איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

Summary

פרוטוקול מוצג כדי לבדוק במהירות את יציבות תרמית של חלבונים במגוון תנאי באמצעות shift תרמי מבחני וננו דיפרנציאלית סריקה fluorimetry. הכוללת שלושה ייחודי יציבות מסכי, הם לבדיקה מאגר מערכות, מלחים, תוספים, יחד עם חלבונים כדי לזהות מאגרים מתאימים עבור לימודי המבנית תפקודית.

Abstract

הפרויקט וירוס-X Horizon2020 הוקמה בשנת 2015 לחקור את virosphere של הנבחרת ביוטופים קיצוני ולגלות הרומן חלבונים ויראלי. כדי להעריך את הערך biotechnical הפוטנציאליים של חלבונים אלה, הניתוח של חלבון מבנה ותפקוד הוא אתגר מרכזי בתוכנית זו. היציבות של מדגם חלבון חיוני לספק תוצאות משמעותיות assay ולהגדיל את crystallizability של המטרות. וזמינותו shift תרמי (TSA), טכניקה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית, מוקמת כשיטה פופולרית אופטימיזציה של התנאים ליציבות חלבון בתפוקה גבוהה. ב TSAs, fluorophores מועסקים הם צבעי חיצוני, רגיש לסביבה. חלופה, טכניקה דומה היא ננו דיפרנציאלית סריקה fluorimetry (nanoDSF), אשר נשענת על קרינה פלואורסצנטית יליד חלבון. אנו מציגים כאן מסך אוסמוליט הרומן, מסך 96-מצב של תוספים אורגניים שנועדה להנחות התגבשות ניסויים באמצעות ניסויים TSA ראשוני. יחד עם pH שפותחו בעבר ומסכי מלח, בערכה של שלושה מסכי מספק ניתוח מקיף של חלבון יציבות במגוון רחב של מערכות מאגר ותוספים. השירות של המסכים הוא הפגינו TSA וניתוח nanoDSF של ליזוזים, חלבון X, חלבון היעד של הפרויקט וירוס-X.

Introduction

אנזימים biotechnologically שימושיים רבים מקורם ממקורות ויראליים, כגון הטבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז¹ וסוג ריינו-וירוס אנושי פרוטאז 3 ג (HRV 3 C)². הפרוייקט (איור 1) Horizon2020 וירוס-X³. מטרת תוכנית זו היא (א) כדי להרחיב את מגוון המאפיינים של אנזים הידוע משפחות ו- (ב) כדי לאפיין אנזימים הרומן של פונקציה עדיין לא ידוע (אנזים X). מכשור לקביעת קשיות ומבנה לחקר הגבישים ממלאת תפקיד מרכזי אפיון חלבון המטרה, בפרט במקרים אלו שבו רצפי חלבונים התפתחו מעבר זיהוי⁴. יציבות החלבון מהווה גורם מפתח בתהליך התגבשות; דוגמאות להיות הומוגני conformationally מבנית על פני תקופה של זמן טופס באיכות גבוהה, diffracting קריסטלים. יתר על כן, זה חיוני עבור מבחני פעילות החלבונים הקיימים קונפורמציה שלהם פעיל, אשר יכול גם להיות בהנחייתם של סביבה המולקולרי חיובית.

למרות הפיתוח הטכנולוגי לרשות crystallographers, חלבון התגבשות עדיין בתהליך אמפירי מהגידולים ועתירת⁵. הניסויים biophysical ראשוני כדי לשפר את יציבות החלבון בתמיסה לתת נקודת התחלה כדאי בבירור על התגבשות חלבון ולא צורכים בדרך כלל רק כמות קטנה יחסית של חלבון לדוגמה^{6,7, 8,9}. מספר רב של חלבונים היעד שילמדו בפרויקט זה מצריך גם מבחני יציבות מדרגי, תפוקה גבוהה. באחת השיטות הפופולריות ביותר עבור טרום התגבשות אפיון ביופיזיקלי של החלבונים הוא וזמינותו shift תרמי (הידוע גם בשם TSA או דיפרנציאלית סריקה fluorimetry, DSF)^10,11.

TSAs מעסיקים רגיש לסביבה הפלורסנט לאתר את תרמית דנטורציה של חלבון דגימות. צבעי נפוצות רבות יש פעילות זריחה משתנה בהתאם הקוטביות של הסביבה שלהם, לעתים קרובות מציג פלט קרינה פלואורסצנטית גבוה בסביבות הידרופובי אך שעברו שכבתה מהירה קוטבי בסביבות¹². חלבונים בדרך כלל גורמות בולטת לעלייה לצבוע פלורסצנטיות ליבות הידרופוביות שלהם הפך לסכנת במהלך דנטורציה, לעיתים קרובות ולאחריו ירידה לצבוע פלורסצנטיות בטמפרטורות גבוהות מאוד חלבונים מתחילים להפעיל עליה פונקציית צבירה (איור 2).

בעוד צבע hydrophobicity רגיש לעתים קרובות בחירה טובה עבור צבע TSA לשימוש כללי, זה יכול להיות מתאים חלבונים עם אזורים הידרופובי גדול, החשופים הממס, אשר לעתים קרובות להציג detrimentally רקע זריחה. Fluorophores עם מצבי אלטרנטיביים של פעולה (ראה דיון), אך במקום זאת ייתכן רצוי לעקוב אחר דנטורציה דרך חלבון מהותי זריחה עם nanoDSF.

שאריות טריפטופן הן קבורות באזורים פולרי של חלבון לזרוח עם פליטה לכל היותר 330 ננומטר. מדגם חלבון מתגלה, שאריות אלה הופכים חשופים של הממס קוטביים, שלהם פליטת מרבית עובר שינוי bathochromic 350 nm¹³. nanoDSF מנצלת זו משמרת בפליטה מרבי כדי לחקור על התגלגלות של מדגם חלבון ללא צורך חיצוני fluorophores¹⁴.

ממיסים עקומות מראה דנטורציה יחיד שלבים ניתן לנתח אותם על-ידי התאמת הנתונים למודל sigmoidal בולצמן. הטמפרטורה של נקודת פיתול של המעבר התגלגלות (T_m) משמש מדד כמותי של יציבות תרמית חלבון ותקן ביצוע כדי להשוות את favorability של תנאים שונים.

להמיס עקומות של החלבון אותו בתנאים שונים לפעמים בעלי דרגת הטרוגניות שיכולים לעשות התאמה sigmoidal בולצמן ישים. להבחין בכך ערכי_m T מנתונים שחורגת מהטופולוגיה עקומת קלאסי, ניתן להשתמש בשיטות מספריים כגון אלה המועסקים נאמי, פתוח TSA נתונים ניתוח תוכנית¹¹. מסגרות חלופיות תרמודינמי יכול לשמש גם כדי לנתח עקומות מורכבים יותר עם מספר השלבים דנטורציה, כגון ה-מתודולוגיה ProteoPlex¹⁵.

המסכים יציבות תוכננו לשימוש בניסויים TSA ו- nanoDSF כדי לזהות במהירות תנאים נוחים חלבון המטרה (איור 3, מסך יצירות זמינות המידע הנוסף). ניתן להשתמש במידע שנאסף עם המסכים בשלבים רבים של צינור לחקר הגבישים לרבות: לטעום אחסון; טיהור, מזעור אובדן תשואה דרך חלבון התגלגלות במהלך תהליך טיהור; assay עיצוב, חיזוק חלבון פונקציונליות בפעילות מבחני עם תרמית ייצוב מאגרי ולבסוף התגבשות, המנחה ניסויים התגבשות מעוצבת בצורה רציונלית.

בחירת בסיס מערכת מאגר מתאימים עבור מדגם חלבון חיוני; ערכי pH לא תואם יכול להוביל הביטול או דנטורציה של חלבון. עם זאת, הנוכחות של מולקולות מגובשת במשותף מאגר נפתרה במספר גדול של מבנים קריסטל רנטגן (טבלה 1) יכול להיות גם מעידה על אפקט מייצב נפרד ל pH פשוט תקנה, במקום זאת נובעת הכימי תכונות של המולקולה מאגר.

ניסח באמצעות מספר יכולות מאגרי^17,18,19 לצד מערכות אחרות בדרך כלל ביולוגית תואמי מאגר, המסך pH נועד deconvolute ההשפעה הכימית של מולקולה מאגר ב יציבות החלבון מן ה-pH בפועל של הפתרון שיתקבל. על ידי מתן שלושה ערכי pH עבור כל מערכת מאגר וסיפוח יתירות ערך pH בין מערכות שונות, המסך pH ניתן לזהות ערכי pH חיובית והן מערכות מאגר חיובית על חלבון המטרה.

המסך מלח מכיל בדרך כלל מלחי מעבדה, כמו גם chaotropes, chelants, מתכות כבדות, צמצום סוכנים. המסך יכול לתת אינדיקציה כללית בזיקה של מדגם חלבון את סביבות עם עוצמות יוניים גבוה, אך כל קבוצת משנה של תרכובות יכולים גם לספק מידע על המבנה פוטנציאלי של חלבון. לדוגמה, chelant באופן משמעותי לערער יציבות חלבון יכול להיות מעידה על חשוב מבניים מתכות בתוך המדגם. אם הדגימה גם מתייצב על ידי הקטיון מתכת בתוך המסך, זה יכול לספק נקודת התחלה מבטיחה לניסויים מבנית נוספת.

Osmolytes הם תרכובות מסיסים המשפיעים על מאפייני הסביבה שלהם osmotic. בטבע, הם יכולים לשמש בתור "מלווים כימי", אכיפת קיפול של חלבונים המתוסבכים וייצוב אותם, במיוחד במתח תנאים^20,21,22. מאפיינים אלה להפוך אותם תוספים אטרקטיבי ב קריסטלוגרפיה חלבון; שמיש כמו cryoprotectants במהלך מהקצירה קריסטל, אחסון וביטול תהליכים²³. שימוש פוטנציאלי של Osmolytes גם מרחיב הטיהור של חלבונים. חלק ניכר חומרים מבוטא ב e. coli יכול להיות לא מסיסים קשה להתאושש במצב מקורי באמצעות שיטות לטיהור סטנדרטי. Osmolytes יכול לשמש כדי לייצב. והצל מהחלבונים שברים לא מסיסים, טיהור הגוברת התשואות²⁴.

המסך אוסמוליט תוכנן באמצעות תרכובות הוקמה ב בנק מידע החלבונים ערכי²⁵ ו-²⁶ מסלולים Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated (DEOP) מסד הנתונים של iteratively ממוטב באמצעות חלבונים סטנדרטי. המסך בנוי סביב שמונה מחלקות של אוסמוליט: גליצרול, סוכרים, polyols, ללא חומרי sulfobetaines (NDSBs), betaines, שלהם מקבילים, מסוג זרחנים אורגנים, dipeptides, חומצות אמינו, ונגזרותיהן, קבוצת שונות הסופי. כל אוסמוליט קיים מספר ריכוזים המבוסס על מסיסות שלה וטווחי ריכוז יעיל להשוואה.

Protocol

1. הכנת המדגם חלבון

1. לנסח את המסכים יציבות כמו 500 aliquots µL בבלוקים 96-ובכן, לאטום לאחסון. להעביר 10 µL של כל תנאי של מסך יציבות המתאימה גם של צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי לחסוך זמן (איור 4א).
2. להכין 1 מ"ל של 1 מ ג מ ל^-1 חלבון פתרון בכל מערכת מאגר המתאים. ההרכב של מאגר המתאים משתנה עם כל מדגם חלבון, מפריד הראשון לנסות הוא פוספט נתרן 10 מ מ עם 100 מ מ NaCl, pH 7.2.
   הערה: חלבון מקובל ריכוזים משתנים מקרה לגופו, אבל ריכוז טווחים של 5 מ"ג 0.5 - מ ל^-1 בדרך כלל לייצר בקופסאת עקומות. מאגרי שתדללו מומלץ לשימוש עם המסכים יציבות להימנע מטשטשים את ההשפעות של כל תנאי. מאגר טיפוסי יצירות הם כ- 10 מ מ מאגר עם-100 מ מ NaCl.
3. אם ביצוע ניסוי TSA, להוסיף צבע כתום SYPRO הדגימה חלבון כדי ריכוז סופי של 20 x. מערבבים על-ידי היפוך או vortexing קצרה.
4. העברת µL 10 של הפתרון חלבון לבאר כל צלחת 96-ובכן המבושלות 1.1 שלב (איור 4B).
5. חותם, centrifuge את הצלחת 96-ובכן למשך 2 דקות ב x 600 g כדי להבטיח שהרכיב מדגם ומסך חלבון מעורבבים (איור 4C).
6. לאטום מחדש המסך יציבות גוש עמוק היטב ולאחסן את המסך ב 4 ° C עד 4 חודשים. לאחסן את המסך מלח באפלה, כפי רכיבים מסוימים אותםלאור.
7. אם ביצוע ניסוי nanoDSF, המשך לשלב 2. אם ביצוע ניסוי TSA, דלג לשלב 4.

2. הכנת nanoDSF של הניסוי

1. ודא הציוד נקי, תשומת לב מיוחדת כל האבק בקרבת המדף הדגימה. אם המערכת מכילה את מראה backscattering, לנקות אותו באמצעות אתנול וביו -טישו נטולת מוך.
2. פתח את המגירה לדוגמה על-ידי לחיצה על לחצן פתח מגירה . (איור 5א).
3. טען את נימי הדם עם µL כ 10 מכל קידוח של צלחת 96-ובכן על ידי נגיעה קצה אחד של נים הפתרון, ולאחר מכן למקם אותם לתוך בעלי נימי המתאימים המדף מדגם (איור 5B). להיזהר לא לזהם את האמצע של הנימים עם טביעות אצבע, וכו '., כמו זה יכול להפריע קריאות קרינה פלואורסצנטית לאורך כל הניסוי.
4. לשתק את נימי הדם עם הפס המגנטי איטום (איור 5C).

3. תכנות nanoDSF של הניסוי

1. הפעל סריקה מקדימה כדי לזהות את המיקום ואת עוצמת כל נים על ידי לחיצה על לחצן הפעל גילוי לסרוק היחידים גילוי לסרוק להגדיל או להקטין את האירוע עירור כוח. כוח הראשוני של 10% עד שיאו של כל סריקה נימי הוא בין 4,000-12,000 יחידות (איור 5D).
2. כדי להבטיח הדגימה הוא מקופל מספיק מרוכזים, בסריקה הראשונית להמיס עם שיפוע תלול טמפרטורה מומלצת. בכרטיסיה התכה לסרוק , התוכנית להמיס סריקה על-ידי הגדרת האפשרות טמפרטורה מדרון 7.0 ° C דקות^-1, טמפרטורה להתחיל עד 25 ° C, טמפרטורה סוף עד 95 ° C, ואז להשיק את nanoDSF הניסוי על-ידי הקשת את להתחיל התכה לחצן. אם וכתוצאה מכך להמיס עקומות אינם מראים נקודת פיתול לזיהוי, שקול ריכוז המדגם נוסף או לבדוק אם החלבון הוא מקופל כיאות.
3. חזור על שלבים 2.1 2.4 כדי להכין את הדגימות ניסוי מלא.
4. בכרטיסייה ' התכה לסרוק , התוכנית להמיס סריקה על-ידי הגדרת האפשרות טמפרטורה מדרון 1.0 ° C דקות^-1, טמפרטורה להתחיל עד 25 ° C, טמפרטורה סוף עד 95 ° C, ואז להשיק את nanoDSF להתנסות על ידי לחיצה לחצן התחל נמס .

4. ביצוע ניסוי TSA

1. פתח את המגירה מדגם בהקשת בחוזקה את הכניסה מצד ימין של המגירה. מניחים את המגש 96-ובכן למערכת RT-PCR עם A1 טוב בחזרה-שמאלה (איור 4D).
2. לחץ על לחצן ניסוי חדש כדי להתחיל בהגדרת ניסוי TSA.
3. בכרטיסיה מאפייני הניסוי , לחץ על האפשרות עקומת להמיס כשנשאל איזה סוג של ניסוי רוצה להקים? והאפשרות האחרת היא כאשר נשאל ריאגנטים שבו ברצונך להשתמש כדי לזהות את רצף המטרה?
4. ב התקנת צלחת / להגדיר מטרות ודוגמאות טאב, הזן את שם היעד ואז להגדיר כתב רוקס , כ'חטיף כמו אף אחד.
5. ב התקנת צלחת / הקצאת מטרות ודוגמאות טאב, להקצות כל טוב של צלחת 96-ובכן שם היעד נכנסו בשלב הקודם. בכרטיסיה אותו, להגדיר בחר את הצבע להשתמש בתור הפניה פסיבית כמו אף אחד.
6. בכרטיסיה להפעיל שיטה , למחוק שלבים עד סכום של שלושה. הגדר את הצעד הראשון 25.0 ° C, כבש שער 100%, זמן 00:05; השלב השני 95.0 ° C, כבש שער 1%, שעה 01:00; הצעד השלישי 95.0 ° C, כבש שער 100%, השעה 00:05. בוחרים באפשרות של איסוף נתונים באמצעות התפריט הנפתח איסוף נתונים או על-ידי לחיצה על סמל איסוף נתונים (איור 6).
7. הגדר את התגובה נפח לכל טוב 20 µL.
8. לחץ על לחצן התחל לרוץ כדי להתחיל את הניסוי TSA.

5. ניתוח נתונים

1. בחר אורך גל כדי להתוות עקומה להמיס עם. לניסויים nanoDSF, היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב-330 nm ו 350 nm (תואם לטריפטופן בסביבות קוטבי פולרי, בהתאמה)¹³ הוא נפוץ. עבור רוב TSAs, צבען הפליטה המרבי מתאים להתוויה עקומת להמיס (המקסימום פליטה של SYPRO כתום הוא 569 ננומטר)¹².
2. לחשב ערכי_m T של כל תנאי על-ידי קביעת את נקודות פיתול של כל עקומה להמיס. רוב מערכות nanoDSF לחשב באופן אוטומטי ערכים_m T על ידי מספריים הבידול של עקומות להמיס לאחר קירור והקפאה. אם התוכנה ששימשה אינו מחשב באופן אוטומטי ערכי_m T, ללא תשלום, אלטרנטיבית מונחה GUI תוכנה כמו נאמי¹¹ ניתן להפוך לאוטומטי ניתוח נתונים במורד הזרם עיבוד, נותן את האפשרות לייצר heatmap T summarizing_m הערכים עבור כל ניסוי 96-ובכן (ההפניה הנלווה מספק הדרכה ומשאבי עיבוד נתונים עם נאמי).
3. להשוות בין ערכי_m T של כל התנאים שנסקרו. המסכים יציבות מכילים שתי בארות בכל מסך (A1 ו- A2) המכילים רק מים. לוקח את ערכי מים בלבד תקן ביצוע מאפשר חישוב ערכי_m ΔT, פונה שיטתית שגיאות ומאפשר השוואה קלה של ייצוב אפקטים. ערכים גבוהים יותר של_m T מצביעים על התנאים ייצוב תרמית אשר מומלצים לשימוש במורד הזרם. תנאים המבטיחים מראים לעיתים קרובות מבנין הריכוז שלהם מייצב.

תוצאות

ליזוזים היה לבדיקה עם המסכים יציבות, חלבון X, חלבון המטרה בפרוייקט וירוס-X, היה לבדיקה עם המסך אוסמוליט. שני חלבונים בדרך כלל מיוצר להמיס עקומות עם מעברים דנטורציה מוגדרת בניסויים TSA והן nanoDSF (ראה מלווה איורים עבור עיקולים נציג). במקרים אחדים היכן הדגימות שעשה לא לייצר עקומות interpretable עם מעבר דנטורציה מוגדר פענוחים כפי שפגע בסימני ואני לא כלול השוואות_m T.

איור 7 מראה תוצאות המדגם ממסך מלח, המשמשים מאפייני אמוניום כלוריד לכיוון ליזוזים תרמית-. חכו רגע. יחסי תלות בין ריכוז כגון המוצג לעיל הם לעתים קרובות מעידה על תנאים המבטיחים, אבל זה יכול להיות שימושי להשוות את התוצאות של הגדלת ריכוז יון עם כמה מלחים שונים כדי לראות אם יצוב חום בדרך כלל נובע הגדלת מאגר כוח יונית או אם הנוכחות של יונים ספציפיים מקנה יציבות נוספת.

השוואה של ערכי_m T של ליזוזים עם המסך pH (איור 8) מגלה שתי פיסות מידע. ראשית, יש מגמה כללית של יציבות עם הירידה בערכי pH גבוהה יותר. שנית, ערכי_m טווח של T שהושג באמצעות מערכות מאגר שונים עם ערכי pH זהה יכול להיות משמעותי.

נתונים באיור 8 מרמז כי ההסכם בין TSA nanoDSF בניסוי זה הוא בדרך כלל טוב, אבל nanoDSF מראה נטייה לזהות ערכים מעט גבוהים יותר של_m T, T קצת יותר גדולים_ז משמרות מאשר TSA. עם זאת, מספר בארות בערכי pH מעל 8.5 להראות גדול אי-התאמות בין ערכי_m T המתקבל TSA ו- nanoDSF. ההבדלים פוטנציאל ניתן לייחס את מנגנון דנטורציה של החלבון ב pH שונים ערכים; לדוגמה, צבע hydrophobicity רגיש יכול לתת T נמוך יחסית_מ' לקרוא אם מחוזות חלבון הידרופובי הופכים חשופים הממס מהר יותר באופן משמעותי מאשר הסביבה של טריפטופן שאריות שינויים ב קוטביות.

איור 9 מראה של heatmap של ערכי_m T שהושג עם ליזוזים באמצעות המסך אוסמוליט. התנאים עם עליות_m T הגבוהה ביותר בהשוואה הבארות שליטה (בארות A1 ו- A2, המכיל מים יונים) הם בצבע כחול כהה. תנאים במיוחד ייצוב המזוהים באיור 9 כוללים גליצרול, D-בסורביטול 1 מ', hypotaurine 100 מ מ, 10 מ"מ Ala-Gly (בארות A4-A6, A9, E7, F8, בהתאמה).

איור 10 מראה של heatmap של ערכי_m T שהושג עם חלבון אקס TSA ולחשוף nanoDSF ניסויים עם המסך אוסמוליט כי הרוב המכריע של osmolytes נבדק לתת גם עלייה קטנה ב- T_m (במרחק של 1 ° C) או השפעה מזיקה על יציבות של חלבון X. בפרט, חומצה dipicolinic-ריכוז של 10 מ מ (D1 טוב) נראה denature המדגם בטמפרטורת החדר. התוצאות TSA ו nanoDSF לזהות במהירות dipicolinic חומצה כתוסף לא תואמים עבור X חלבון אשר יש להימנע בעת עבודה עם החלבון. למרות זאת, ריכוזים גבוהים של D-בסורביטול, אראבינוז (בארות A9, B9, הן ברמה 1 מ') גליצרול ואת TMAO (בארות A4-A6 ו- E1, בהתאמה) זוהו כמו ייצוב ליבות תרמית.

עבור ליזוזים, שילובים של תנאים מניב את הערכים הגבוהים ביותר של_m T של כל מסך יציבות נבדקו כדי לחקור בשילוב אפקט סינרגיסטי. איור 11 מציג עלייה כללית ערכי_m T רכיבים יותר מערכת מאגר (pH, מלח ו אוסמוליט) נוספים. במקרה של MES, אמוניום סולפט ו D-בסורביטול, T_m להגדיל כל כך גדולים כמו 10 ° C ניתן לראות מתי כל הרכיבים קיימים לעומת MES לבד. איור 11 מראה כי אפקט סינרגיסטי מורגש יכול להתרחש כאשר רכיבים בודדים של מאגר ממוטב, בשילוב עם המסכים יציבות.

בנימה כללית יותר באיור 11 מדגימה גם את סדר הגודל של ערכי_m ΔT זה יכול להיות שנצפו TSA ו nanoDSF ניסויים. סדר הגודל של ΔT_מ' בר השגה משתנה באופן משמעותי בהתאם למערכת חלבון, אך כל ערך_מ' ΔT מסביב ומעל 5 ° C הוא בדרך כלל מעיד על השפעה מיטיבה ייצוב.

איור 1 : Bioprospecting. דוגמה מהאוסף סביבה קיצוניים בפרוייקט וירוס-X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: מפרטים טכניים TSA- דוגמה מוערת של עיקול להמיס טיפוסי המתקבל ניסוי TSA. עקום זה הוא אופייני הקלאסי "שתי מדינות" חלבון התגלגלות, שבו האוכלוסייה המדגם המעברים מ מקופל ל denatured בלי לזיהוי intermediates מקופלת חלקית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : יציבות מסכי זרימת עבודה. זרימת עבודה סטנדרטי של מאגר אופטימיזציה באמצעות המסכים יציבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : זרימת העבודה של תקן TSA להתנסות עם המסכים יציבות. משמאל לימין: (א) aliquots Pipetting של המסכים יציבות לתוך צלחת 96-ובכן. (ב) pipetting חלבון לדוגמה עם תיוג הפלורסנט לתוך הצלחת. (ג) איטום את הצלחת לפני צנטריפוגה. (ד) הצבת את הצלחת לתוך מערכת RT-PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: זרימת העבודה של ניסוי תקן nanoDSF. (א) פותח את נימי טעינת ארון תקשורת. (ב) טעינה הנימים לתוך ארון התקשורת. (ג) שיתק את נימי הדם עם הפס המגנטי איטום. (ד) תכנות ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 : ממשק משתמש למערכת RT-PCR- ניסוי TSA לתיכנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7 : מלח נתונים לדוגמה המסך. (א) היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב 350 nm לעומת 330 nm עבור ניסוי nanoDSF ללא תווית עם ליזוזים. מדגמים מקבילים הבארות C7-C12 של המסך מלח (1.5 M - 0.2 מ' אמוניום כלוריד). ערכים מחושבים_m T עבור כל תנאי הם יונחו על העלילה. (ב) סיכום של ערכי_m T מחושב מן הנתונים שהוצגו ב- איור 7א. עוצמות קרינה פלואורסצנטית (ג)-590 nm עבור ניסוי TSA באמצעות ליזוזים עם צבע הכתב רגיש hydrophobicity. כמו איור 7א, תואמים הדגימות הבארות C7-C12 של המסך מלח. ערכים מחושבים_m T הם יונחו על הגרף. (ד) סיכום של ערכי_m T מחושב מנתונים נוכח איור 7C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8: pH מסך נתוני דגימה. סיכום של משמרות_m T שהושג עם ליזוזים ואת המסך pH. כל נקודה מייצג מצב עצמאית; נקודות על ערך ה-pH זהה הן של מערכות ה-pH באותו מאגר שונים. T_m משמרות מחושבים באופן יחסי שליטה T_m של C ° 68.0 לניסויים TSA ו- 71.9 ° C לניסויים nanoDSF. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 9 : אוסמוליט מסך נתוני דגימה (ליזוזים). סיכום של ערכי_m T המתקבל ניסוי nanoDSF ללא תווית עם ליזוזים, כל טוב של המסך אוסמוליט. T_m ערכים (° C) לעומת הבארות A1 ו- A2, אשר מכילים מים כפקד. Heatmap נוצר בהתבסס על ערכי_m ΔT בהשוואה (כחול מציין עלייה_m T ואדום ירידה_m T). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 10: אוסמוליט מסך נתוני דגימה (חלבון X). (א) סיכום של ערכי_m T המתקבל ניסוי nanoDSF ללא תווית עם חלבון X ואת המסך אוסמוליט. ערכי_m T. לעומת בארות A1 ו- A2 מכילים מים כפקד. Heatmap נוצר בהתבסס על ערכי_m ΔT בהשוואה (כחול מציין עלייה_m T ואדום ירידה_m T). (ב) nanoDSF עקומות המתקבל A9 טוב (1 M D-בסורביטול, ייצוב מצב), D1 (חומצה dipicolinic 10 מ מ, תנאי חמוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 11 : מאגר אופטימיזציה השפעה על T_m. ערכי_m TSA T של ליזוזים בשילוב עם התנאים של כל מסך כי המוענקת העלייה הגדולה T_m. 100 מ מ חומצה אצטית, pH 4.2 ו- 100 מ מ MES, pH 5.6, נבחרו כמערכות מאגר, לצד 1.5 M אמוניום סולפט כמו המלח. אוסמוליט ריכוזים היו זהים לאלו שנמצאו על המסך אוסמוליט: 10 מ מ Ala-Gly, 1 מ' ד'-בסורביטול, 50 מ מ L-ליזין ו 100 מ מ hypotaurine. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן של משכפל שש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מולקולה	קוד PDB	התדירות של שיתוף crystallisation
פוספט	PO4	5132
אצטט	מעשה	4521
-(N-Morpholino) 2-Ethanesulfonic חומצה (MES)	MES	1334
טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס)	רים	1155
Formate	FMT	1072

טבלה 1: סיכום של מאגר מולקולה התגבשות שיתוף תדירות ערכי חלבון בנק מידע (PDB). נתונים שהושגו דרך PDBsum¹⁶ מתוך סך של 144,868 ערכים (נכון 12-5-18).

מידע משלים- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

משלים טבלה 1- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

משלים בטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

משלימים בלוח 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

Discussion

היבטים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים את צנטריפוגה הצעד הנכון איטום המשטח 96-ובכן לניסויים TSA (שלב 1.5). צנטריפוגה מבטיחה כי התנאי חלבון לדוגמה ומסך מגע ומערבבים. בנוסף, אם צלחת unsealed משמש עבור ניסוי TSA, יש סיכון משמעותי של הממס מתאדים לאורך כל הניסוי, גורם לעלייה בריכוז לדוגמה, ומגדילים את הסיכוי צבירת חלבון מוקדמת.

TSAs, nanoDSF נתונות מגוון רחב של דוגמאות חלבון; הרוב המכריע של דגימות יכול לייצר עקומות להמיס interpretable עם צבע הכתב מבוסס-hydrophobicity או דרך nanoDSF נטול צבע. אם מקורות קרינה פלואורסצנטית רגילה אינם מתאימים את החלבון, השינוי הפשוטה בפרוטוקול זה יכול להיחקר הוא הבחירה של fluorophore. מספר צבעי חלופי יכול להיות מתאים TSA ניסויים. דוגמאות N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), תרכובת הזה שזוהר לאחר מגיבים על תיול²⁷, ו- 4 - julolidine (dicyanovinyl) (DCVJ), מתחם זה משתנה שלה זריחה על בסיס קשיחות של הסביבה, הגדלת שלה פלורסצנטיות כמדגם חלבון מתגלה^28,29 (לצבוע האחרון דורש לעתים קרובות ריכוזים גבוהים של המדגם).

שיטות אלטרנטיביות של ניתוח עקומת להמיס זמינות אם T_m אינה מחושבת באופן אוטומטי על ידי תוכנת מכשיר. אם הנתונים הוא הומוגני, רק צעד דנטורציה ניכרת בפניות להמיס dataset קטום יכול להיות מותאם של בולצמן סיגמואיד עם המשוואה הבאה:

כאשר F הוא עוצמת קרינה פלואורסצנטית בטמפרטורה T, F_min ו- F_{מקסימום} עוצמות קרינה פלואורסצנטית לפני, לאחר המעבר דנטורציה, בהתאמה, T_m היא ה טמפרטורה האמצע של המעבר דנטורציה ו- C הוא המדרון T_m. אמנם שיטה זו פועלת היטב עבור תהליכים דנטורציה בשני שלבים פשוטים, זה מתאים עבור עיקולים להמיס מורכבים עם מעברים מרובים.

אחד היתרונות הגדולים של TSA הוא הנגישות שלה; ניסויים TSA יכול להתבצע בכל מערכת RT-PCR עם מסננים באורכי גל מתאים עבור לצבוע פלורסצנטיות המועסקים. זה יחד עם עלות נמוכה של חומרים מתכלים, להקל על פעולת וכמות נמוכה יחסית של חלבון צריך, לגרום TSA טכניקה יקר עבור מגוון רחב של סולמות הפרויקט, הן בתעשייה והן אקדמיה.

כמו גם המציין תנאי מאגר חיובית, המסכים להכיל כמה בארות אשר עשוי לתת רמזים הנוכחות של מתכות מבניים בתוך חלבון לדוגמה. בארות אשר עשוי להיות עניין מיוחד במסך מלח הם G6 ו- G7, אשר מכילים EDTA 5 מ"מ, 5 מ"מ EGTA, בהתאמה. משמעותית הקשורה תרמי בבארות אלה יכול להיות מעידה על יונים מתכתיים חשוב חלבון זה הן מבודדות על ידי chelants. תרכובות בתוך המסך אוסמוליט יכול גם פוטנציאל לספק רמזים לפונקציה של חלבון. רבים של תרכובות של המסך שייכים מחלקות של מולקולה כי הם סובסטרטים נפוצות של אנזימים. לדוגמה, ייצוב כללי המוענקת על ידי saccharides (קיים בבארות A11-B10) עבור ליזוזים ניתן לייחס דמיון מבני שלהם הוקמה סובסטרטים של האנזים, N-acetylglucosamine oligomers³⁰.

ניתן להתאים ללמוד אינטראקציות חלבון-ליגנד גם הפרוטוקולים TSA ו- nanoDSF שפורטו לעיל. ליגנדים שקושרים במיוחד כדי חלבון יכול להגביר את יציבות תרמית על ידי החדרת אינטראקציות חדשות בתוך המתחם. תפנית חיובית למינון חלבון T_m הוא סימן מבטיח של אינטראקציה חלבון מוצלחת-ליגנד. המהירות, התפוקה ואת עלות נמוכה של הקרנת ספריות מתחם עם TSAs הפכה שיטה מאוד פופולרי בגילוי תרופות בשלב מוקדם.

אופטימיזציה של התנאים מאגר של חלבונים היעד ואת מתחמי ליגנד שלהם יכול להיות חיוני להצלחה של פרוייקט, כפי דוגמאות רבות בספרות להדגים^31,32,33,34. עם assay טיפוסי לוקח מתחת לגיל 2 h כולל הגדרת הזמן, TSAs, nanoDSF בשילוב עם מסכי יציבות מייצגים טכניקה מהירה, זולה עבור מאגר אופטימיזציות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1).