  4. להסיר תאים שנספרו 50,000-500,000 לתוך שני חדש מ ל סביב צינורות התחתונה עבור צביעת אנטיגן ספציפי. שפופרת אחת תשמש עבור הכתם פפטיד cognate-MHC, הצינור השני ישמש עבור הכתם הלא-cognate כדי לקבוע רקע מכתים.
  5. להוסיף 1 µg של biotinylated (שימוש בטכניקה המתוארת בשלב 2) MHC-Ig cognate בהתאמה, צינורות ללא cognate µL 100 ל- PBS עם אזיד הנתרן 0.05% ו-2% FBS עם allophycocyanin (APC)-עכברוש מצומדת העכבר אנטי CD8a, שיבוט 53-6.7 (יחס דילול של 1: 100) עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  6. להוסיף streptavidin משני ולחיות הכתם מת. לשטוף biotinylated עודף MHC-Ig עם PBS באמצעות צנטריפוגה. ואז מכתים כל הדגימות עם יחס 1:350 של phycoerythrin (PE)-שכותרתו היחס streptavidin ו- 1:1000 של כתם תא מתה ירוק ניתן לתיקון חי/מת למשך 15 דקות ב 4 º C.
  7. קרא כל דוגמאות על cytometer זרימה כדי לקבוע יחודיות ומספר תאים אנטיגן ספציפי.
    1. לשטוף משני עודף, חיים/מתים כתם על ידי צנטריפוגה, resuspend עם µL 150 PBS מאגר עם אזיד הנתרן 0.05% ו-2% FBS לקרוא על cytometer זרימה.
  8. לקבוע את המספר ואת אחוז תאים אנטיגן ספציפי עם תוכנת ניתוח נתונים.
    1. כדי לקבוע את אחוז תאים אנטיגן ספציפי, השתמש השערים הבאים בשידור חי + הזמנה בהתאמה, לימפוציט + (קדמי פיזור על ידי פיזור בצד), CD8 + ולאחר דיימר +. לקבוע את השער דיימר + על-ידי השוואת את הלא-cognate על הכתם cognate.
    2. לקבוע את אחוזי תאים אנטיגן ספציפי דגימה על-ידי חיסור האחוז של דיימר + של הכתם MHC-Ig cognate מן הכתם MHC-Ig הלא-cognate.
    3. באמצעות אחוז זה של תאים אנטיגן ספציפי, הכפל אותו ב מספר התאים נספרים, מניב את מספר התאים אנטיגן ספציפי, הנובעת מן העשרה הרחבה.
      הערה: פיצוי יצטרך שישדכו את הזרימה cytometer מכיוון שאין חפיפה ספקטרלי עם fluorophores להשתמש בחלונית זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להשלים מוצלחת העשרה והרחבה של תאי T אנטיגן ספציפי, טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory בהצלחה להצמיד את החלקיקים aAPC. המבוסס על שיטות 3 של חלקיקים המצורף, אנו מספקים חלק מהנתונים נציג תוצאה הליך ההטיה מוצלחת (איור 5a). אכן, אם ליגנד צפיפות נמוכה מדי, ואז לא יה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יצרנו טכנולוגיה בידוד תא T אנטיגן ספציפי רומן המבוסס על ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). ננו-חלקיק aAPCs יש פפטיד-טעון MHC על פני השטח המאפשר תא T אנטיגן ספציפי קשירה והפעלה לצד הפעלת co-stimulatory. aAPCs גם הם פאראמגנטיים ולאחר ולכן יכול לשמש כדי להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי נדיר, באמצעות שדה מג?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים את interest(s) הפיננסיים מתחרים הבאים: תחת הסכם רישוי בין NexImmune אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, ג'ונתן Schneck זכאי נתח של תמלוגים התקבל על-ידי האוניברסיטה על מכירות של מוצרים המתוארת בעלון זה מאמר. הוא היה גם מייסד NexImmune, בעל מניות בחברה. הוא מכהן כחבר מועצת המנהלים של NexImmune ו המדעית המייעצת. התנאים של הסדרים אלו יש כבר נבדקו ואושרו על-ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס מדיניותה ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

J.W.H. תודה מרכז ההדרכה ננוטכנולוגיה של סרטן NIH במכון ג'ונס הופקינס ביוננוטכנולוגיה הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה (DGE-1232825), קרן קשתות לקבלת מלגת תמיכה. עבודה זו מומן על ידי תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), יוזמה וחדשנות TEDCO/מרילנד, את קולטר קרן והאמון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149(2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572(2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141TTTNeoantigenimmunoengineering

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved