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요약

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

초록

우리는 모두 풍부 하 고 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 도구를 개발 했습니다. 이 B) 항 원 특정 응답의 역학 조사, A) 항 원 특정 T 세포의 존재를 검출 하는 C) 이해에 같은 경우에 도움이 될 수 항 원 특정 응답 자가 면역 질병 상태에 영향을, 어떻게 D) demystify 이기종 항 원 특정 T 세포, 또는 전자에 대 한 응답) 치료에 대 한 항 원 특정 셀을 사용합니다. 도구 자성 입자에에 따라 우리 항 원 특정 및 T 셀 co-stimulatory 신호, 켤레는 우리가 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)으로 기간. 따라서, 기술 생산 간단 이기 때문에, 그것은 쉽게 채택 될 수; 다른 실험실에 의해 따라서, 우리의 목적을 여기 제조와는 aAPCs 사용 자세하게에서 설명 이다. 우리는 aAPCs를 항 원 특정 및 co-stimulatory 신호를 연결 하는 방법, 항 원 특정 T 세포에 대 한 풍부 하 게 그들을 활용 하는 방법 및 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 엔지니어링 디자인 고려 사항 항 원 특정 T 세포 특성화와 우리의 경험의 실험 및 생물 정보에 따라 강조 표시 됩니다.

서문

많은 immunotherapies의 증가 함께 특성화 및 면역 반응을 제어할 수 있을 필요가 있다. 특히, 적합 한 면역 반응 특이성 및 셀의 내구성 때문에 관심사의 이다. 최근, 공상 항 원 수용 체 T 세포 치료 암 치료; 대 한 승인 되었습니다. 그러나, 항 원 수용 체는 일반적인 세포 표면 항 원 CD19, 특정 암1항 대신 떨어져 근거한 다. 특이성, 넘어 immunotherapies 제어, 그리고 제한 된 암이 나 자가 면역 내 동적 면역 반응을 이해의 부족에서 또한 겪을 수 있다.

항 원 특정 응답을 공부 하는 과제 중 하나는 그들의 매우 낮은 주파수, 예를 들어., 항 원 특정 T 세포는 모든 10의 14 106 T 세포2,3. 따라서, 조사는 T 세포가 존재 하거나, 셀 중 농축 하 고 확장 될 필요가 그들의 신호 증폭 될 필요가. 그것은 비싼 고 항 원 특정 셀의 확장에 초점을 현재 기법을 사용 하 여 피더 세포를 유지 하기 어렵다입니다. 항 원 특정 T의 신호 증폭에 초점 현재 기술을 세포, 효소 연결 된 immunospot (ELISPOT) 분석 결과 처럼, 다시 그 T 세포4의 사용 제한. 마지막으로, 낮은 감도 때문에 종종 이러한 두 기술이 필요 항 원 특정 열거형에 대 한 결합.

이러한 문제를 해결 하는 자기 나노 입자 기반 인공 항 원 제시 세포 (aAPC)5,6,7,8개발 했습니다. aAPC와 항 원 특정 신호 펩 티 드 로드 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)-co-stimulatory 분자-functionalized 수예., 안티 CD28 항 체-둘 다 풍부 항 원 특정 T 세포 그리고 그 후 (그림 1) 그들의 확장을 자극. 따라서 입자는 비용 효율적인 상용 제품을 수 모두 항 원 특정 stimulations를 충족 하도록 사용자 정의 아직 실험 및 환자 표준화 수 있다. 농축 및 확장 수행 항 원 특정 CD8 + T 세포의 수천 배 확장 수백에서 결과 처리 하 고 주파수에서 발생할 수 있습니다 최대 60% 단지 1 주일 후 특성 또는 대형의 치료 사용 셀의 수입니다. 여기, 우리는 나노 aAPCs, 나노 속성 선택에 몇 가지 중요 한 디자인 고려 사항을 확인 하는 방법을 설명 하 고에서 분리 하 고 확장 하는 희귀 한 항 원 특정 CD8 + T 세포에이 입자를 활용 하 여 몇 가지 전형적인 결과 보여 줍니다.

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프로토콜

모든 마우스는 존스 홉킨스 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인 지침 당 유지 되었다.

1. 원하는 항 원 펩 티 드 순서 Dimeric 중요 한 조직 적합성 복잡 한 면역 글로불린 융합 단백질 (MHC-Ig)를 로드 합니다.

참고: H-2 Kb를 사용 하는 경우: Ig, 다음 따라 단계 1.1; 상세한 프로토콜 H 사용 하는 경우-2Db:Ig, 다음 따라 단계 1.2에서 상세한 프로토콜.

  1. 활성 펩 티 드 순서에 H-2 Kb의 로드: Ig.
    1. 필요한 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 150 mM NaCl 및 15 m m 나2CO3 의 솔루션을 만드는 다음 11.5에 pH를 조정 하 여 변성 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 250 mM Tris HCl의 솔루션을 만드는 6.8에 pH를 조정 하 여 renaturation 버퍼를 준비 합니다.
      참고: 일반적으로, 그것은 필요 합니다 약 5 mL의 변성 및 renaturation 버퍼 1 mg의 H-2 Kb: Ig.
    2. H-2 Kb 변성: 향상 된 펩 티 드 바인딩 수 있도록 Ig. H 2 Kb를가지고: 0.5-2 사이 Ig 농도 mg/mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께. 다음 H 2 Kb 희석: 5-10 볼륨 변성의 해당 버퍼와 15 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록 100-200 µ g/mL의 최종 농도에 Ig.
    3. 펩 티 드의 50 어 금 니 과잉 추가 순서 (보통 주식 펩타이드 보관-80 ° C에서 1 m m)에 H-2 Kb: Ig 솔루션.
      참고: 일반적으로 펩 티 드 항 원 해야 합니다 10% 내에서 녹 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 다음 천천히 녹는 남아 PBS에 추가. 아미노산 순서에 따라 DMSO의 양을 증가 해야 합니다.
    4. Renature H-2 Kb: 펩 티 드와 서. 펩 티 드의 직후가지고 솔루션 pH 7.4의 renaturation 버퍼를 추가 하 여. 4 ° c.에서 48 h에 대 한 품 어 중화 솔루션을 허용
    5. 집중 하 고 펩 티 드 로드 H-2 Kb 세척: Ig. 50 kDa 분자량 컷오프 (MWCO), 원심 집중 장치를 사용 하는 펩 티 드 로드 H-2 Kb를 씻어 제조업체의 지시에 따라: Ig 솔루션 3 회 PBS를 가진 집중 1 mg/mL 이상 그리고 계량 한 분 광 광도 계에 집중.
  2. 활성 H로 펩 티 드 순서의 로드-2Db:Ig.
    1. 필요한 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 131 m m 구 연산, 150 m NaCl, m 및 124 밀리미터 나2HPO4 의 솔루션을 만드는 다음 6.5에 pH를 조정 하 여 변성 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 120 mM Tris HCl의 솔루션을 만드는 8.8에 pH를 조정 하 여 renaturation 버퍼를 준비 합니다.
      참고: 일반적으로, 그것은 필요 합니다 약 5 mL renaturation 버퍼의 1 mL 및 변성 버퍼의 H의 1 밀리 그램-2Db:Ig.
    2. H 변성-향상 된 펩 티 드 바인딩 수 있도록 2Db:Ig. H를가지고-2Db:Ig 농도 0.5-2의 최종 농도를 mg/mL PBS와 함께. 그런 다음 희석 H-2Db:Ig 변성 버퍼의 5-10 볼륨 해당 100-200 µ g/mL의 최종 농도에.
    3. 펩 티 드의 50 어 금 니 과잉 추가 순서 (보통 주식 펩타이드 보관-80 ° C에서 1 m m) H-2Db:Ig 솔루션 1 h 37 ° c.에 대 한 알을 품을 수 있도록
    4. Β2 microglobulin와 renature H 추가-펩 티 드와 2Db:Ig. Β2 microglobulin의 2-fold 어 금 니 과잉을 추가 합니다. 그런 다음 renaturation 버퍼를 추가 하 여 7.4의 pH에 솔루션을가지고. 4 ° c.에 24 h에 대 한 품 어 중화 솔루션을 허용
    5. 집중 하 고 펩 티 드 로드 H 세척-2Db:Ig. 50 kDa MWCO, 원심 집중 장치를 사용 하는 펩 티 드 로드 H-2 Kb 씻어 제조업체의 지시에 따라: Ig 솔루션 3 회 PBS, 1 mg/mL 이상에 집중 하 고 계량은 농도 분 광 광도 계에.

2. MHC 펩 티 드 복합물 및 자성 나노 입자의 표면에 Co-Stimulatory 분자 나노 인공 항 원 제시 세포를 켤레. 입자 크기 및 응용 프로그램에 따라 세 가지 방법 중 하나를 사용 합니다.

참고: 다른 기술의 수 입자의 표면에 단백질을 단백 결합을 사용할 수 있습니다. 3 별도 접근 본, 설명: 아민 코팅 입자 (단계 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-코팅된 입자 (단계 2.2)와 반대로 biotin 코팅 입자 (2.3 단계). 이러한 프로세스 두 논문 출판된6,7의 방법 섹션에서 자세히 설명도 있다. 재고 aAPC 입자의 불 임을 유지 하기 위해 살 균 솔루션 biosafety 증기 두건에서 모든 단계를 수행 합니다.

  1. 항 원 특정 물질로 신호 아민 코팅 자석 입자 (그림 2)에 코트. 이 과정은 100에 대 한 설명 nm, 아민 코팅 superparamagnetic 나노 입자.
    참고: 아민 코팅된 입자의 표면에 항 체를 연결에 대 한 자세한 프로토콜에서 찾을 수 있습니다 https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, Technote 201 어떻게 thiolate에 항 체 및 maleimide 공액 functionalize 설명 합니다. 입자와 202 maleimide 기능 그룹과 아민 코팅 입자를 functionalize 하는 데 필요한 프로세스를 설명 합니다. 여기 약간의 수정만 MHC Ig 및이 입자에 연결 된 co-stimulatory 신호에 대 한 강조 표시 됩니다.
    1. Thiolate Traut의 시 약 (Technote 201)와 항 체.
      1. PBS-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 버퍼 (0.1 m M PBS 및 100 mM EDTA) x 10을 준비 합니다. 1시 10분에서 항 체를 PBS-EDTA 버퍼 x 10을 추가 항 체에 추가 하는 무료 thiols의 산화를 방지 하기 위해 비율.
      2. 20 어 금 니 과잉 Traut의 시 약 (2-iminothiolane)의 항 체를 추가 하 고 혼합과 실 온에서 2 h에 품 어. Thiol 그룹에 아민 그룹을 변환 하기 때문에 호흡을 피하기 위해 화학 증기 두건 내 Traut의 시 약 (건조 분말)을 측정 합니다.
      3. 3 회 원심 집중 장치를 사용 하 여 50 kDa MWCO와 함께 PBS-EDTA 버퍼 x 1와 철저 하 게 세척 하 고 사용 하 여 항 체 솔루션의 농도 측정 하는 500 µ L. 마지막 볼륨까지 집중 제조업체의 지시에 따라 한 분 광 광도 계입니다.
    2. 마그네틱 나노에 아민 기능적인 그룹 maleimide 그룹 sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)를 사용 하 여 변환 cyclohexane-1-카복실산 (Sulfo SMCC, Technote 202).
      1. 1시 10분에 PBS-EDTA 버퍼 x 10 항 체에 추가 입자에 비율.
      2. 1 mg/mL의 농도에서 resuspend에 이온된 수와 소용돌이 Sulfo SMCC 디졸브. Maleimide 그룹에 아민 그룹을 변환 하기 때문에 호흡을 피하기 위해 화학 증기 두건 내 Sulfo SMCC (건조 분말)을 측정 합니다.
      3. 0.016 nmol 모든 평방 밀리미터의 표면적은 입자의 Sulfo SMCC 솔루션을 추가 합니다. 100 nm 입자의 1 밀리 그램, 0.3 mg Sulfo SMCC의 사용 하 여. 실 온에서 1.5 h에 대 한 반응을 수 있습니다.
      4. PBS-EDTA 버퍼 3 번 사용 하 여 자기장 자석 열 x 1와 입자를 세척 하 고 PBS-EDTA 버퍼 x 1의 500 µ L에서 resuspend.
        참고: 200 보다 작은 입자를 사용 하는 경우 nm, 같은 100 nm 입자 여기에서 설명한 가장 가능성이 영구 자석 되지 것입니다 세척 하거나 집중 목적에 대 한 입자를 충분히 강력. 따라서, 작은 입자를 씻어 자기장을 증폭 하는 자기 열 강자성 분야의 구성을 사용 합니다.
    3. Thiolated 항 체 (Technote 201)와 maleimide 기능성된 입자 반응.
      1. 유리 섬광 유리병에 입자를 추가, 미니 자석 볶음 바 추가, 그냥 자기 볶음 판 위에 인치 놓고 자석 입자 솔루션의 혼합을 유도 합니다.
      2. 혼합 솔루션에 dropwise thiolated 항 체 (입자의 모든 1 밀리 그램에 대 한 항 체의 0.5 밀리 그램)를 추가 합니다. 하룻밤 실 온에서 반응 수 있습니다.
      3. 1 x PBS 버퍼 3 번 자기장을 사용 하 여 세척 하 고 1x PBS의 500 µ L에서 resuspend. 레이블을 지정 하 고 최대 6 개월까지 4 ° C에서 저장.
        참고: 최대 활용 효율 maleimide 기능성된 입자는 즉시 thiolated 단백질 섞일 때 발생 합니다.
  2. NHS 코팅 자석 입자 (그림 3)에 항 원 특정 및 물질로 신호 코트. 이 프로세스는 200에 대 한 설명 nm, NHS 코팅 superparamagnetic 나노 입자.
    1. 물의 resuspension 버퍼, 냉각 버퍼 및 스토리지 버퍼를 준비 합니다. 물의 resuspension 버퍼는 25 m m 2-(N-morpholino) 트윈 20 pH 6.0에 조정 0.01 %ethanesulfonic 산 (MES). 냉각 버퍼 pH 7.4에 Tris HCl의 100mm 솔루션입니다. 저장소 버퍼 10 mM PBS 및 0.01%의 솔루션은 pH 7.4에 트윈.
    2. 물의 resuspension 버퍼의 1 mL에 동결 건조 된 입자를 resuspend. 아무 집계는 표시 될 때까지 적어도 15 분 동안 적극적으로 소용돌이.
    3. 마그네틱 스탠드는 상쾌한 제거, 물의 resuspension 버퍼 및 유리 섬광 유리병에 0.5 mL와 함께 resuspend에 자석 입자를 놓습니다. 와 동 아니 집계는 표시 될 때까지
    4. Resuspended 입자의 1 밀리 그램 당 총 단백질의 0.1 밀리 그램을 추가 합니다. 혼합 하 고 혼합 하는 동안 2.5 h에 대 한 실 온에서 반응 소용돌이.
    5. 냉각 하는 버퍼의 0.1 mL를 추가 하 고 혼합 하는 동안 30 분 동안 실내 온도에 반응.
    6. 마그네틱 스탠드에 섬광 유리병을 놓고 입자를 세척 합니다. 상쾌한 명확 하 게 제거 될 때까지 기다립니다. 마그네틱 스탠드에서 입자를 제거, 아무 집계는 표시 될 때까지 물의 resuspension 버퍼 및 소용돌이의 1 mL를 추가 합니다. 이 과정을 세 번 반복 하 고 물의 resuspension 버퍼의 1 mL에 입자를 resuspend. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 입자를 저장 합니다.
  3. 항 원 특정 물질로 신호 안티 biotin 코팅 자석 입자 (그림 4)에 코트. 이 과정은 50-100 nm, 안티 비오 superparamagnetic 나노 입자에 대 한 설명 합니다.
    1. Biotinylate MHC-Ig 또는 co-stimulatory 분자입니다.
      1. 0.5-2 단백질 농도 조정 mg/mL PBS 버퍼에서. 이온된 수에 10 mg/mL의 농도에서 sulfo NHS-비오 틴을 resuspend와 20-fold 어 금 니를 물질로 초과 항 체를 추가 합니다. 45 분 동안 실 온에서 품 어.
      2. 50 kDa MWCO, 원심 집중 장치를 사용 하 여 시간 PBS 3를 철저 하 게 세척 500 µ L의 최종 볼륨을 분 광 광도 계를 사용 하 여 항 체 용액의 농도 측정 될 때까지 집중 하는 제조 업체의 지시를 따릅니다.
    2. 어원이 biotinylated MHC-Ig 및 안티 biotin 나노 co-stimulatory 신호. 재고 안티 biotin 입자의 500 µ L, 0.5 nmol 물질로 항 체의 추가 및 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
    3. 활용된 aAPC 나노 워시. 이러한 입자는 200 보다 작은 있기 때문에, 자기 열 젖은 및 마그네틱 스탠드에 넣어.
    4. 열에 입자/단백질 정지를 추가 합니다. 모든 단백질/입자를 완전히 열을 입력을 허용 합니다.
    5. 열 세 번 PBS의 0.5 mL를 추가 하 여 세척.
    6. 마그네틱 스탠드에서 열을 제거, 열, PBS의 0.5 mL을 추가 하 고 expulse 유리 섬광 유리병에 입자 aAPCs 플런저를 사용 하 여 여 elute. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 입자를 저장 합니다.
      참고: 입자는 최대 6 개월 (냉동 하지 한다) 4 ° C에서 안정적입니다. 더 높은 온도 입자의 기능을 감소 하 고 일부 입자 집계 (데이터 표시 되지 않음) 관찰 되었습니다. 보관 하지 마십시오 실 온에서 시간의 연장된 기간에 대 한로이 크게 입자의 수명 감소.

3. 인공 항 원 제시 세포 나노 입자 형광 항 체 탐지를 사용 하 여에 단백질 콘텐츠 특징.

참고: 이것은 유용한 품질 관리 생산된 인공 항 원 제시 세포 의입니다. 또한, 물질로 신호 금액 일괄 처리 및 각종 aAPC 동등한 aAPC 복용량을 생산에 사용 됩니다 (예., 다른 크기).

  1. 코팅된 aAPCs의 입자 농도 측정 합니다.
    1. 재고 솔루션에서 결합형된 입자를 사용 하 고 잘 당 100 µ L 96 잘 플랫 조직 문화 접시에 걸쳐 PBS의 솔루션에서 1:2 복용량 적정을 확인.
    2. 405에서 접시-독서 분 광 광도 계에 입자를 읽고 nm 알려진된 입자 농도를 표준 곡선을 만들기.
    3. 활용된 aAPCs의 샘플을 받아, 100 µ L의 총 볼륨 PBS에 희석 하 고는 분 광 광도 계에 읽기.
  2. 조작된 aAPCs의 샘플을 제거 하 고 형광 항 체와 얼룩.
    1. 제거 하려면 얼마나 많은 샘플을 계산 하려면 입자 표면에 항 체의 수를 견적 한다.
      참고: 이러한 기술을 입자 표면적의 약 1000 항 체 / µ m2 의 밀도 가정 합니다. 형광 검출 하 수, 약 1011 MHC-Ig 또는 CD28 분자 형광 테스트 당 총 필요 합니다.
    2. PBS에서 100 µ L까지 aAPCs의 총 볼륨을가지고, 1: 100 희석에 착 항 체를 추가 하 고 1 h 4 ° c.에 품 어
      참고: 성공적으로 사용 하는 예 항 체는 FITC 활용 된 쥐-반대로 마우스 Ig λ1, λ2, λ3 경 쇄, MHC-Ig, 그리고 아르메니아/시리아 햄스터 IgG, 안티 FITC 활용된 마우스 복제 G192-1, 반대로 마우스 CD28 감지 감지 R26 46 복제.
  3. 입자를 세척 하 고 형광 플레이트 리더에 형광을 읽고.
    1. 자석으로 (2 단계에서에서 설명)로 얼룩진된 aAPC 분수 0.5 mL의 PBS로 세 번 세척.
    2. 0.5 mL의 PBS로 세척된 aAPCs elute
    3. 읽기 단계 3.1에서 흡 광도 사용 하 여 농도를 96 잘 플랫 플레이트에 eluted aAPCs의 100 µ L를 추가 합니다.
    4. 나머지 400 µ L를가지고, 두 200 µ L aliquots로 분할 하 고 검정, 폴리스 티 렌 96-글쎄, 플랫 플레이트에서 두 개의 우물을 추가 합니다. 솔루션의 100 µ L를 복용 하 고 각 PBS의 100 µ L 적어도 4 시간을가지고 다음 잘 혼합 하 여 접시를 1:2 비율로 적정.
      참고: 평균 여러 측정에서 소음을 줄이기 위해 측정의 복제 합니다.
    5. 같은 검은 96 잘 접시에서 PBS의 적어도 12 우물 1:2 비율로 아래로 넣는 200 µ L로 잘에서 1: 200에 그것을 추가 하 여, 얼룩 하는 데 사용 하는 형광 항 체의 표준 곡선을 확인 합니다.
    6. AAPC 및 형광 성 항 체는 접시에 후 형광 플레이트 리더와 함께 접시를 읽으십시오.
  4. 입자 당 단백질의 양을 계산 합니다. 항 체 농도 알려져 있는 표준 곡선 값을 비교 하 여 항 체의 농도 결정, 항 체를 감지 하 항 체 얼룩이 지기의 1:1 비율을 가정 합니다. 다음 흡 광도 분석 결과 의해 결정 입자의 농도와 검색 된 항 체의이 농도 분할 하는 것은 입자 당 항 체의 수를 줄 것 이다.

4. 준비 된 나노 인공 항 원 제시 세포와 항 원 특정 CD8 + T 세포를 풍부 하 게.

  1. CD8 + T 세포를 격리 합니다.
    1. 뒤에 자 궁 경부 전위 isoflurane에 노출에 의해 동물을 안락사.
    2. Wildtype C57BL/6j 생쥐에서 비장 및 림프절을 제거 하 고 PBS의 해결책에. 장기를 macerate 하 고 PBS의 빈번한 세척과 살 균 70 µ m 셀 거르는 통해 셀을 elute.
    3. 비-CD8 + T 세포를 제거 하려면 자동 CD8 + T 세포 격리 키트를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
      참고: 각 항 조건 적어도 3 x 106 CD8 + T 세포를 요구 한다.
  2. CD8 + T 세포에 바인딩할 나노 aAPCs를 추가 합니다.
    1. 절연, 다음 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 2 mM EDTA는 PBS에서 100 µ L의 볼륨에 집중 한다.
    2. 수를 결정 1011 aAPC 바인딩된의 비율에 따라 계산 하 여 추가 하는 aAPCs의 펩 티 드-로드 MHC-Ig 모든 106 CD8 + T 세포에 대 한.
    3. 품 어 aAPC 입자 및 지속적인 살 균 5 mL 폴리스 티 렌에서 혼합으로 4 ° C에서 1 시간에 대 한 CD8 + T 세포 라운드 하단 튜브.
  3. 보충된 미디어와 elute 문화 CD8 + T 세포를 T 세포 성장 인자 (TCGF)를 준비 합니다.
    1. 보충된 미디어에 대 한 비 본질적인 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, 비타민 솔루션, 92 µ M 2-mercaptoethanol, 10 µ M ciprofloxacin 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 0.4 x 1 (글루타민)와 완전 한 RPMI 1640 미디어를 보충.
    2. TCGF을 하려면 프로토콜 이미 설립 하 고 참조 여기9를 수행 합니다.
      참고: TCGF는 성장 하는 데 필요한 추가 자극 신호를 제공 하는 T 세포에 필수적인 인간의 면역 cytokines의 사내 칵테일. TCGF 알려진된 T 세포 stimulatory cytokines 일리노이-2, 등에 대 한 교환 될 수 있었다 일리노이-7, 또는 IL-15; 그러나, 각각 그에 따라 T 세포 응답을 극 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 칵테일; 최적화 하지 따라서 다른 기술 농도 대 한 상담을 해야 하 고 조합 TCGF 예제와 함께 사용 하지 않으면 나열10,11.
  4. 워시와 aAPC와 CD8 + T 세포 혼합물을 풍성 하 게.
    1. 2 단계에서에서 설명한 대로 자석 입자 aAPCs 워시. 그러나, 0.5 %BSA 2 mM EDTA와 PBS 버퍼를 사용 하 여 먼저 씻고, 미디어, 보완 사용 하 여 두 번째 및 세 번째를 사용 하 여 보충 1% 미디어 TCGF.
    2. AAPCs 및 1% 보충된 미디어의 500 µ L의 농축된 CD8 + T 세포 들을 elute TCGF.
    3. 1% 보충된 미디어의 당 160 µ L에서 96 U 바닥 접시에 hemocytometer 및 격판덮개를 사용 하 여 셀 2.5 x 105 CD8 + T 세포/mL의 농도에서 TCGF.
    4. AAPCs와를 사용 하 여 분리 하는 경우만 펩타이드-MHC-Ig에 로드 표면 (co-stimulatory 신호 없음), 다음 완전 한 단계 4.5. AAPCs를 사용 하 여 두 펩 티 드 로드 MHC-Ig 표면 및 co-stimulatory 신호를 분리 하는 경우 다음 5 단계로 진행 합니다.
  5. Co-stimulatory 신호 농축된 분수를 표면에 코팅 하는 자기 입자를 추가 하 고 T 세포의 표면에 물질로 신호를 공동 클러스터를 자기 필드 추가.
    1. 농축된 분수 추가 아데닌 (또는 제어 aAPC 속성에 대 한 응용 프로그램 참조 섹션에 따라 큰) 물질로 항 체 펩 티 드 로드 MHC-Ig에는 입자의 수의.
    2. Co-stimulatory 마그네틱 입자 1 h 4 ° c.에 대 한 풍부한 CD8 + T 세포에 바인딩할 허용
    3. 1.9 cm (0.75 인치) 길이에서 두 N52 네오디뮴 디스크 자석 사이 문화 접시를 두어서 자기 필드를 추가 합니다.
      참고: 디스크 자석 N52 매우 강력한 필드가 있다. 한다 주의 둘 다 다른 제거 하기 어렵다 그리고 문화 접시에 그들을 퍼 팅 때 자석, 사이 스페이서가 그들을 저장 합니다. 최소화 하기 위해 인큐베이터의 금속 부품에 집착 자석, 50 mL 원뿔 튜브 스티로폼 용기 하단에 상단에에서 넣어.

5. 확장 하 고 준비 된 나노 인공 항 원 제시 세포와 항 원 특정 CD8 + T 세포를 감지.

  1. 습도 5%에서 96 U 바닥 잘 플레이트 aAPCs와 CD8 + T 세포를 추가 CO2, 3 일 동안 37 ° C 배양 기. 3 일에 피드 80 µ L 셀 당 2 %TCGF 장소 보충된 미디어의 인큐베이터에 다시 7 일까.
  2. 7 일에 계산에 대 한 하단 튜브 라운드 5 mL로 자극된 세포를 수확.
  3. 모두 한 번은 솔루션의 수확은, 0.05% 나트륨 아 지 드와 2 %0.5 ml PBS의 resuspend 수확된 셀 아래로 회전 FBS. Trypan 파랑으로 얼룩이 지 고는 hemocytometer에 의해 실행 가능한 세포를 계산.
  4. 항 원 특정 얼룩에 대 한 하단 튜브 라운드 두 개의 새로운 5 mL로 50000-500000 계산된 셀을 제거 합니다. 한 튜브 동족 펩 티 드 MHC 얼룩 사용 됩니다 그리고 다른 튜브 배경 얼룩 결정 하 비 동계어 얼룩에 사용 됩니다.
  5. 각 동계어를 비 동계어 튜브 100 µ L PBS의 0.05% 나트륨 아 지 드와 2%에서에서 1 µ g biotinylated MHC-Ig (를 사용 하 여 2 단계에서에서 설명 하는 기술)의 추가 allophycocyanin (APC)와 FBS-활용된 쥐 반대로 마우스 CD8a, 53-6.7 (희석 비율의 복제 1: 100) 1 h 4 ° c.에 대 한
  6. 보조 streptavidin 추가 하 고 살고 죽은 얼룩. 원심 분리를 통해 초과 biotinylated MHC-Ig PBS로 세척 한다. 다음 얼룩 1:350 비율 phycoerythrin (PE)의 모든 샘플-4 ° c.에서 15 분에 대 한 라이브/죽은 고칠 수 녹색 죽은 세포 얼룩 streptavidin 1:1000 비율을 표시
  7. 읽기 특이성 항 원 특정 셀의 수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 모든 샘플.
    1. 초과 2 차 세척 및 라이브/죽은 원심 분리에 의해 얼룩 PBS 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 2%의 150 µ L 함께 resuspend FBS 교류 cytometer에서 읽을.
  8. 수와 데이터 분석 소프트웨어와 항 원 특정 세포의 %를 확인 합니다.
    1. 항 원 특정 세포의 %를 확인 하려면 해당 순서 라이브 +, 림프 구 + (앞으로 분산형 사이드 분산형에 의해), CD8 +와 이합체 +에 다음 문을 사용 합니다. 비-동족 얼룩을 동계어를 비교 하 여 이합체 + 게이트를 확인 합니다.
    2. 이합체 + 비 동계어 MHC-Ig 얼룩에서 동족 MHC-Ig 얼룩의 비율을 빼서 샘플에 항 원 특정 셀의 비율을 결정 합니다.
    3. 항 원 특정 셀의이 백분율을 사용 하 여, 농축 및 확장에서 항 원 특정 셀 결과의 수를 양보, 셀의 수에 의해 그것을 곱하면 됩니다.
      참고: 보정 설정 흐름 cytometer에 있기 때문에이 패널에 사용 된 fluorophores와 스펙트럼 중복 해야 합니다.

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결과

성공적인 농축 및 항 원 특정 T 세포의 확장을 완료 하려면 로드 펩 티 드 MHC-Ig와 co-stimulatory 분자 해야 성공적으로 연결할 수 aAPC 입자. 입자 부착의 3 방법에 따라, 우리 성공적 활용 절차 결과 (그림 5a)에 대 한 몇 가지 대표적인 데이터를 제공 합니다. 실제로, ligand 밀도가 너무 낮은 경우 다음 되지 것입니다이 선형 간격 100 ligands 주위에 발생 하는 ?...

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토론

우리는 새로운 항 원 특정 T 세포 격리 기술 나노 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)에 기반을 만들었습니다. 나노 aAPCs 펩 티 드-로드 MHC T 세포 항 원 특정 바인딩 및 co-stimulatory 활성화 함께 활성화를 허용 하는 표면에 합니다. aAPCs 상자성, 있으며 따라서 자기장을 사용 하 여 희귀 한 항 원 특정 T 세포를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 우리는 최적화 하 고 주요 나노 크기, ligand 밀도, 그리고 ligand 선택과...

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공개

저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): NexImmune와 존스 홉킨스 대학 간의 라이선스 계약, 조나단 Schneck 대학이에 설명 된 제품의 판매에 의해 받은 로열티의 공유를 받을 권리가 있다 기사입니다. 그는 또한 NexImmune의 설립자 고 회사에서 주식을 소유 하 고. 그는 NexImmune의 이사회, 과학 자문 위원회의 회원으로 서 제공합니다. 이러한 준비의 용어를 검토 하 고 상충 정책에 따라 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다.

감사의 말

J.W.H.는 NanoBioTechnology, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 (DGE-1232825), 및 장학금 지원에 대 한 호 재단에 대 한 존스 홉킨스 연구소에서 NIH 암 나노기술 교육 센터를 감사합니다. 이 작품에서 건강의 국가 학회 (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/메릴랜드 혁신 이니셔티브, Coulter 재단 (JPS) 지원에 의해 투자 되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

참고문헌

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