Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

Özet

Bir iletişim kuralı hızla termal kayması deneyleri ve nano fluorimetry tarama fark koşulları çeşitli proteinler termal kararlılığını sınamak için sunulmaktadır. Tampon sistemleri, tuzları ve katkı maddeleri, birlikte üç benzersiz istikrar ekran, oluşan uygun işlevsel ve yapısal çalışmalar arabelleklerini tanımlamak için protein ile denetlesinler.

Özet

Horizon2020 virüs-X Projesi seçilen aşırı Habitat virosphere keşfetmek ve yeni viral proteinler keşfetmek için 2015 yılında kurulmuştur. Bu proteinler, protein analizi potansiyel biyoteknik değerini değerlendirmek için yapıları ve işlevleri olan bu programda merkezi bir meydan okuma. Protein örnek kararlılığını hedeflerinden crystallizability artırmak ve anlamlı tahlil sonuçları sağlamak için önemlidir. Termal üst karakter tahlil (TSA), bir floresan tabanlı teknik koşullar protein istikrar içinde yüksek üretilen iş için en iyi duruma getirme için popüler bir yöntem olarak kurulur. TSAs, meslek fluorophores dışsal, çevreye duyarlı boyalar vardır. Alternatif, nano protein yerli floresans dayanır fluorimetry (nanoDSF), tarama fark benzer tekniğidir. Burada bir roman osmolyte ekran, organik katkı kristalizasyon denemeler ön TSA deneyler yoluyla rehberlik için tasarlanmış bir 96-koşul ekran mevcut. Daha önce geliştirilen pH ve tuz ekranlar ile birlikte üç ekran dizi protein istikrar tampon sistemleri ve katkı maddeleri geniş bir alanda kapsamlı bir çözümleme sağlar. Belgili tanımlık yarar ekranlar lizozim ve Protein X, virüs-X projenin hedef protein TSA ve nanoDSF analizinde gösterilmiştir.

Giriş

Birçok biotechnologically yararlı enzimler viral kaynaklardan gibi tütün etch virüs (TEV) proteaz¹ ve insan rhinovirus 3 C (HRV 3 C) proteaz²yazın kaynağı. Horizon2020 virüs-X (Şekil 1) projesi³. Bu program (a) bilinen enzim aileler özelliklerini aralığı genişletmek için ve (b) henüz bilinmeyen işlev (enzim X) roman enzimler karakterize etmek için amaçtır. Crystallographic yapı belirlenmesi hedef protein karakterizasyonu, çok önemli bir rol özellikle protein sequences tanıma⁴nerede geliştiğini bu durumlarda çalış. Protein istikrar kristalizasyon sürecinde önemli bir faktördür; örnekleri formu yüksek-nitelik, kristaller diffracting için bir süre doğurmak homojen ve yapısal olarak sağlam olması gerekir. Ayrıca, bu da olumlu bir moleküler ortamı tarafından kolaylaştırılabilir aktif onların biçimsel proteinler mevcut aktivitesi deneyleri için esastır.

Crystallographers için mevcut teknoloji geliştirmede rağmen protein kristalizasyon zaman alıcı ve emek yoğun ampirik işlemi⁵kalır. Ön biyofiziksel deneyler protein istikrar çözüm geliştirmek için açıkça daha iyi başlangıç noktası protein kristalizasyon için vermek ve genellikle nispeten az miktarda protein örnek^{6,7tüketmek, 8,9}. Bu projede belirlenmesi için hedef proteinler çok sayıda da ölçeklenebilir, yüksek üretilen iş istikrar deneyleri gerektirir. Proteinler öncesi kristalizasyon biyofiziksel karakterizasyonu için en popüler yöntemlerden biri termal üst karakter tahlil (TSA veya diferansiyel fluorimetry, DSF tarama olarak da bilinir)^10,11.

TSAs protein örneklerinin termal denatürasyon izlemek için bir çevreye duyarlı floresan boya istihdam. Birçok yaygın olarak kullanılan boyalar değişken floresans etkinliğe bağlı olarak sık sık hidrofobik ortamlarda yüksek floresans çıktısını görüntüleme ama hızlı kutup ortamları¹²' Şoklama geçiren çevrenin polarite sahip. Hidrofobik onların göbek denatürasyon, proteinler (Şekil 2) toplamak için Başlarken genellikle boya floresans çok yüksek sıcaklıklarda düşüş takip sırasında maruz olur gibi proteinler belirgin artışlar boya floresans genellikle neden.

Bir hydrophobicity duyarlı boya kez bir genel kullanımlı TSA boya için iyi bir seçim olsa da, proteinler ile çoğunlukla yapmayacaktır yüksek arka plan floresans görüntüler büyük, solvent maruz hidrofobik bölgeler için uygun olabilir. Eylem alternatif modları ile fluorophores (konuya bakın) vardır, ancak bunun yerine denatürasyon içsel protein floresan nanoDSF ile üzerinden izlemek için arzu olabilir.

Bir protein, nonpolar bölgelerinde gömülü olan triptofan artıkları belli bir emisyon en fazla 330 ile nm. Protein örnek yaşanıyor ve bu polar bir çözücü maruz olur gibi kendi emisyon en fazla 350 nm¹³bathochromic shift uğrar. nanoDSF emisyon bir protein örnek dışsal fluorophores¹⁴gerek kalmadan unfolding soruşturma için en fazla bu vardiyada patlatır.

Gösteren tek denatürasyon adımları-ebilmek var olmak çözümlemek veri Boltzmann sigmoidal modeline yaklaştırarak eğrileri eritebilir. Açılım geçiş (T_m) dönüm noktası sıcaklığında niceliksel ölçüsüdür protein termal kararlılık ve bir kriter farklı koşullar favorability karşılaştırmak için kullanılınır.

Erime eğrileri farklı koşullarda aynı proteinin bazen sigmoidal uygun bir Boltzmann olanaksız yapabilirsiniz heterojenite derecesine sahip. Klasik eğrisi çoğaltmasından sapma veri T_m değerleri ayırt etmek, sayısal yöntemler namı, bir açık kaynak TSA veri analiz programı¹¹çalışan gibi kullanılabilir. Alternatif termodinamik çerçeveler de ProteoPlex metodoloji¹⁵gibi birden çok denatürasyon adımlarla daha karmaşık eğriler analiz etmek için kullanılabilir.

İstikrar ekranlar TSA ve nanoDSF deneylerde kullanmak için hızla bir hedef protein için uygun koşulları tanımlamak için tasarlanmıştır (Şekil 3, ekran besteleri vardır ek bilgi kullanılabilir). Ekranları ile toplanan bilgi-ebilmek var olmak kullanılmış crystallographic boru hattı da dahil olmak üzere birçok aşamalarında: örnek depolama; Arıtma, arıtma işlemi sırasında unfolding protein ile verim kaybını en aza; Tasarım, termal arabellekleri ve nihayet mantıklı bir şekilde tasarlanmış kristalizasyon denemeler rehberlik kristalizasyon, sabitleme ile faaliyet deneyleri işlevindeki protein takviye tahlil.

Protein örnek için uygun arabellek sistem temel seçimi çok önemlidir; uyumsuz pH değerlerini devre dışı bırakma veya bir proteini denatürasyon yol açabilir. Ancak, çok sayıda X-ray kristal yapıları (Tablo 1) çözüldü Co kristalize arabellek molekülleri varlığını da göstergesi teskin etkisinin, basit pH yönetmeliğine ayrıdır ve bunun yerine kimyasal kaynaklanıyor olabilir şekil-in tampon molekül.

Birkaç iyi'nın arabellekleri^17,18,19 yanında diğer yaygın olarak biyolojik olarak uyumlu arabellek sistemleri kullanarak formüle, pH ekran üzerinde bir arabellek molekülünün kimyasal etkisi deconvolute için tasarlanmıştır protein istikrar üzerinden elde edilen çözüm gerçek pH. Her tampon sistemi için üç pH değerleri sağlama ve pH değeri artıklık farklı sistemler arasında birleştiren, pH ekran olumlu tampon sistemleri için bir hedef protein ve uygun pH değerleri tanımlayabilirsiniz.

Tuz ekran sık laboratuvar tuzları yanı sıra chaotropes, chelants, ağır metaller ve azalan bakiyeli aracıları içerir. Ekranda yüksek iyonik güçlü ile ortamlara benzeşme protein örneği genel bir göstergesi verebilir ama her alt grup bileşikler de potansiyel bir protein yapısını temel bilgiler sağlayabilir. Örneğin, önemli ölçüde bir protein istikrarsızlaştırma bir chelant örnek içinde önemli yapısal metallerin göstergesi olabilir. Örnek da güçlü bir metal ba * ekran içinde tarafından stabilize, bu daha fazla yapısal deneyler için umut verici bir başlangıç noktası sağlar.

Osmolytes çevreleri ozmotik özelliklerini etkileyen çözünür bileşiklerdir. Doğa, onlar "kimyasal chaperones düzensiz protein katlama ve onları, özellikle stres koşulları^20,21,22sabitleme uygulayan", olarak kullanılabilir. Bu özellikleri onları protein kristalografisi çekici katkı yapmak; Kristal hasat sırasında cryoprotectants olarak kullanılabilir, montaj ve depolama işler²³. Osmolytes potansiyel kullanım de proteinlerin saflaştırılması uzatır. Rekombinant proteinlerin E. coli içinde önemli bir bölümünü çözünmez ve standart arıtma yöntemleri kullanarak yerel durumunu kurtarmak zor olabilir. Osmolytes stabilize ve proteinler çözünmez kesirler gelen kurtarma için kullanılabilir, artan arıtma²⁴verimleri.

Osmolyte ekran kurulan bileşikler Protein veri Bankası girişleri²⁵ ve Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated yolları (DEOP)²⁶ veritabanı mevcut kullanılarak tasarlanmış ve yinelemeli olarak standart proteinler kullanarak optimize edilmiştir. Ekran osmolyte sekiz alt sınıflarını inşa edilmiştir: gliserol, şeker ve polyols, deterjan sulfobetaines (NDSBs), betaines ve kendi analogları Organofosfatlar, dipeptides, amino asit ve türevleri ve son çeşitli grup. Her osmolyte çözünürlük ve etkili konsantrasyon aralıkları ürününü karşılaştırma listesine göre birden fazla konsantrasyonlarda bulunur.

Protokol

1. Protein örnek hazırlanması

1. 96-şey bloklar halinde 500 µL aliquots olarak istikrar ekranlar formüle ve depolama için mühür. Her durumun bir istikrar ekranın 10 µL zaman (Şekil 4A) kazanmak için bir çok kanallı pipet kullanarak iyi bir 96-şey tabak karşılık gelen içine aktarın.
2. 1 mL yaklaşık 1 mg mL^-1 protein çözeltisi bir uygun tampon sistemi hazırlamak. Her protein örneği ile uygun bir arabellek bileşimi değişir, denemek için iyi bir ilk arabellek 10 mM sodyum fosfat ile 100 mM NaCl, pH 7.2 iken.
   Not: Kabul edilebilir protein konsantrasyonları duruma göre değişir, ancak 0,5 - 5 mg mL^-1 konsantrasyon aralığı genellikle analyzable eğrileri üretmek. Seyreltik arabellekleri istikrar ekranları kullanılmak üzere her koşul etkileri maskeleme önlemek için tavsiye edilir. Tipik arabellek besteleri yaklaşık 100 mM NaCl ile yaklaşık 10 mM tampon vardır.
3. TSA deneme gerçekleştirme, SYPRO Orange boya 20 x son bir konsantrasyon protein örneğine ekleyin. İnversiyon veya kısa vortexing karıştırın.
4. Adım 1.1 (Şekil 4B) hazırlanan 96-şey plaka her kuyuya protein çözüm 10 µL aktarın.
5. Mühür ve 96-şey plaka için protein örnek ve ekran bileşeni (Şekil 4C) karıştırılır emin olmak için 600 x g , 2 dk santrifüj kapasitesi.
6. İstikrar ekran derin kuyu blok yeniden mühürle ve 4 aya kadar ekran 4 ° C'de depolayın. Bazı bileşenler ışığa duyarlı tuz ekranın karanlıkta, depolamalısınız.
7. NanoDSF deneme gerçekleştirme, adım 2 devam. TSA deneme gerçekleştirme, adım 4'e geçin.

2. bir nanoDSF deneme hazırlanması

1. Ekipman herhangi bir toz örnek raf yakınındaki özel önem temiz olduğundan emin olun. Sistem backscattering bir ayna varsa, etanol ve hav bırakmayan bir doku kullanarak temizleyin.
2. Örnek çekmece Açık çekmece düğmesine basarak açın. (Şekil 5A).
3. Yaklaşık 10 µL ile kılcal 96-şey plaka her kuyudan kılcal dokunaklı bir ucunu tarafından çözüm içine yüklemek, sonra onları örnek raf (Şekil 5B) karşılık gelen kılcal sahipleri yerleştirin. Orta parmak, vbkapiller kirletmek değil dikkatli olun., bu deney boyunca floresans okuma ile engelleyebilir.
4. Manyetik mühürleme şeridi (Şekil 5C) ile kılcal hareketsiz.

3. bir nanoDSF deneme programlama

1. Bulmak belgili tanımlık konum ve Keşif tarama sekmesini artış Keşif tarama Başlat düğmesine basarak her kılcal yoğunluğu veya bir ilk güç kadar % 10 dan olay uyarma gücü azaltmak için bir ön tarama Başlat kapiller her tarama 4.000-12.000 adet (Şekil 5D) tepedir.
2. Örnek katlanmış ve yeterince konsantre emin olmak için bir ilk eritebilir tarama dik bir sıcaklık değişimi ile önerilir. Erime tarama sekmesinde bir erime 7.0 ° C min^-1, Başlatmak sıcaklık 25 ° c ve Son sıcaklığı 95 ° c Sıcaklık yamaç seçeneği ayarlayarak inceden inceye gözden geçirmek o zaman nanoDSF denize indirmek program deneme basarak Erime başlar düğmesi. Çıkan eritmek Eğer eğriler tespit dönüm noktası göstermek değil, örnek daha fazla konsantre veya protein düzgün katlanmış kontrol düşünün.
3. 2.1-2.4 örnekleri için tam bir deneme hazırlamak için adımları yineleyin.
4. Erime tarama sekmesinde bir erime 1.0 ° C min^-1, Başlatmak sıcaklık 25 ° c ve Son sıcaklığı 95 ° c Sıcaklık yamaç seçeneği ayarlayarak inceden inceye gözden geçirmek o zaman nanoDSF denize indirmek program deneme basarak Erime başlamak düğme.

4. bir TSA deneme gerçekleştirme

1. Örnek çekmece çekmece sağ tarafındaki Girintiyi sıkıca basarak açın. 96-şey tepsi RT-PCR sistemi geri soldaki (Şekil 4D) de A1 ile yerleştirin.
2. TSA deney ayarlamadan için Yeni deneme düğmesini tıklatın.
3. Deneme özellikleri sekmesindeki sorulduğunda Eritmek eğrisi seçeneği tıklatın ne tür bir deney kurmak istiyor musunuz? ve sorulduğunda diğer seçenek hangi reaktifler hedef sıra algılamak için kullanmak istiyor musunuz?
4. İçinde plaka Kur / hedefleri tanımlamak ve örnekleri sekme, bir hedef ad girin sonra muhabir ROX ve içki noneolarak ayarlayın.
5. İçinde plaka Kur / hedefleri ve örnekleri atamak sekmesinde, her şey 96-şey plaka önceki adımda girdiğiniz hedef adı atayın. Aynı sekmede Pasif referans olarak kullanmak üzere boya seçin Noneayarlayın.
6. Kadar toplam üç Yöntem çalıştırma sekmede adımları silin. İlk adım 25,0 ° C'ye, rampa oranı % 100, saat 00:05 ayarla; 95.0 ° C, rampa oranı % 1, saat 01:00 ikinci adıma; 95.0 ° c, rampa oranı % 100, üçüncü adım zaman 00:05. Veri topla aşağı açılan menüsünü kullanarak veri toplamak seçin veya Veri toplama simgesi (Şekil 6) basarak.
7. Tepki birim başına iyi 20 µL için ayarlayın.
8. TSA deney başlamak için Başlat Çalıştır düğmesine basın.

5. veri analizi

1. Bir erime eğrisi ile çizilecek bir dalga boyu seçin. NanoDSF deneyleri, 330 koyulukları floresans oranı için nm ve 350 nm (Triptofan nonpolar ve kutup ortamlarda sırasıyla karşılık gelen)¹³ sık kullanılan. Çoğu TSAs için maksimum boya emisyon eritebilir eğriyi çizmek için uygundur (569 emisyon maksimum SYPRO portakal olduğunu nm)¹².
2. Her koşul T_m değerleri her eritebilir eğrinin dönüm noktalarının belirlenerek hesaplayın. En nanoDSF sistemleri T_m değerleri sayısal farklılaşma eritebilir eğrileri sonra veri toplama tarafından otomatik olarak hesaplayın. Kullanılan yazılım otomatik olarak T_m değerleri hesaplamıyorsa, ücretsiz, alternatif GUI tabanlı yazılım namı¹¹ gibi otomatikleştirebilirsiniz veri analizi ve aşağı akım işleniyor, bir heatmap özetleme T_m üretmek için seçenek vermek tüm değerleri (eşlik eden başvuru sağlar rehberlik ve kaynakları için veri işleme namı ile) 96-iyi deneme.
3. İncelenen tüm koşullardan T_m değerleri karşılaştırın. İstikrar ekranlar sadece su içeren iki kuyu içinde her perde (A1 ve A2) içerir. Bir kriter olarak sadece su değerleri alarak sistematik hatalar adresleme ve etkileri sabitleme kolay karşılaştırma izin ΔT_m değerleri, hesaplama sağlar. Daha yüksek T_m değerleri aşağı akım kullanım için önerilen termal teskin koşulları belirtin. Gelecek vaat eden koşulları kez onların sabitleme bir konsantrasyon bağımlılığı göster.

Sonuçlar

Lizozim kararlılık perde ile denetlesinler ve Protein X, virüs-X projede hedef protein osmolyte ekran ile denetlesinler. Genellikle üretilen her iki proteinler eğrileri TSA, nanoDSF deneyleri (bkz: temsilcisi eğrileri rakamlarını eşlik eden) açıkça tanımlanmış denatürasyon geçişler ile eritin. Nerede değil üretmek yorumlanabilir eğrileri ile tanımlanmış denatürasyon geçiş yaptım örnekleri denatüre ve eklenmemiş T_m karşılaştırmaları yorumlanır birkaç durumda.

Şekil 7 örnek sonuçlarını tuz ekranından, amonyum klorür lizozim doğru termal dengelenmekte özelliklerini örnekli gösterir. Konsantrasyon bağımlılıklar gibi yukarıda gösterilen kez gelecek vaat eden koşulları göstergesi olmakla birlikte, termal istikrar genellikle kaynaklanmaktadır Eğer görmek için birkaç farklı tuzları ile iyonu konsantrasyonu artırmak sonuçları karşılaştırmak yararlı olabilir bir arabellek iyonik gücü artış veya belirli iyonları varlığı ek istikrar confers.

T_m değerleri ile pH perde (Şekil 8) lizozim, karşılaştırma iki bilgi parçasına ortaya koymaktadır. İlk olarak, azalan pH değerleri ile istikrar artan genel bir eğilim vardır. İkinci olarak, farklı tampon sistemleri aynı pH değerlerinde elde edilen aralığı T_m değerler önemli olabilir.

Şekil 8 verilerde TSA ve nanoDSF Bu denemede genellikle iyidir ama nanoDSF biraz daha yüksek T_m değerleri tanımlayan eğilimi gösterir ve biraz daha büyük T_m TSA vardiya öneriyor. Ancak, bazı kuyular üzerindeki 8.5 pH değerleri ile TSA ve nanoDSF elde edilen T_m değerler arasında büyük farklılıklar göstermektedir. Farklılıklar potansiyel olarak farklı pH değerlerinde proteini denatürasyon mekanizmasının atfedilen olabilir; Örneğin, bir hydrophobicity duyarlı boya bir protein hidrofobik bölgeler için solvent triptofan artıkları değişiklikleri ortamının daha önemli ölçüde daha hızlı polarite içinde maruz olur Eğer okuma bir nispeten düşük T_m verebilir.

Şekil 9 bir heatmap lizozim osmolyte ekran kullanarak elde T_m değerleri gösterir. Denetim wells (deiyonize su içeren wells A1 ve A2,) göre en yüksek T_m artar koşullarla koyu mavi renkte görünür. Şekil 9 ' da tanımlanan özellikle teskin koşulları gliserol, 1 M D-sorbitol, 100 mM hypotaurine ve 10 mM Ala-Gly (A4-A6, A9, E7 ve F8, sırasıyla kuyuları) içerir.

Şekil 10 T_m Protein X. TSA ile elde edilen değerler bir heatmap gösterir ve test osmolytes çoğunluğu ya küçük bir artış T_m (içinde 1 ° C) vermek veya zararlı bir etkisi var nanoDSF deneyler Osmolyte ekran ile ortaya Protein x'nin istikrarı. Özellikle, dipicolinic asit konsantrasyonu 10 mM (iyi D1) adlı örnek oda sıcaklığında denatüre görünüyor. TSA ve nanoDSF sonuçları hızlı bir şekilde dipicolinic asit protein ile çalışırken kaçınılması gereken Protein X için uyumsuz bir katkı tanımlayın. D-sorbitol ve arabinoz (kuyu A9 ve B9, her ikisi de 1 M) yine de, yüksek konsantrasyonda yanı sıra gliserol ve TMAO (kuyuları A4-A6 ve E1, sırasıyla) termal-sabitleme olarak tespit edilmiştir.

Lizozim için en yüksek T_m değerleri her istikrar ekrandan oluşturan koşullar kombinasyonları bir sinerjik Birleşik etkisi için soruşturma için test edildi. Şekil 11 daha fazla arabellek sistem bileşenlerinin T_m değerleri genel bir artış gösterir (pH, tuz ve osmolyte) eklenir. MES söz konusu olduğunda, amonyum sülfat ve D-sorbitol, T_m büyüklüğünde 10 ° C tüm bileşenleri mevcut olduğunda MES yalnız göre gözlenen gibi artırın. Şekil 11 bir arabellek bileşenleri tek tek en iyi duruma getirilmiş ve kararlılık perde ile kombine göze çarpan bir sinerjik etkisi oluşabilir gösterir.

Daha genel bir kayda göre Şekil 11 da TSA ve nanoDSF deneyler gözlenen ΔT_m değerleri büyüklüğünü göstermektedir. Önemli ölçüde protein sistemi temelinde ΔT_m ulaşılabilir büyüklüğü değişir ama herhangi bir ΔT_m değer etrafında ve 5 ° C üzerindeki kez yararlı bir teskin etkisini göstergesidir.

Resim 1 : Bioprospecting. Virüs-X Proje aşırı bir ortamda örnek koleksiyonundan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: TSA şematik. Ek açıklama eklenen örnek bir TSA deneyden elde edilen bir tipik eritebilir eğrisi. Bu eğri klasik "iki devletli" protein unfolding özelliğidir, nerede üzerinden örnek nüfus geçişler için denatüre olmadan tespit kısmen katlanmış ara ürün katlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : İstikrar iş akışı ekranları. Standart iş akışı arabelleği istikrar ekranları kullanarak en iyi duruma getirme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : İş akışı TSA deneme kararlılık perde ile bir standart. Soldan sağa: 96-şey plaka içine istikrar ekranlarının (A) Pipetting aliquots. (B) protein örnek plaka içine floresan boya ile pipetting. (C) sızdırmazlık Santrifüjü önce plaka. (D) plaka bir RT-PCR sistemi yerleştirerek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: iş akışını bir standart nanoDSF deneyi,. (A) raf yükleme kılcal açılıyor. (B) kılcal raf yükleniyor. (C) manyetik mühürleme şeridi ile kılcal immobilizing. (D) programlama bir deney. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : RT-PCR sistemi kullanıcı arabirimdeki. TSA deney programlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 : Tuz ekran örnek verileri. (A) 350 nm vs 330 nm Lizozim ile nanoDSF etiket ücretsiz deneme için koyulukları floresans sayısına oranı. Örnekleri kuyu C7-C12 tuz ekran (1.5 M - 0.2 M amonyum klorür) için karşılık gelir. Hesaplanan T_m değerleri her koşul için arsa üzerinde üst üste. (B) T_m değerlerinin özeti Şekil 7içindeAsunulan veri hesaplanan. (C) Floresan koyulukları 590 nm lizozim hydrophobicity duyarlı muhabir boya ile kullanarak bir TSA deney. Şekil 7gibiA, örnekleri kuyu C7-C12 tuz ekran için karşılık gelir. Hesaplanan T_m değerleri grafik üzerinde üst üste. (D) T_m değerlerinin özeti Şekil 7' deCmevcut verilerden hesaplanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: pH ekran örnek verileri. T_m vardiya lizozim ve pH ekran ile elde edilen özetini. Her noktası bağımsız bir durumu temsil eder; farklı tampon sistemleri aynı pH noktalarda aynı pH değeri vardır. T_m vardiya TSA deneyler için 68.0 ° C ve 71.9 ° C nanoDSF deneyler için bir denetim T_m göre hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 9 : Osmolyte ekran örnek verileri (lizozim). Lizozim ve her şey osmolyte ekran ile bir etiket içermeyen nanoDSF deneme elde T_m değerlerinin özeti. T_m değerlerde (° C) içeren bir denetim olarak su kuyuları A1 ve A2 karşılaştırılır. Bir heatmap karşılaştırıldığında ΔT_m değerlere göre oluşturulan (mavi gösterir T_m artış ve kırmızı T_m azalma). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 10: Osmolyte ekran örnek verileri (Protein X). (A) Protein X ve osmolyte ekran ile bir etiket içermeyen nanoDSF deneme elde T_m değerlerinin özeti. T_m değerleri içeren bir denetim olarak su kuyuları A1 ve A2 karşılaştırılır. Bir heatmap karşılaştırıldığında ΔT_m değerlere göre oluşturulan (mavi gösterir T_m artış ve kırmızı T_m azalma). (B) nanoDSF eğriler elde edilen iyi A9 (1 M D-sorbitol, teskin bir durum) ve D1 (10 mM dipicolinic asit, destabilizing durumu). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 11 : Arabellek T_men iyi duruma getirme etkisi. TSA T_m değerleri T_men büyük artış sağladığı her ekran şartları ile birlikte lizozim. 100 mM asetik asit, pH 4.2 ve 100 mM MES, pH 5.6, 1.5 M amonyum sülfat tuzu olarak yanında tampon sistemleri olarak seçildi. Osmolyte konsantrasyonları osmolyte ekran bulunanlara benzer: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50 mM L-lizin ve 100 mM hypotaurine. Hata çubukları temsil eden altı çoğaltır standart sapması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Molekül	PDB kodu	Co kristallendirme sıklığı
Fosfat	PO4	5132
Asetat	YASASI	4521
2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic asit (MES)	MES	1334
Tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris)	TRS	1155
Formiat	FMT	1072

Tablo 1: Özet arabellek molekül ortak kristalizasyon frekans Protein veri Bankası (PDB) katılım hakkı. PDBsum¹⁶ ' dan 144,868 girişlerinin (12-5-18 aynı derecede-in doğru) toplamı üzerinden alınan veri.

Tamamlayıcı bilgiler. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. 

Ek tablo 1. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. 

Ek tablo 2. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. 

Ek tablo 3. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. 

Tartışmalar

İletişim kuralına kritik yönleri Santrifüjü adım ve 96-şey plaka TSA deneyler (adım 1.5) için uygun sızdırmazlık içerir. Santrifüjü sağlar bu protein örnek ve ekran durum kişiye gel ve karıştırın. Ayrıca, bir mühürsüz plaka kullanılırsa TSA deneme için deney boyunca buharlaşan bir artışa neden örnek konsantrasyon ve erken protein toplama şansımızın artması solvent önemli bir riski yoktur.

TSAs ve nanoDSF protein örnekleri geniş bir mükellef bulunmaktadır; örnekleri büyük çoğunluğu yorumlanabilir eritebilir eğrileri veya boya-Alerjik nanoDSF bir muhabir hydrophobicity-esaslı boya ile üretebilir. Standart Floresan kaynakları, protein için uygun değilse, basit değişiklik keşfedilmeyi iletişim kuralına fluorophore seçimdir. Birkaç alternatif boyalar TSA deneyleri için uygun olabilir. N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), thiol²⁷ve 4 - ile tepki sonra fluoresces bir bileşik örnekler (dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), temel, floresans değişir bir bileşik Onun floresan bir protein örnek olarak artan çevresine sertlik (ikinci boya örnek yüksek konsantrasyonda kez gerektirir)^28,29 izlerken.

T_m araç yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanmamışsa eritebilir eğrisi Analizi alternatif yöntemler kullanılabilir. Veri homojen ve tek bir denatürasyon adım eritebilir eğrileri belirgin ise, kesilmiş bir veri kümesi Boltzmann Aşağıdaki denklemle sigmoid ile donatılmış:

F T sıcaklığında floresan yoğunluğu, F_min ve F_max nerede floresans yoğunluklarda önce ve denatürasyon geçişten sonra sırasıyla, T_m orta sıcaklık denatürasyon geçiş ve C olduğunu. T_mviraj gibidir. Bu yöntem de basit iki aşamalı denatürasyon işlemleri için çalışırken, karmaşık eritebilir eğrileri ile birden çok geçiş için uygun değildir.

Erişilebilirlik TSA önemli avantajlarından biridir; TSA deneylerin herhangi bir RT-PCR sisteminde istihdam floresans boya için uygun dalga boylarında, filtreler ile gerçekleştirilebilir. Bu düşük maliyetli sarf malzemeleri, işlem ve nispeten düşük miktarda protein, TSA proje ölçekleri, sanayi ve Akademi hem de geniş bir yelpazesi için değerli bir teknik yapmak gerekli kolaylığı ile birleştiğinde.

Olumlu arabellek koşulları belirten yanı sıra, ekranları ipuçları için bir örnek protein içinde yapısal metallerin varlığını verebilir bazı kuyular içerir. Tuz ekranında özel ilgi olabilir wells G6 ve G7, 5 mM EDTA ve 5 mM EGTA, sırasıyla içeren vardır. Bu kuyu önemli termal istikrarsızlık tarafından chelants münzevi önemli metal iyonları proteini içerisinde göstergesi olabilir. Bileşikleri osmolyte ekranı da potansiyel bir protein işlevine ipuçları sağlayabilir. Birçok ekranında bileşiklerin olan enzimlerin ortak yüzeylerde sınıflara molekülünün ait. Örneğin, genel istikrar lizozim enzim, N-peptidoglikan reaksiyonlar³⁰kurulan yüzeylerde yapısal onların benzerlik atfedilen olabilir için saccharides (kuyu A11-B10 mevcut) tarafından tanınan.

Yukarıda özetlenen TSA ve nanoDSF iletişim kuralları da protein-ligand etkileşimleri çalışmaya adapte edilebilir. Özellikle bir protein için bağlama ligandlar termal istikrarı kompleksi içinde yeni etkileşimler tanıtarak artırabilir. Protein T_m pozitif vardiya bir doz bağımlı bir başarılı protein-ligand etkileşim gelecek vaat eden bir işaretidir. Hız, performans ve TSAs bileşik kitaplıklarıyla tarama düşük maliyet yaptı çok popüler bir yöntem aşamasındaki ilaç keşfi.

^31,32,33,34birçok edebiyat örnek göstermek gibi hedef proteinler ve onların ligand komplekslerinin arabellek koşullarını optimize bir projenin başarı için gerekli olabilir. Altında 2 Kurulum süresi de dahil olmak üzere h alarak tipik bir tahlil ile arabellek en iyi duruma getirmeleri için hızlı, ucuz teknik TSAs ve kararlılık perde ile birleştiğinde nanoDSF temsil eder.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1).