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Résumé

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Résumé

Nous avons développé un outil pour enrichir et développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Cela peut être utile dans des cas tels que A) détecter l’existence de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, B) sonde la dynamique des réactions antigène-spécifiques, C) comprendre les réactions antigène-spécifiques influencent l’état de la maladie telles que l’auto-immunité, D) démystifier hétérogènes réponses spécifiques de l’antigène des cellules T, ou E) utilisent des cellules antigène-spécifiques pour la thérapie. L’outil est basé sur une particule magnétique que nous avons conjugué antigène-spécifiques et les signaux de costimulation des lymphocytes T, et que nous appelons comme artificiels (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Par conséquent, étant donné que la technologie est simple à réaliser, il pourra facilement être adopté par d’autres laboratoires ; ainsi, notre but ici est de décrire en détail la fabrication et l’utilisation subséquente de la vamp. Nous expliquons comment attacher les signaux de costimulation et antigène-spécifiques à la VAMP, comment les utiliser pour enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et comment développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Par ailleurs, nous mettrons en évidence de conception technique, les considérations liées à l’information expérimentale et biologique de notre expérience avec la caractérisation des cellules T spécifiques de l’antigène.

Introduction

Avec la montée des immunothérapies beaucoup, il y a un besoin d’être en mesure de caractériser et de contrôler les réponses immunitaires. En particulier, la réponse immunitaire adaptative est intéressant en raison de la spécificité et la longévité des cellules. Récemment, les thérapies de récepteurs chimériques-antigène des lymphocytes T ont été approuvés pour le traitement du cancer ; Cependant, les récepteurs d’antigènes sont basées hors de la cellule surface antigène commun CD19, au lieu des antigènes spécifiques du cancer1. Au-delà de la spécificité, immunothérapies peuvent aussi souffrent du manque de contrôle et limitée à comprendre la réponse immunitaire dynamique au sein du cancer ou d’auto-immunité.

Un des défis de l’étude des réponses spécifiques à l’antigène est leur fréquence extrêmement basse, par exemple., lymphocytes T antigène-spécifiques sont : 1 de chaque 104 106 T cellules2,3. Ainsi, afin d’étudier quel T, les cellules sont présentes ou en réponse, les cellules doivent soit être enrichi et élargi, ou besoin de leur signal à amplifier. C’est cher et difficile à maintenir les cellules nourricières en utilisant les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’expansion des cellules antigène-spécifiques. Les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’amplification du signal de T antigène-spécifiques des cellules, comme le dosage de l’enzyme-linked immunospot (ELISPOT), limiter la réutilisation de ces cellules T4. Enfin, en raison de la faible sensibilité, souvent ces deux techniques doivent être combinés pour le dénombrement de l’antigène-spécifiques.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé l’antigène artificiel à base de nanoparticules magnétiques présentant cellulaire (VAMP)5,6,7,8. La VAMP peut être fonctionnalisée avec un complexe antigène-spécifiques-peptide signal chargé majeur d’histocompatibilité (pMHC) et les molécules de costimulation -e.g., un anticorps anti-CD28-à la fois enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et puis par la suite stimuler leur expansion (Figure 1). Les particules peuvent ainsi être un produit sur étagère rentable qui peut être aussi bien personnalisé pour répondre aux stimulations de l’antigène-spécifiques encore standardisé à travers des expériences et des patients. L’enrichissement et l’expansion traiter les résultats dans des centaines de milliers-pli expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène et peut entraîner des fréquences jusqu'à 60 pour cent après seulement une semaine, ce qui permet la caractérisation ou l’utilisation thérapeutique des grandes nombre de cellules. Dans les présentes, nous expliquent comment faire des nanoparticules Vamp, quelques considérations de conception critiques dans le choix des propriétés de nanoparticules et démontrer certains résultats typiques de l’utilisation de ces particules à isoler et à développer des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène rares.

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Protocole

Toutes les souris ont été maintenues conformément aux directives approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université Johns Hopkins.

1. Chargez la protéine de Fusion des immunoglobulines dimère complexe majeur d’histocompatibilité (MHC-Ig) avec séquence peptidique antigène désirée.

Remarque : Si vous utilisez la H - 2Kb : Ig, puis suivre le protocole détaillé à l’étape 1.1 ; Si vous utilisez H-2Db:Ig, puis suivre le protocole détaillé dans l’étape 1.2.

  1. Active le chargement de la séquence peptidique en H - 2Kb : Ig.
    1. Préparez les tampons nécessaires. Préparer le tampon de dénaturation en faisant une solution de NaCl 150 mM et 15mM Na2CO3 dans l’eau désionisée et puis en ajustant le pH à 11,5. Préparer le tampon de renaturation qui en fait une solution de 250 mM Tris HCl dans l’eau désionisée et en ajustant le pH à 6,8.
      Remarque : En règle générale, il faudra environ 5 mL de la dénaturation et la renaturation des tampons pour 1 mg de H - 2Kb : Ig.
    2. Dénaturer la H - 2Kb : Ig pour autoriser la liaison peptidique améliorée. Apporter la H - 2Kb : concentration des Ig à entre 0,5 à 2 mg/mL avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Puis diluer la H - 2Kb : Ig à une concentration finale de 100 à 200 µg/mL avec volume de 5 à 10 équivalents de dénaturation de la mémoire tampon et laisser pour incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
    3. Ajouter 50 excès molaire du peptide séquence (habituellement stock peptide est maintenue à 1 mM à-80 ° C) à la H - 2 Kb : solution d’Ig.
      Remarque : Habituellement antigènes peptidiques devra être dissous au moins 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et ensuite ajouté lentement à PBS de rester soluble. Selon la séquence d’acides aminés, la quantité de DMSO devrez être augmentée.
    4. Renaturer H - 2Kb : Ig avec peptide. Immédiatement après l’ajout du peptide, porter la solution à un pH de 7,4 en ajoutant la renaturation tampon. Laissez agir la solution neutralisée à incuber pendant 48 h à 4 ° C.
    5. Concentrer et laver chargement peptide H - 2Kb : Ig. utilisant un concentrateur centrifuge avec une limite de poids moléculaire de 50 kDa (MWCO), suivez les instructions du fabricant pour laver le peptide-chargé H - 2Kb : solution Ig 3 fois avec du PBS, concentré au moins 1 mg/mL et quantifier la concentration sur un spectrophotomètre.
  2. Active le chargement des séquences peptidiques dans H-2Db:Ig.
    1. Préparez les tampons nécessaires. Préparer le tampon de dénaturation en faisant une solution d’acide citrique 131 mM, NaCl 150 mM et 124 mM Na2HPO4 dans l’eau désionisée et puis en ajustant le pH à 6,5. Préparer le tampon de renaturation qui en fait une solution de 120 mM Tris HCl dans l’eau désionisée et en ajustant le pH à 8,8.
      Remarque : En règle générale, il faudra environ 5 mL de tampon de la dénaturation et 1 mL de tampon renaturation pour 1 mg de H-2Db:Ig.
    2. Dénaturer H-2Db:Ig pour autoriser la liaison peptidique améliorée. Mettre le H-2Db:Ig concentration à une concentration finale de 0,5 à 2 mg/mL avec du PBS. Ensuite, diluer le H-2Db:Ig à une concentration finale de 100 à 200 µg/mL avec 5 à 10 équivalents de volume de tampon de dénaturation.
    3. Ajouter 50 excès molaire du peptide séquence (habituellement stock peptide est maintenue à 1 mM à-80 ° C) au H-2Db:Ig solution et laisser pour incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    4. Ajouter β2 microglobuline et renaturer H-2Db:Ig avec le peptide. Ajouter 2 fois excès molaire de β2 microglobuline. Ensuite, porter la solution à un pH de 7,4 en ajoutant la renaturation tampon. Laissez agir la solution neutralisée à incuber pendant 24 h à 4 ° C.
    5. Concentrer et laver chargement peptide H-2Db:Ig. utilisant un concentrateur centrifuge avec un 50 kDa MWCO, suivez les instructions du fabricant pour laver le peptide-chargé H - 2 Kb : solution Ig 3 fois avec du PBS, au moins 1 mg/mL et de quantifier la concentration sur un spectrophotomètre.

2. conjugué Complexes MHC-peptide et les molécules de costimulation à la Surface des nanoparticules magnétiques pour former des nanoparticules artificielle des cellules présentatrices d’antigènes. Utilisez l’une des trois méthodes différentes selon la taille des particules et Application.

Remarque : Un certain nombre de différentes techniques permet de conjuguer les protéines à la surface des particules. Dans les présentes, 3 approches distinctes sont décrites : particules recouvertes d’amine (point 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-enduit des particules (point 2.2) et biotin-enduit (étape 2.3). Ces processus ont également été décrits en détail dans la section méthodes de deux documents publiés6,7. Exécutez toutes les étapes dans une hotte de laboratoire de biosécurité avec des solutions stériles pour maintenir la stérilité des particules stock vamp.

  1. Enrober les signaux spécifiques de l’antigène et stimulateurs amine recouvert de particules magnétiques (Figure 2). Ce processus est décrit pour 100 nm, nanoparticules superparamagnétiques amine-enduit.
    Remarque : Les protocoles détaillés pour fixer l’anticorps à la surface d’une particule d’enduit amine se trouve à https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, où 201 note technique décrit comment de thiolate anticorps et conjugué à la maléimide fonctionnaliser particules et 202 décrivent le processus nécessaire pour fonctionnaliser particules recouvertes d’amine avec groupes fonctionnels maléimide. Ici, seulement de légères modifications sont mises en évidence pour le MHC-Ig et les signaux de costimulation attachés à ces particules.
    1. Thiolate les anticorps avec le réactif de Traut (Technote 201).
      1. Préparer un 10 x PBS-tétraacétique (EDTA) l’acide un tampon (0,1 M PBS et 100 mM EDTA). Ajouter les 10 de tampon PBS-EDTA pour les anticorps à un 01:10 ratio pour empêcher l’oxydation des thiols libres ajoutés aux anticorps.
      2. Ajouter 20 excès de réactif de Traut (2-iminothiolane) à l’anticorps et incuber pendant 2 h à température ambiante avec le mélange. Mesurer dans une hotte chimique pour éviter la respiration qu’il convertit les groupes amine aux groupes thiol réactif de la Traut (poudre).
      3. Laver soigneusement avec 1 x tampon PBS-EDTA 3 fois à l’aide d’un concentrateur centrifuge avec un 50 kDa MWCO et suivre les indications du fabricant, concentrant jusqu'à ce qu’un volume final de 500 µL. mesurer la concentration de la solution d’anticorps, en utilisant un spectrophotomètre.
    2. Convertir les groupes fonctionnels amine sur les nanoparticules magnétiques maléimide groupes à l’aide de sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-CCAP, Technote 202).
      1. Ajouter les 10 de tampon PBS-EDTA pour les anticorps à un 01:10 ratio aux particules.
      2. Dissoudre la Sulfo-CCAP dans l’eau désionisée et vortex pour remettre en suspension à une concentration de 1 mg/mL. Doser le Sulfo-CCAP (poudre) dans une hotte chimique pour éviter la respiration qu’il convertit les groupes amine maléimide groupes.
      3. Ajouter 0,016 nmol de la solution Sulfo-CCAP pour chaque millimètre carré de surface des particules. Pour 1 mg de 100 particules nm, utilisez 0,3 mg de Sulfo-CCAP. Laisser pour réagir pendant 1,5 h à température ambiante.
      4. Laver les particules avec 1 x tampon PBS-EDTA 3 fois en utilisant un champ magnétique avec une colonne magnétique et remettre en suspension dans 500 µL de 1 x tampon PBS-EDTA.
        Remarque : Si vous utilisez des particules inférieures à 200 nm, tels que les particules nm 100 décrit ci-après, aimants très probables ne sera pas assez puissants pour retirer les particules pour le lavage ou la concentration des fins. Ainsi, pour laver les particules plus petites, vous pouvez utiliser une colonne magnétique composée de sphères ferromagnétiques pour amplifier le champ magnétique.
    3. Réagissent les particules maléimide fonctionnalisés avec des anticorps THIOLÉS (Technote 201).
      1. Ajouter les particules d’un flacon en verre de scintillation, ajouter un mini-magnétique, placez juste un pouce au-dessus une plaque magnétique remuer et induire magnétique de mélange de la solution de la particule.
      2. À la solution de mélange, ajouter goutte à goutte les anticorps THIOLÉS (0,5 mg d’anticorps pour chaque 1 mg de particules). Laisser pour réagir pendant une nuit à température ambiante.
      3. Lavez avec un tampon PBS 1 x 3 fois en utilisant un champ magnétique et remettre en suspension dans 500 µL de PBS 1 x. Étiqueter et stocker à 4 ° C pendant 6 mois.
        Remarque : Le rendement maximal en conjugaison se produit lorsque fonctionnalisés maléimide particules sont immédiatement mélangées avec des protéines THIOLÉS.
  2. Enrober les signaux spécifiques de l’antigène et stimulateurs NHS-enduit de particules magnétiques (Figure 3). Ce processus est décrit pour 200 nm, nanoparticules superparamagnétiques NHS-enduit.
    1. Préparer la solution tampon de resuspension, tampon trempe et tampon de stockage. Le tampon de resuspension est 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide (MES) avec 0,01 % de Tween 20 ajusté à pH 6.0. Le tampon trempe est une solution de 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Le tampon de stockage est une solution de 10 mM PBS et 0,01 % Tween à un pH de 7,4.
    2. Remettre en suspension les particules lyophilisées dans 1 mL de la solution tampon de resuspension. Vortex vigoureusement pendant au moins 15 min, jusqu'à ce qu’aucun agrégat n’est visibles.
    3. Placez les particules magnétiques sur un support magnétique pour retirer le surnageant, resuspendre avec 0,5 mL de tampon de resuspension et transférer dans un flacon en verre de scintillation. Vortex jusqu'à ce qu’aucun agrégat n’est visibles.
    4. Ajouter 0,1 mg de protéines par 1 mg de particules remises en suspension. Vortex pour mélanger et réagissent à la température ambiante pendant 2,5 h tout en mélangeant.
    5. Ajouter 0,1 mL de tampon de trempe et réagissent à température ambiante pendant 30 min en mélangeant.
    6. Placer le flacon à scintillation sur un support magnétique et les particules de lavage. Attendez que le surnageant est clair à supprimer. Retirer les particules de magnétique, ajouter 1 mL de tampon de resuspension et vortex jusqu'à ce qu’aucun agrégat n’est visibles. Répéter cette opération trois fois et remettre en suspension les particules dans 1 mL de solution tampon de resuspension. Stocker les particules à 4 ° C pendant 6 mois.
  3. Enrober les signaux spécifiques de l’antigène et stimulateurs biotin-enduit de particules magnétiques (Figure 4). Ce processus est décrit pour 50 à 100 nm, anti-biotine nanoparticules superparamagnétiques.
    1. Biotinylater MHC-Ig ou les molécules de costimulation.
      1. Ajuster la concentration en protéine de 0,5 à 2 mg/mL dans le tampon PBS. Resuspendre le sulfo-NHS-biotine à une concentration de 10 mg/mL dans l’eau désionisée et ajouter 20 fois molaire anticorps excès de stimulation. Incuber à température ambiante pendant 45 min.
      2. Laver soigneusement avec du PBS 3 fois avec un concentrateur centrifuge avec un 50 kDa MWCO, suivez les instructions du fabricant, concentrant jusqu'à ce qu’un volume final de 500 µL. mesurer la concentration de la solution d’anticorps à l’aide d’un spectrophotomètre.
    2. Biotinylé conjugué MHC-Ig et/ou des signaux de costimulation aux nanoparticules anti-biotine. Pour 500 µL de stocks anti-biotine particules, ajouter 0,5 nmol d’anticorps stimulant et incuber une nuit à 4 ° C.
    3. Laver les nanoparticules de vamp conjugués. Parce que ces particules sont inférieurs à 200 nm, mouiller une colonne magnétique et poser sur un support magnétique.
    4. Ajouter la suspension de particules/protéine à la colonne. Permettre à toutes les protéines/particules d’entrer complètement dans la colonne.
    5. Laver en ajoutant 0,5 mL de PBS trois fois à la colonne.
    6. Éluer en enlevant la colonne du support magnétique, ajouter 0,5 mL de PBS à la colonne et en utilisant le piston, expulser la VAMP de particules dans un flacon en verre de scintillation. Stocker les particules à 4 ° C pendant 6 mois.
      NOTE : Les particules sont stables à 4 ° C (ne doit pas être congelé) jusqu'à 6 mois. Des températures plus élevées diminuent la fonctionnalité des particules et une agrégation de particules ont été observés (données non présentées). Ne laissez pas à température ambiante pendant de longues périodes de temps que cela diminue de manière significative la durée de vie des particules.

3. caractériser la teneur en protéines sur artificiel présentatrices de nanoparticules de cellule à l’aide de la détection des anticorps fluorescents.

Remarque : Il s’agit d’un contrôle de la qualité utile de l’antigène artificiel produit cellules présentatrices. Aussi, la quantité de signal stimulateur est utilisée pour produire des doses équivalentes de vamp partout en lots et divers types de VAMP (e.g., différentes tailles).

  1. Mesurer la concentration de particules de vamp couché.
    1. Utiliser des particules non conjuguées de la solution mère et faire une titration de dose de 1:2 dans une solution de PBS sur une plaque de 96 puits à fond plat culture cellulaire avec 100 µL / puits.
    2. Lire les particules sur un spectrophotomètre de plaque-lecture à 405 nm pour créer une courbe d’étalonnage à partir d’une concentration de particules connues.
    3. Prenez un échantillon de la VAMP conjugués, diluer dans du PBS à un volume total de 100 µL et lisez sur le spectrophotomètre.
  2. Enlever un échantillon de vamp fabriqué et tacher avec des anticorps fluorescents.
    1. Pour calculer combien échantillon pour retirer, estimer le nombre d’anticorps à la surface de la particule.
      Remarque : Pour ces techniques, supposent une densité d’environ 1000 anticorps/µm2 de surface de la particule. Pour être en mesure de détecter la fluorescence, il nécessite environ 1011 MHC-Ig ou molécules CD28 totales par essai fluorescent.
    2. Porter le volume total de vamp jusqu'à 100 µL de PBS, ajouter les coloration des anticorps à une dilution au 1/100 et incuber pendant 1 heure à 4 ° C.
      NOTE : Exemple anticorps utilisés avec succès sont FITC conjugué anti rat souris Ig λ1, λ2, λ3 chaîne légère, clone R26 46 pour détecter les MHC-Ig et souris conjuguée FITC anti arménien/Syrian hamster IgG, clone G192-1, afin de détecter la anti-souris CD28.
  3. Laver les particules et lire la fluorescence sur un lecteur de plaque fluorescente.
    1. Magnétiquement laver (tel que décrit à l’étape 2) les fractions de vamp tachée trois fois avec 0,5 mL de PBS.
    2. Éluer la VAMP lavé avec 0,5 mL de PBS.
    3. Ajouter 100 µL de la VAMP éluées dans une plaque 96 puits à fond plat pour lire la concentration à l’aide de l’absorbance comme étape 3.1.
    4. Prendre le restant de 400 µL, divisé en deux 200 µL d’extraits et ajouter aux deux puits dans une plaque à 96 puits, fond plat noire, polystyrène. Titrer à un ratio de 1:2 vers le bas de la plaque en prenant 100 µL de la solution et en mélangeant avec le prochain bien qu’a 100 µL de PBS dans chacun bien au moins quatre fois.
      Remarque : Les multiples moyens réplique de la mesure pour réduire le bruit dans la mesure.
    5. Sur la même plaque 96 puits noire, faire une courbe d’étalonnage de l’anticorps fluorescents utilisés sur la tache, en l’ajoutant au 1 : 200 dans un puits avec 200 µL de PBS et titration vers le bas au rapport 1:2 au moins 12 puits.
    6. Après que les anticorps fois Vamp et fluorescentes sont sur la plaque, lire la plaque avec un lecteur de plaque fluorescente.
  4. Calculer la quantité de protéines par particule. Déterminer la concentration d’anticorps en comparant les valeurs de la courbe d’étalonnage, où la concentration en anticorps est connue, en supposant un ratio de 1:1 des anticorps à la coloration détecté des anticorps. Puis en divisant cette concentration d’anticorps détectés avec la concentration des particules déterminé par l’analyse d’absorbance donnera le nombre d’anticorps par particule.

4. enrichir spécifiques de l’antigène CD8 + cellules de T avec des nanoparticules préparées artificielle des cellules présentatrices d’antigènes.

  1. Isoler des lymphocytes t CD8 +.
    1. Euthanasier les animaux par une exposition à l’isoflurane suivie par dislocation cervicale.
    2. Enlever la rate et les ganglions lymphatiques des souris C57BL/6j de type sauvage et placer dans une solution de PBS. Faire macérer les organes et éluer les cellules à travers un tamis de cellule µm 70 stériles avec des lavages fréquents de PBS.
    3. Pour éliminer les cellules non - T CD8 +, utiliser un kit d’isolation cellulaire sans contact T CD8 + et suivez les instructions du fabricant.
      Remarque : Chaque condition d’antigène nécessite au moins 3 x 106 cellules T CD8 +.
  2. Ajouter la VAMP de nanoparticules pour lier aux cellules T CD8 +.
    1. Suite à l’isolement, se concentrer sur un volume de 100 µL de PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA.
    2. Déterminer le nombre de vamp à ajouter en calculant selon le ratio de 1011 vamp-lié, peptide-chargé MHC-Ig pour chaque 106 cellules de T CD8 +.
    3. Incuber les particules de Vamp et cellules T CD8 + pendant 1 h à 4 ° C, avec un mélange continuel dans un polystyrène stériles 5 mL rond tube inférieur.
  3. Préparer les médias complétée et facteur de croissance des lymphocytes T (TCGF) à éluer et culture des lymphocytes t CD8 +.
    1. Pour les médias supplémentés, Supplément médias RPMI 1640 (avec glutamine) avec 1 x non essentiels, acides aminés, pyruvate de sodium 1 mM, 0,4 x solution de vitamine, 92 2-mercaptoéthanol µM, 10 µM ciprofloxacine et 10 % sérum fœtal (SVF).
    2. Pour rendre le TCGF, suivre les protocoles déjà établis et référencés ici9.
      Remarque : TCGF est un cocktail maison de cytokines immunitaire humaine, qui est essentiel pour fournir des cellules T avec des signaux de stimulation supplémentaires nécessaires à la culture. TCGF pourrait être échangé pour des lymphocytes T connu stimulateur cytokines telles qu’il-2, IL-7, ou IL-15 ; Cependant, chacun peut polariser la réponse des lymphocytes T en conséquence. Le protocole décrit ci-après n’a pas été optimisé avec ces cocktails ; donc autres techniques devraient être consultés pour les concentrations et regroupements si TCGF n’est pas utilisé avec les exemples énumérés10,11.
  4. Laver et enrichir la vamp et mélange de cellules T CD8 +.
    1. Laver la VAMP de particule magnétique tel que décrit à l’étape 2. Cependant, laver tout d’abord, avec le tampon PBS avec 0,5 % BSA et 2 mM EDTA, à l’aide de deuxième complétée médias et à l’aide de tiers complétés médias avec 1 % TCGF.
    2. Éluer la vamp et enrichi des cellules T CD8 + dans 500 µL de médias supplémentés avec 1 % TCGF.
    3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et la plaque dans la plaque de fond U 96 dans 160 µL / puits des médias supplémentés avec 1 % TCGF à une concentration de 2, 5 x 105 T CD8 + cellules/mL.
    4. S’isoler à l’aide de vamp avec ne peptide-chargés MHC-Ig sur la surface (aucun signal de costimulation), puis complète étape 4.5. Si l’isolant à l’aide de vamp avec les deux chargés en peptide MHC-Ig sur les signaux de costimulation et de surface, passez à l’étape 5.
  5. Ajoutez les particules magnétiques revêtues avec des signaux de costimulation sur la surface à la fraction enrichie ainsi un champ magnétique pour cluster conjointement les signaux de stimulation sur la surface des cellules T.
    1. Les fractions enrichies, ajouter un équimolaire (ou plus selon la demande-Voir la section sur les propriétés de la VAMP de contrôle) d’anticorps stimulant au nombre de chargés en peptide MHC-Ig sur la particule.
    2. Laisser des particules magnétiques costimulation se lier à des cellules T CD8 + enrichis pendant 1 h à 4 ° C.
    3. Ajouter champ magnétique en plaçant la plaque de culture entre deux aimants en néodyme N52 disque de 1,9 cm (0,75 po) de longueur.
      NOTE : N52 disque aimants ont un champ extrêmement fort. Il faut aussi bien les entreposer avec entretoises entre les aimants, comme il est difficile d’enlever un de l’autre et quand mettre sur les plaques de culture. Pour minimiser les aimants de coller sur les parties métalliques de l’incubateur, les placer dans des contenants en styromousse 50 mL tube conique sur le bas et le haut.

5. développez et détecter des cellules de T spécifiques de l’antigène CD8 + avec nanoparticules préparées artificielle des cellules présentatrices d’antigènes.

  1. Ajouter la plaque bien à fond U 96 avec Vamp et lymphocytes t CD8 + dans un humidifié de 5 % de CO2, incubateur de 37 ° C pendant 3 jours. Le jour 3, nourrir les cellules avec 80 µL / puits des médias supplémentés avec 2 % TCGF et la place dans la couveuse jusqu’au jour 7.
  2. Jour 7, récolter les cellules stimulées dans un rond tube inférieur pour le comptage de 5 mL.
  3. Une fois toutes les solution est récoltée, centrifuger les cellules récoltées pour remettre en suspension dans 0,5 mL de PBS avec l’azoture de sodium 0,05 % et 2 % FBS. Compter les cellules viables par coloration au bleu trypan et compter sur un hémocytomètre.
  4. Retirer 50 000-500 000 cellules comptées dans deux nouveaux 5 mL tubes de fond pour une coloration spécifique de l’antigène. Un tube sera utilisé pour la tache de MHC-peptide apparenté, et l’autre tube servira pour la tache non apparenté à déterminer la coloration de fond.
  5. Ajouter 1 µg de biotinylé MHC-Ig (en utilisant la technique décrite à l’étape 2) pour les tubes apparenté respectif et non apparenté dans 100 µL de PBS avec l’azoture de sodium 0,05 % et 2 % FBS avec allophycocyanin (APC)-anti-souris conjugués rat CD8a, clone 53-6,7 (taux de dilution de 1/100) pendant 1 h à 4 ° C.
  6. Ajouter secondaire streptavidine et tache morte en direct. Lavent par excès biotinylé MHC-Ig avec du PBS par centrifugation. Alors tache de tous les échantillons avec un ratio de 1:350 de la phycoérythrine (PE)-étiqueté ratio streptavidine et 1/1000 d’une tache de vivre/morts fixable cellule morte verte pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Lire tous les échantillons sur un cytomètre en flux pour déterminer la spécificité et le nombre de cellules antigène-spécifiques.
    1. Nettoyez secondaires excédentaires et vivre/dé tache par centrifugation et remettre en suspension avec 150 µL de tampon PBS avec l’azoture de sodium 0,05 % et 2 % FBS à lire sur un cytomètre en flux.
  8. Déterminer le nombre et le pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène avec logiciel d’analyse de données.
    1. Pour déterminer le pourcentage de cellules antigène-spécifiques, utilisez les portes suivantes dans l’ordre respectif live +, lymphocytes + (forward scatter par diffusion latérale), CD8 + et dimère +. Déterminer la dimère + porte en comparant la non-apparenté à la tache apparentée.
    2. Déterminer le pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène dans un échantillon en soustrayant le pourcentage de dimère + de la tache de MHC-Ig apparentée de la tache de MHC-Ig non apparenté.
    3. À l’aide de ce pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène, multipliez par le nombre de cellules comptées, ce qui donne le nombre de cellules antigène-spécifiques résultants de l’enrichissement et l’expansion.
      Remarque : Compensation devra être mis en place sur le cytomètre en flux étant donné le chevauchement spectrale avec des fluorophores utilisés dans ce panneau.

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Résultats

Pour compléter un enrichissement réussie et l’expansion des cellules T spécifiques de l’antigène, le peptide-chargé MHC-Ig et les molécules de costimulation doivent être fixés avec succès à la particule de vamp. Basé sur les 3 méthodes de fixation de la particule, nous fournir des données représentatives pour un résultat de procédure conjugaison réussie (Figure 5 a). En effet, si la densité de ligand est trop faible, alors il sera pas un...

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Discussion

Nous avons créé une technologie d’isolement des lymphocytes de T antigène-spécifiques nouveaux issue des nanoparticules artificiel (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Vamp de nanoparticules ont peptide-chargés MHC sur la surface qui permet la liaison spécifique de l’antigène des lymphocytes T et activation aux côtés de costimulation activation. Vamp est également paramagnétique et donc peut être utilisé pour enrichir les rares cellules de T antigène-spécifiques en utilisant un champ mag...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : en vertu d’un accord de licence entre NexImmune et l’Université Johns Hopkins, Jonathan Schneck a droit à une part des redevances reçues par l’Université sur les ventes de produits décrits dans ce article. Il a également été des fondateurs de NexImmune et possède l’équité dans la société. Il est membre de la du NexImmune Conseil d’administration et Conseil scientifique. Aux termes de ces arrangements ont été examinés et approuvés par l’Université Johns Hopkins, conformément à sa politique de conflit d’intérêts.

Remerciements

J.W.H. remercie le centre de formation de la nanotechnologie de Cancer NIH au Johns Hopkins Institute nanobiotechnologie, la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures (DGE-1232825) et la Fondation d’ARCS de soutien de la bourse. Ce travail a été financé par le soutien de la National Institutes of Health (P01-AI072677, CA108835-R01, R21-CA185819), Initiative Innovation TEDCO/Maryland et la Fondation Coulter (JPS).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

Références

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