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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Antigen-spezifische T-Zellen sind schwer zu charakterisieren oder Therapien aufgrund ihrer extrem niedrigen Frequenzen zu nutzen. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine magnetische Partikel zu entwickeln, die zur antigenspezifischen T-Zellen binden können, um diese Zellen zu bereichern und dann erweitern sie mehrere hundertfachen zur Charakterisierung und Therapie.

Zusammenfassung

Wir haben ein Werkzeug, um sowohl bereichern und erweitern antigenspezifischen T-Zellen entwickelt. Dies ist hilfreich in Fällen wie z. B. A) erkennen die Existenz von antigenspezifischen T-Zellen, B) Fühler die Dynamik der Antigen-spezifische Antworten, (C) verstehen wie Antigen-spezifische Reaktionen Krankheitszustand z. B. Autoimmunität beeinflussen, (D) entmystifizieren heterogenen Antworten für Antigen-spezifische T-Zellen, oder E) nutzen Antigen-spezifische Zellen für die Therapie. Das Tool basiert auf einem magnetischen Teilchen, dass wir konjugieren Antigen-spezifische und T-Zell co-stimulatory Signale und wir als künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) bezeichnen. Folglich, da die Technologie einfach herzustellen ist, kann es leicht von anderen Labors angenommen werden; Somit ist unser Ziel hier detailliert zu beschreiben, die Fertigung und die anschließende Nutzung der aAPCs. Wir erklären wie man Antigen-spezifische und co-stimulatory Signale an den aAPCs befestigen, wie man sie zu bereichern für Antigen-spezifische T-Zellen nutzen und wie Sie Antigen-spezifische T-Zellen zu erweitern. Darüber hinaus beleuchten wir Konstruktion Überlegungen anhand von experimentellen und biologische Informationen unserer Erfahrung mit Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen.

Einleitung

Mit dem Aufstieg von vielen Immuntherapien muss man zu charakterisieren und Immunreaktionen Steuern zu können. Insbesondere ist die adaptive Immunantwort von Interesse wegen der Besonderheit und der Lebensdauer der Zellen. Vor kurzem, haben Chimären-Antigen-Rezeptor-T-Zell-Therapien für die Krebstherapie zugelassen sind; Allerdings basieren die Antigen-Rezeptoren aus gemeinsamen Zelle Oberflächenantigen CD19, anstatt die Antigene spezifisch für die Krebs-1. Darüber hinaus die Besonderheit können Immuntherapien auch der Mangel an Kontrolle und begrenzten Verständnis der dynamischen Immunantwort in Krebs oder Autoimmunität leiden.

Eine der Herausforderungen des Studiums Antigen-spezifische Reaktionen ist ihre extrem niedrigen Frequenzen, z. B.., Antigen-spezifische T-Zellen sind 1 von jeden 104 106 T Zellen2,3. So untersuchen die T-Zellen vorhanden sind oder als Reaktion, die Zellen bereichert und erweitert werden, oder ihr Signal müssen verstärkt werden. Es ist teuer und schwer zu pflegen die Feeder-Zellen mit aktuellen Techniken, die sich auf den Ausbau der Antigen-spezifische Zellen. Aktuelle Techniken, die im Fokus verstärkt das Signal des Antigen-spezifische T-Zellen, wie die Enzym-linked Immunospot (ELISPOT) assay, der Wiederverwendung von den T Zellen4zu begrenzen. Zu guter Letzt wegen geringer Sensitivität oft diese beiden Techniken für die Antigen-spezifische Aufzählung kombiniert werden müssen.

Um diese Probleme anzugehen, haben wir die magnetische Nanopartikel basierende künstliche Antigen präsentierenden Zelle (aAPC)5,6,7,8entwickelt. Die aAPC kann mit einem Antigen-spezifische Signalpeptid geladenen großen Histocompatibility Komplex (pMHC)- und co-stimulatory Molekülen - funktionalisiert werdenzB., Antikörpers Anti-CD28-beide bereichern antigenspezifischen T-Zellen und dann anschließend stimulieren Sie ihre Expansion (Abbildung 1). Die Partikel können somit eine kostengünstige handelsübliche Produkt sein, das können sowohl Antigen-spezifische Stimulationen angepasst noch standardisiert über Experimente und Patienten. Durchführung der Bereicherung und Erweiterung Ergebnisse in Hunderte bis Tausende-Fach Ausbau der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu verarbeiten und kann dazu führen, dass die Frequenzen bis zu 60 Prozent nach nur einer Woche, damit die Charakterisierung oder therapeutischen Einsatz der großen Anzahl der Zellen. Hierin, wir beschreiben, wie Nanopartikel aAPCs, einige kritische Überlegungen bei der Auswahl der Eigenschaften der Nanopartikel, machen und zeigen einige typische Ergebnisse von der Verwendung dieser Partikel zu isolieren und Ausbau seltene Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen.

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Protokoll

Alle Mäuse wurden entsprechend den Richtlinien von der Johns Hopkins University Institutional Review Board genehmigt beibehalten.

1. Legen Sie dimeres Major Histocompatibility Complex Immunglobulin Schmelzverfahren Protein (MHC-Ig) mit gewünschten Antigen Peptidsequenz.

Hinweis: Wenn H - 2 Kb verwenden: Ig, dann folgen das Protokoll detailliert Schritt 1.1; Wenn H-2Db:Ig, dann folgen das Protokoll detailliert Schritt 1.2.

  1. Aktive Belastung der Peptidsequenz in H - 2Kb: Ig.
    1. Bereiten Sie die notwendigen Puffer. Bereiten Sie die Denaturierung Puffer durch eine Lösung von 150 mM NaCl und 15mM Na2CO3 in entionisiertem Wasser und dann einstellen des pH-Werts 11,5. Bereiten Sie die Renaturierung Puffer durch eine Lösung von 250 mM Tris-HCl in entionisiertem Wasser und den pH-Wert auf 6,8.
      Anmerkung: In der Regel benötigen sie ca. 5 mL der Denaturierung und Renaturierung Puffer für 1 mg H - 2Kb: Ig.
    2. H - 2Kb denaturieren: Ig verbesserte Peptid-Bindung zu ermöglichen. Bringen Sie die H - 2Kb: Ig Konzentration zwischen 0,5-2 mg/mL mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Verdünnen Sie die H - 2Kb: Ig, eine Endkonzentration von 100-200 µg/mL mit 5-10-bändige Äquivalente der Denaturierung Puffern und lassen Sie Sie bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    3. Fügen Sie 50 Molaren Überschuss des Peptids Sequenz (in der Regel Lager Peptid bleibt bei 1 mM bei-80 ° C), H - 2 Kb: Ig Lösung.
      Hinweis: In der Regel Peptid-Antigene müssen aufgelöst werden, innerhalb von mindestens 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und dann langsam auf PBS wasserlöslich bleiben. Je nach der Aminosäure-Sequenz müssen der Betrag von DMSO erhöht werden.
    4. Renaturierung H - 2Kb: Ig mit Peptid. Sofort nach dem Hinzufügen des Peptids, bringen die Lösung einen pH-Wert von 7,4 durch Zugabe von Renaturierung Puffer. Lassen Sie die neutralisierte Lösung für 48 h bei 4 ° c inkubieren
    5. Konzentrieren und waschen Peptid geladen H - 2Kb: Ig unter Verwendung eines Kreiselpumpen Konzentrators mit einem 50 kDa Molekulargewicht Cut-Off (MWCO), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die Peptid geladen H - 2 Kb zu waschen: Ig Lösung 3 Mal mit PBS, zu konzentrieren, um mindestens 1 mg/mL und die Konzentration auf einem Spektrophotometer zu quantifizieren.
  2. Aktive Belastung der Peptidsequenz in H-2Db:Ig.
    1. Bereiten Sie die notwendigen Puffer. Bereiten Sie die Denaturierung Puffer durch eine Lösung von Zitronensäure 131 mM, 150 mM NaCl und 124 mM Na2HPO4 in entionisiertem Wasser und dann durch Anpassen des pH-Werts bis 6,5. Bereiten Sie die Renaturierung Puffer durch eine Lösung von 120 mM Tris-HCl in entionisiertem Wasser und Einstellen des pH-Werts um 8,8.
      Anmerkung: In der Regel benötigen sie ca. 5 mL des Puffers Denaturierung und 1 mL des Puffers Renaturierung für 1 mg H-2Db:Ig.
    2. Denaturieren H-2Db:Ig verbesserte Peptid-Bindung zu ermöglichen. Bringen Sie die H-Konzentration, 2Db:Ig um eine Endkonzentration von 0,5-2 mg/mL mit PBS. Verdünnen Sie dann die H-2Db:Ig, eine Endkonzentration von 100-200 µg/mL mit 5-10 Volumen Äquivalente der Denaturierung Puffer.
    3. Fügen Sie 50 Molaren Überschuss des Peptids Sequenz (in der Regel Lager Peptid bleibt bei 1 mM bei-80 ° C) auf die H-2Db:Ig Lösung und lassen Sie Sie für 1 h bei 37 ° c inkubieren
    4. Hinzufügen von β2-Mikroglobulin und Renaturierung H-2Db:Ig mit Peptid. Fügen Sie 2-fold Molaren Überschuss von β2-Mikroglobulin. Dann bringen Sie die Lösung einen pH-Wert von 7,4 durch Zugabe von Renaturierung Puffer. Lassen Sie die neutralisierte Lösung für 24 Stunden bei 4 ° c inkubieren
    5. Konzentrieren und waschen Peptid geladen H-2Db:Ig. unter Verwendung eines Kreiselpumpen Konzentrators mit einem 50 kDa MWCO, folgen den Anweisungen des Herstellers, die Peptid geladen H - 2 Kb zu waschen: Ig Lösung 3 Mal mit PBS, konzentrieren sich auf mindestens 1 mg/mL und quantifizieren der Konzentration auf einem Spektrophotometer.

(2) konjugieren Sie MHC-Peptid-komplexe und Co-Stimulatory Moleküle auf der Oberfläche der magnetische Nanopartikel Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen bilden. Verwenden Sie eine von drei verschiedenen Methoden je nach Partikelgröße und Anwendung.

Hinweis: Eine Reihe von verschiedenen Techniken kann verwendet werden, die Proteine auf der Oberfläche der Partikel zu konjugieren. Hier sind 3 getrennte Ansätze beschrieben: Amin-beschichteten Partikel (Schritt 2.1), N-Hydroxysuccinimide (NHS)-beschichteten Partikel (Schritt 2.2) und anti-biotin-beschichteten Partikel (Schritt 2.3). Diese Prozesse wurden auch im Detail im Methodenabschnitt in zwei Zeitungen veröffentlichten6,7beschrieben. Führen Sie alle Schritte in einem Biosafety-Abzug mit sterilen Lösungen für die Sterilität der Lager aAPC Partikel zu erhalten.

  1. Mantel Antigen-spezifische und stimulierende Signale zu Amin-beschichtete magnetische Partikel (Abbildung 2). Diesen Prozess bezeichnet man für 100 nm, Amin-beschichtete superparamagnetischen Nanopartikeln.
    Hinweis: Ausführliche Protokolle zur Befestigung des Antikörpers auf der Oberfläche ein Amin beschichteten Teilchen finden Sie unter https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, wo beschreibt Technote 201 wie funktionalisieren, Thiolate Antikörper und Konjugat, maleimide Partikel und 202 beschreiben den Prozess musste Amin-beschichteten Partikeln mit Maleimide funktionellen Gruppen zu funktionalisieren. Hier sind nur geringfügige Änderungen für die MHC-Ig und co-stimulatory Signale angebracht, diese Partikel hervorgehoben.
    1. Thiolate die Antikörper mit Traut Reagenz (Technote 201).
      1. Bereiten Sie ein 10 x PBS-Ethylenediaminetetraacetic-Säure (EDTA)-Puffer (0,1 M PBS und 100 mM EDTA). Fügen Sie 10 x PBS-EDTA Puffer an die Antikörper an ein 01:10 Verhältnis, die Oxidation von freien Thiole hinzugefügt, um die Antikörper zu verhindern.
      2. Der Antikörper 20 Molaren Überschuss an Traut Reagenz (2-Iminothiolane) hinzu und inkubieren Sie für 2 h bei Raumtemperatur mit dem mischen. Messen Sie die Traut Reagenz (Trockenpulver) innerhalb einer chemischen Abzugshaube, Atmung zu vermeiden, da es Amin Gruppen zu Thiol-Gruppen umgewandelt.
      3. Mit 1 x PBS-EDTA Puffer 3 Mal mit einem zentrifugalen Konzentrator mit einer 50 kDa MWCO gründlich waschen, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, Konzentration, bis ein Endvolumen von 500 µL. messen die Konzentration der Antikörper-Lösung mit einem Spektrophotometer.
    2. Konvertieren Sie die Amin-Funktionsgruppen auf die magnetische Nanopartikel in Maleimide Gruppen mit Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. Fügen Sie 10 x PBS-EDTA Puffer an die Antikörper an ein 01:10 Verhältnis zu den Partikeln.
      2. Lösen Sie Sulfo-SMCC in entionisiertem Wasser und Wirbel, bei einer Konzentration von 1 mg/mL Aufschwemmen auf. Messen Sie die Sulfo-SMCC (Trockenpulver) innerhalb einer chemischen Abzugshaube, Atmung zu vermeiden, da es Amin Gruppen zu Maleimide Gruppen umgewandelt.
      3. 0,016 Nmol Sulfo-SMCC-Lösung für jeden Quadratmillimeter Fläche der Partikel hinzufügen. Verwenden Sie für 1 mg 100 nm Partikel 0,3 mg Sulfo-SMCC. 1,5 h bei Raumtemperatur einwirken lassen.
      4. Die Teilchen mit 1 x PBS-EDTA Puffer 3 Mal mit einem Magnetfeld mit einer magnetischen Spalte Waschen und in 500 µL 1 x PBS-EDTA Puffer aufzuwirbeln.
        Hinweis: Wenn Partikel kleiner als 200 nm, wie hier beschrieben die 100 nm Partikel am ehesten Permanentmagnete werden nicht stark genug, um die Partikel zum Waschen oder Konzentration Zwecke zu ziehen. So um die kleineren Teilchen zu waschen, verwenden Sie eine magnetische Spalte bestehend aus ferromagnetischen Kugeln, um das Magnetfeld zu verstärken.
    3. Maleimide funktionalisiert Teilchen mit Thiolated Antikörper (Technote 201) reagieren.
      1. Eine Glasflasche funkeln fügen Sie die Partikel hinzu, fügen Sie eine Mini-magnetische Stir Bar platzieren Sie nur einen Zoll über eine magnetische rühren Platte zu und induzieren Sie, magnetische Mischen der Partikel-Lösung.
      2. Mixing-Lösung tropfenweise fügen Sie Thiolated Antikörper (0,5 mg des Antikörpers für jeden 1 mg Partikel hinzu). Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur zu reagieren.
      3. Waschen mit 1 X PBS-Puffer 3 Mal mit einem magnetischen Feld und in 500 µL 1 X PBS aufzuwirbeln. Beschriften und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern.
        Hinweis: Maximale Effizienz Konjugation tritt auf, wenn Maleimide funktionalisiert Teilchen sofort mit Thiolated Eiweiß vermischt werden.
  2. Mantel Antigen-spezifische und stimulierende Signale an NHS-beschichtete magnetische Partikel (Abbildung 3). Diesen Prozess bezeichnet man für 200 nm, NHS-beschichtete superparamagnetischen Nanopartikeln.
    1. Bereiten Sie die Wiederfreisetzung Puffer, abschrecken Puffer- und Puffer speichern. Die Wiederfreisetzung Puffer ist 25 mM 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) mit 0,01 % Tween 20 bis pH 6.0 angepasst. Der abschrecken Puffer ist eine 100 mM-Lösung von Tris-HCl bei pH 7,4. Der Speicher-Puffer ist eine Lösung aus 10 mM PBS und 0,01 % Tween bei pH 7,4.
    2. Die gefriergetrockneten Teilchen in 1 mL des Puffers Wiederfreisetzung aufzuwirbeln. Vortex kräftig für mindestens 15 Minuten bis keine Aggregate sichtbar sind.
    3. Legen Sie die Magnetpartikel auf Magnetstativ zu entfernen den Überstand, mit 0,5 mL Wiederfreisetzung Puffer und Transfer zu einem Glas funkeln Fläschchen Aufschwemmen. Wirbel, bis keine Aggregate sichtbar sind.
    4. 0,1 mg Gesamt-Protein pro 1 mg aufgewirbelten Partikel hinzufügen. Vortex mischen und reagieren bei Raumtemperatur für 2,5 h beim Mischen.
    5. 0,1 mL Puffer zu stillen und reagieren bei Raumtemperatur für 30 min beim Mischen.
    6. Legen Sie das Funkeln-Fläschchen auf ein Magnetstativ und waschen Sie die Partikel. Warten Sie, bis der Überstand klar zu entfernen ist. Entfernen Sie die Partikel aus dem Magnetstativ, fügen Sie 1 mL Wiederfreisetzung Puffer und Wirbel, bis keine Aggregate sichtbar sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal und Aufschwemmen der Teilchen in 1 mL Wiederfreisetzung Puffer. Speichern Sie die Partikel bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten.
  3. Mantel Antigen-spezifische und stimulierende Signale zur anti-biotin-beschichtete magnetische Partikel (Abbildung 4). Dieser Prozess wird für 50-100 nm, Anti-Biotin superparamagnetischen Nanopartikeln beschrieben.
    1. Biotinylate MHC-Ig oder co-stimulatory Moleküle.
      1. Passen Sie die Proteinkonzentration, 0,5-2 mg/mL in PBS-Puffer. Aufschwemmen Sie Sulfo-NHS-Biotin in einer Konzentration von 10 mg/mL in entionisiertem Wasser und fügen Sie 20-fold Molaren Überschuss zu stimulierende Antikörper. Bei Raumtemperatur für 45 min inkubieren.
      2. Gründlich waschen mit PBS 3 Mal mit einem zentrifugalen Konzentrator mit einer 50 kDa MWCO, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, Konzentration, bis ein Endvolumen von 500 µL. messen die Konzentration der Antikörper-Lösung mit einem Spektralphotometer.
    2. Konjugat biotinylierte MHC-Ig und/oder co-stimulatory Signale zu Anti-Biotin Nanopartikel. Für 500 µL Lager Anti-Biotin Partikel 0,5 Nmol stimulierende Antikörper hinzufügen und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
    3. Waschen Sie konjugierte aAPC Nanopartikel. Da diese Teilchen kleiner als 200 sind nm, eine magnetische Spalte nass und legte auf einem Magnetstativ.
    4. Die Spalte die Partikel/Protein-Suspension hinzufügen. Können Sie die Protein/Partikel vollständig die Spalte eingeben.
    5. Waschen Sie durch Zugabe von 0,5 mL PBS dreimal auf die Spalte.
    6. Durch Entfernen der Spalte aus der Magnetstativ, 0,5 mL PBS zu der Spalte hinzufügen und verwenden den Kolben, Ausspülung der Partikel-aAPCs in ein Glas funkeln Fläschchen eluieren. Shop-Partikel bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten.
      Hinweis: Partikel sind für bis zu 6 Monaten stabil bei 4 ° C (sollte nicht gefroren). Höhere Temperaturen reduzieren die Funktionalität der Teilchen und einige Partikel Aggregation eingehalten worden (Daten nicht gezeigt). Halten Sie nicht bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum hinweg wie dies deutlich die Haltbarkeit der Partikel verringert.

(3) charakterisieren Sie den Eiweißgehalt auf künstliche antigenpräsentierende Zellen Nanopartikel mit fluoreszierenden Antikörpernachweis.

Hinweis: Dies ist eine nützliche Qualitätskontrolle der hergestellten künstlichen antigenpräsentierende Zellen. Auch die Höhe der stimulierende Signal wird verwendet, um gleichwertige aAPC Dosen in Chargen und verschiedene aAPC zu produzieren (z.B.., verschiedene Größen).

  1. Messen Sie die Partikelkonzentration der beschichteten aAPCs.
    1. Verwenden Sie unconjugated Partikel aus der Stammlösung und machen Sie eine Dosistitration 1:2 in einer Lösung von PBS über eine 96-Well mit flachem Boden Gewebekultur-Platte mit 100 µL pro Bohrloch.
    2. Lesen Sie die Partikel auf einem Teller-Lesung-Spektralphotometer bei 405 nm eine Standardkurve aus einem bekannten Partikelkonzentration zu erstellen.
    3. Nehmen Sie eine Probe von der konjugierten aAPCs, verdünnen mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 µL und lesen das Spektrophotometer.
  2. Entfernen einer Stichprobe von vorgefertigten aAPCs und Flecken mit fluoreszierenden Antikörpern.
    1. Um zu berechnen wieviel Probe zu entfernen, schätzen die Zahl der Antikörper auf der Oberfläche des Partikels.
      Hinweis: Für diese Techniken, die übernehmen Sie eine Dichte von rund 1000 Antikörper/µm2 Teilchen Fläche. Um die Fluoreszenz erkennen zu können, bedarf es etwa 1011 MHC-Ig oder CD28 Moleküle pro fluoreszierende Test.
    2. Bringen Sie das Gesamtvolumen des aAPCs bis zu 100 µL mit PBS-Puffer, fügen Sie die Färbung Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 100 und 1 h bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Beispiel Antikörper erfolgreich im Einsatz sind, FITC konjugiert Ratte-Anti-Maus Ig λ1, λ2, λ3 Lichterkette, Klonen R26 46 um zu erkennen, dass Klonen MHC-Ig und FITC konjugierten Maus anti-armenische/syrischen Hamster IgG, G192-1, um Anti-Maus-CD28 zu erkennen.
  3. Waschen Sie die Partikel und lesen Sie die Fluoreszenz auf eine fluoreszierende Platte-Reader zu.
    1. Waschen Sie magnetisch (wie in Schritt2 beschrieben) die gefärbten aAPC Fraktionen dreimal mit 0,5 mL PBS.
    2. Eluieren Sie die gewaschenen aAPCs mit 0,5 mL PBS.
    3. 100 µL der eluierten aAPCs Hinzufügen einer 96-Well mit flachem Boden Platte die Konzentration über die Extinktion wie in Schritt 3.1 zu lesen.
    4. Nehmen Sie die restlichen 400 µL, aufgeteilt in zwei 200 µL Aliquots und zwei Brunnen in einem schwarzen, Polystyrol 96-Well, flachen Teller hinzuzufügen. Titrieren Sie im Verhältnis 1:2 nach unten die Platte durch Einnahme von 100 µL der Lösung und mischen mit dem nächsten Brunnen, der 100 µL PBS in jedem Na wenigstens viermal hat.
      Hinweis: Durchschnittliche mehrfach repliziert der Messung zur Lärmminderung bei der Messung.
    5. Machen Sie auf der gleichen schwarz 96-Well-Platte eine Standardkurve die fluoreszierende Antikörper verwendet, um Flecken, indem es auf 1: 200 in einem Brunnen mit 200 µL PBS und titrieren nach unten im Verhältnis 1:2 für mindestens 12 Brunnen.
    6. Nachdem aAPC und fluoreszierende Antikörper auf der Platte sind, gelesen Sie die Platte mit einem fluoreszierenden Platte Lesegerät.
  4. Berechnen Sie die Menge an Protein pro Partikel. Bestimmen die Konzentration der Antikörper durch den Vergleich der Werte der Standardkurve, wo die Antikörperkonzentration bekannt ist, vorausgesetzt, ein 1:1 Verhältnis der Färbung Antikörper Antikörper erkannt. Dann teilt diese Konzentration von erkannten Antikörper mit der Konzentration der Partikel durch die Extinktion-Assay bestimmt geben die Anzahl der Antikörper pro Partikel.

(4) Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen mit vorbereiteten Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen zu bereichern.

  1. CD8 + T-Zellen zu isolieren.
    1. Einschläfern Sie die Tiere durch die Einwirkung von Isofluran gefolgt von zervikale Dislokation.
    2. Entfernen Sie der Milz und Lymphknoten von Wildtyp C57BL/6j Mäusen und in einer Lösung von PBS. Einweichen Sie der Organe und eluieren Sie die Zellen durch eine sterile 70 µm Zelle Sieb mit häufigen Wäschen von PBS.
    3. Um nicht - CD8 + T-Zellen zu beseitigen, verwenden Sie eine keine-Touch CD8 + T Zelle Isolierungskit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Jedes Antigen-Zustand erfordert mindestens 3 x 106 CD8 + T-Zellen.
  2. Fügen Sie die Nanopartikel-aAPCs an der CD8 + T-Zellen zu binden.
    1. Im Anschluss an die Isolation konzentrieren Sie sich auf ein Volumen von 100 µL mit PBS-Puffer mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA.
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der aAPCs hinzufügen, indem die Berechnung basierend auf dem Verhältnis von 1011 aAPC-gebunden, Peptid-MHC-Ig für geladen alle 106 CD8 + T-Zellen.
    3. Brüten aAPC Partikel und CD8 + T-Zellen für 1 h bei 4 ° C mit kontinuierlichen mischen in eine sterile 5 mL Polystyrol Runde Unterrohr.
  3. Bereiten Sie ergänzt Media und T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF) eluieren und Kultur CD8 + T-Zellen.
    1. Ergänzen Sie für ergänzt Medien komplette RPMI 1640 Medien (mit Glutamin) mit 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,4 x Vitamin Lösung, 92 µM 2-Mercaptoethanol, 10 µM Ciprofloxacin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS).
    2. TCGF, die Protokolle bereits etablierten und referenzierten hier9folgen zu machen.
      Hinweis: TCGF ist eine hauseigene Cocktail aus menschlichen Immunsystem Zytokine, die unerlässlich ist, T-Zellen mit zusätzliche Stimulation Signale benötigt, um wachsen auszustatten. TCGF ausgetauscht werden für bekannte T-Zelle stimulierende Zytokine wie Il-2, IL-7 oder IL-15; jedoch kann jedes der T-Zell-Antwort entsprechend polarisieren. Das hier beschriebene Protokoll wurde nicht mit dieser Cocktails optimiert; damit andere Techniken für die Konzentrationen konsultiert werden sollte und Kombinationen TCGF Nichtbenutzung mit Beispielen aufgeführten10,11.
  4. Waschen Sie und bereichern Sie aAPC und CD8 + T-Zelle-Mischung.
    1. Waschen Sie die Magnetpartikel aAPCs wie in Schritt2 beschrieben. Allerdings waschen zuerst mit PBS-Puffer mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA, zweite mit Medien ergänzt und dritte mit Medien mit 1 % ergänzt TCGF.
    2. Eluieren aAPCs und angereicherte CD8 + T-Zellen in 500 µL ergänzt Medien mit 1 % TCGF.
    3. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer und die Platte in einer 96 U-Boden-Platte in 160 µL pro Bohrloch ergänzt Medien mit 1 % TCGF in einer Konzentration von 2,5 x 105 CD8 + T Zellen/mL.
    4. Wenn Isolierung mit aAPCs mit Peptid-geladen nur MHC-Ig auf der Oberfläche (keine co-stimulatory Signale), dann komplette Schritt 4.5. Mit aAPCs mit beiden Peptid beladenen MHC-Ig auf die Oberfläche und co-stimulatory Signale zu isolieren, dann gehen Sie zu Schritt 5.
  5. Die Magnetpartikel beschichtet mit co-stimulatory Signalen auf der Oberfläche der angereicherten Bruchteil dazugeben Sie und ein Magnetfeld um die stimulierende Signale auf der Oberfläche der T-Zellen Co cluster.
    1. Die angereicherten Fraktionen hinzufügen äquimolaren (oder mehr je nach Anwendung-siehe Abschnitt über aAPC Eigenschaften zu kontrollieren) stimulierende Antikörper auf die Anzahl der Peptid beladenen MHC-Ig auf das Teilchen.
    2. Co-stimulatory magnetische Partikel binden an angereicherten CD8 + T-Zellen für 1 h bei 4 ° c zu ermöglichen
    3. Fügen Sie Magnetfeld, indem man die Kultur-Platte zwischen zwei N52 Disk Neodymmagneten von 1,9 cm (0,75 Zoll) in der Länge.
      Hinweis: N52 Disk Magnete haben ein extrem starkes Feld. Darauf sollte geachtet werden, beide zu lagern mit Abstandshaltern zwischen Magneten, da es schwer voneinander zu entfernen und wenn sie auf den Kultur-Platten setzen. Um die Magnete kleben die metallischen Komponenten des Inkubators zu minimieren, legen Sie sie in 50 mL konische Rohr Styropor-Container auf der Unterseite und der Oberseite.

5. erweitern Sie und erkennen Sie Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen mit vorbereiteten Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen zu.

  1. Fügen Sie die 96 U-Talsohle well-Platte mit aAPCs und CD8 + T-Zellen in eine befeuchtete 5 % CO2, 37 ° C Inkubator für 3 Tage. Tag 3 ernähren Sie sich die Zellen mit 80 µL pro Bohrloch ergänzt Medien mit 2 % TCGF und Ort zurück in den Inkubator bis Tag 7.
  2. Am 7. Tag ernten Sie die stimulierten Zellen in eine 5 mL Runde Unterrohr zum zählen.
  3. Sobald alle die Lösung wird geerntet, Spin-down die geernteten Zellen in 0,5 mL PBS mit 0,05 % Natriumazid und 2 % Aufschwemmen FBS. Rechnen Sie entwicklungsfähigen Zellen durch Färbung mit Trypan blau und setzt auf eine Hemocytometer.
  4. 50.000-500.000 gezählte Zellen in zwei neuen 5 mL Rundrohre unten für Antigen-spezifische Färbung zu entfernen. Eine Röhre für den Verwandten Peptid-MHC-Fleck verwendet werden, und der andere Schlauch wird für den nicht-verwandtes Fleck Hintergrundfärbung bestimmen verwendet werden.
  5. Fügen Sie 1 µg der biotinylierte MHC-Ig (mit Hilfe der Technik, die in Schritt2 beschrieben) zu den jeweiligen Cognate und nicht verwandtes Röhren in 100 µL PBS mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS mit Allophycocyanin (APC)-Ratte konjugierten Anti-Maus CD8a, 53-6,7 (Verdünnungsverhältnis von Klonen 1: 100) für 1 h bei 4 ° C.
  6. Hinzufügen von sekundären Streptavidin und Leben tot Fleck. Überschüssige biotinylierte MHC-Ig mit PBS durch Zentrifugation auswaschen. Dann färben alle Proben mit einem Verhältnis von 1: 350 von Phycoerythrin (PE)-mit der Bezeichnung Streptavidin und 1: 1000-Verhältnis des Fleckes lebenden/Toten fixierbar grüne tote Zelle für 15 min bei 4 ° C.
  7. Lesen Sie alle Proben auf einem Durchflusszytometer bestimmen die Besonderheit und die Anzahl der Antigen-spezifische Zellen.
    1. Überschüssige sekundäre auswaschen und lebenden/Toten Fleck durch Zentrifugation und Aufschwemmen mit 150 µL PBS-Puffer mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS auf einem Durchflusszytometer zu lesen.
  8. Bestimmen der Anzahl und Prozent der Antigen-spezifische Zellen mit Daten-Analyse-Software.
    1. Um den Prozentsatz der Antigen-spezifische Zellen zu bestimmen, verwenden Sie die folgenden Tore in den jeweiligen Auftrag live + Lymphozyten + (forward Scatter von Side Scatter), CD8 + und Dimer +. Bestimmen Sie das Dimer + Tor durch den Vergleich der nicht-verwandtes auf den cognate Fleck.
    2. Den Anteil der Antigen-spezifische Zellen in einer Probe durch Subtraktion den Prozentsatz der Dimer + cognate MHC-Ig-Fleck aus den nicht-verwandtes MHC-Ig Fleck zu bestimmen.
    3. Multiplizieren Sie mit Hilfe dieser Prozentsatz von Antigen-spezifischen Zellen, ihn durch die Anzahl der Zellen gezählt, die Anzahl der daraus resultierenden Antigen-spezifische Zellen von der Bereicherung und Erweiterung nachgeben.
      Hinweis: Entschädigung müssen auf das Durchflusszytometer eingerichtet, da gibt es spektrale Überlappung mit der Fluorophore in diesem Panel verwendet.

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Ergebnisse

Um eine erfolgreiche Bereicherung und Erweiterung der antigenspezifischen T-Zellen zu vervollständigen, die Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle erfolgreich aAPC Partikel beizufügen. Basierend auf den 3 Methoden der Partikel Anlage, bieten wir einige repräsentativen Daten für eine erfolgreiche Konjugation Verfahren Ergebnis (Abb. 5a). In der Tat, wenn die Liganden-Dichte zu niedrig ist, dann es wird effektive Stimulation der Antigen-spezif...

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Diskussion

Wir haben eine neuartige antigenspezifischen T-Zellen Isolationstechnologie basierend auf Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) erstellt. Nanopartikel aAPCs haben Peptid-MHC auf der Oberfläche geladen, die Antigen-spezifische T-Zell-Bindung und Aktivierung neben co-stimulatory Aktivierung ermöglicht. aAPCs sind ebenfalls paramagnetisch und kann somit verwendet werden, um seltene antigenspezifischen T-Zellen mit einem magnetischen Feld bereichern. Wir haben optimiert und studierte wichtige Nanop...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden finanziellen vorgibt: unter einem Lizenzvertrag zwischen NexImmune und der Johns Hopkins University, Jonathan Schneck ist berechtigt, einen Anteil des Königtums erhielt von der Universität auf den Verkauf von Produkten in diesem beschrieben Artikel. Er war auch einer der Gründer von NexImmune und besitzt Eigenkapital in das Unternehmen. Er dient als Mitglied des Board of Directors und wissenschaftlicher Beirat des NexImmune. Die Bedingungen dieser Vereinbarungen müssen überprüft und genehmigt von der Johns Hopkins University gemäß ihrer Interessenkonflikt Politik wurde.

Danksagungen

J.W.H. danke das NIH Krebs Nanotechnologie Training Center am Johns Hopkins Institut für Nanobiotechnologie, die National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) und die Bögen Foundation Fellowship Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung durch die National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835 R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovationsinitiative und Coulter Foundation (JPS) finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

Referenzen

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