Как для стабилизации белка: стабильность экраны для тепловых сдвиг анализов и Nano дифференциальная сканирующая флуориметрия в проекте вирус X

Резюме

Протокол, как представляется, быстро проверить термическая стабильность белков в различных условиях через тепловые сдвиг анализов и nano дифференциальной сканирование флуориметрия. Буферные системы, солей и добавки, вместе состоит из трех уникальных стабильности экранов, являются assayed с белками для выявления подходящих буферы для функциональных и структурных исследований.

Аннотация

Horizon2020 вирус-X проект был создан в 2015 году, чтобы исследовать virosphere отдельных крайних биотопов и открывать новые вирусные белки. Чтобы оценить потенциальные биотехнические значение этих белков, анализ белков структур и функций является главной проблемой в этой программе. Стабильность образца белка имеет важное значение для обеспечения значимого анализа результатов и увеличить crystallizability целей. Assay тепловой сдвига (TSA), на основе флуоресценции технику, устанавливается как популярный метод для оптимизации условий для стабильности белка в высокой пропускной способности. В ВСТ занятых флуорофоров, внешняя, экологически чувствительных красители. Альтернативой, подобный метод является nano дифференциальной сканирование флуориметрия (nanoDSF), которая опирается на родной флуоресценции белков. Мы представляем здесь Роман osmolyte экран, 96-условие органических добавок, предназначенных для руководства кристаллизации испытания через предварительные эксперименты TSA. Вместе с ранее разработанных рН и соли экраны набор трех экранов обеспечивает всесторонний анализ белков стабильность в широком диапазоне буферной системы и добавок. Полезность экраны проявляется в ВСТ и nanoDSF анализ лизоцима и белок X, целевого белка вируса-X проекта.

Введение

Многие биотехнологическим полезные ферменты происходят из вирусного источников, таких как табак etch протеазы вируса (TEV)¹ и 3 C (HRV 3 C) протеазы²типа человека риновирус. Horizon2020 вирус-X проекта (рис. 1)³. Цель этой программы — (), чтобы расширить спектр свойств семей известных ферментов и (b) для характеристики новых ферментов еще неизвестной функции (фермент X). Определение Кристаллографическая структура играет ключевую роль в характеристике целевых белков, в частности в тех случаях, когда белковых последовательностей эволюционировали за признание⁴. Стабильность белков является ключевым фактором в процессе кристаллизации; образцы должны быть конформационно однородных и структурно звука в течение времени в форме высокого качества, Дифрагирующая кристаллов. Кроме того крайне важно для анализов деятельности существуют белки в их активной конформации, который также может быть облегчено благоприятной молекулярной среды.

Несмотря на развитие технологий, доступных для Кристаллографов кристаллизации белка остается длительным и трудоемким эмпирический процесс⁵. Предварительные биофизические эксперименты для повышения стабильности белка в растворе четко дать лучшей отправной точкой для кристаллизации белка и обычно потребляют лишь сравнительно небольшое количество белка образец^{6,7, 8,9}. Большое количество целевых белков необходимо изучить в рамках этого проекта также требует масштабируемые, высок объём стабильности анализов. Один из самых популярных методов для предварительной кристаллизации биофизические характеристики белков является термальный переход пробирного (также известный как TSA или дифференциальная сканирующая флуориметрия, DSF)^10,11.

ВСТ используют Люминесцентную краску экологически чувствительных для отслеживания тепловой денатурации белков образцов. Многие часто используемые красители имеют переменной флуоресценции активность в зависимости от полярности их окружающей среды, часто вывода высокий флуоресценции в гидрофобных средах, но подвергается быстрой закалки в полярных средах¹². Белки обычно вызывает выраженный рост в Люминесцентная краска, как их гидрофобные ядер подвергаются во время денатурации, часто сопровождается снижением Люминесцентная краска при очень высоких температурах, как белки начинают агрегат (рис. 2).

Хотя гидрофобность чувствительных красителем часто является хорошим выбором для общего использования TSA краска, это может быть непригодной для белков с большой, воздействию растворителей гидрофобные регионами, которые часто отображения пагубно высокий фон флуоресценции. Флуорофоров с альтернативных видов действий существуют (см. обсуждение), но вместо этого может быть желательно отслеживать денатурации через встроенные белка флюоресценции с nanoDSF.

Триптофан остатков, которые похоронены в неполярных регионах белка флуоресцировать выбросов более 330 Нм. Как образец протеина разворачивается, и эти остатки подвергаются Полярный растворитель, их выбросов максимальная проходит bathochromic переход к 350 Нм¹³. nanoDSF использует этот сдвиг в выбросов максимальная зонда разворачивается образец протеина без необходимости внешние флуорофоров¹⁴.

Расплава кривых, которые показаны один денатурации шаги могут быть проанализированы на установку данных в модель сигмоид Больцмана. Температура в точке перегиба разворачивающихся перехода (_mT) используется как количественная мера белка термостабильности и эталоном для сравнения favorability различных условий.

Кривые расплава же белка в различных условиях иногда обладают степенью неоднородности, которые могут сделать Больцмана сигмоид штуцер неосуществимым. Различать значения_m T из данных, отличается от классической кривой топологии, численные методы могут использоваться такие как занятые в NAMI, открытым исходным кодом TSA данных анализа программы¹¹. Альтернативные термодинамические основы может также использоваться для анализа более сложных кривых с несколькими денатурации шаги, например методологии ProteoPlex¹⁵.

Стабильность экраны были разработаны для использования в TSA и nanoDSF эксперименты быстро определить благоприятные условия для целевого белка (рис. 3, экран композиций доступны в дополнительной информации). Информация, собранная с экранов может использоваться на многих стадиях кристаллографических трубопровода, в том числе: образец хранения; очищение, минимизации потерь урожайности через белка, разворачивается во время процесса очистки; пробирного дизайн, армирующие белка функциональность в деятельности анализов с термически стабилизации буферов и, наконец, кристаллизации, направляя рационально разработан кристаллизации испытания.

Выбор подходящего буферной системы основы для Образец протеина имеет жизненно важное значение; несовместимые рН может привести к деактивации или денатурации белка. Однако наличие совместно кристаллизуется буфера молекул, решен в большое количество рентгеновских кристалл структур (Таблица 1) может также свидетельствовать о стабилизирующее воздействие, что отдельный для регулирования простой рН и вместо этого проистекает из химической особенности молекулы буфера.

Сформулированы, используя несколько хорошо в буферы^17,18,19 наряду с другими буфера обычно биологически совместимых систем, рН экран предназначен для deconvolute химический эффект молекула буфера на стабильность белков от фактической pH полученного раствора. Предоставляя три значения рН для каждой буферной системы и включения избыточности значение рН между различными системами, рН экрана можно определить благоприятные рН и благоприятные буферные системы для целевого белка.

Соли экран содержит обычно Лаборатория солей, а также chaotropes, chelants, тяжелых металлов и восстановителей. Экран может дать общее представление о схожести образец протеина в средах с высокой ионной силы, но каждая подгруппа соединений может также предоставить информацию о потенциальных структуры белка. Например Челант, существенно дестабилизирует белок может свидетельствовать о важных структурных металлов в образце. Если образец стабилизируется также сильно катиона металла в пределах экрана, это может обеспечить перспективные отправной точкой для дальнейших структурных экспериментов.

Osmolytes являются растворимые соединения, которые влияют на осмотические свойства окружающей их среды. В природе они могут использоваться как «химическая сопровождающих», складывающиеся неупорядоченных белков и стабилизации их, особенно в стресс условий^20,21,22. Эти характеристики делают их привлекательными добавок белка Кристаллография; ²³процессов может использоваться как криопротекторы во время сбора урожая кристалл, монтажа и хранения. Osmolytes потенциального использования распространяется также на очистки белков. Значительную долю в E. coli рекомбинантных белков может быть нерастворимы и трудно восстановить в родной штат с использованием методов стандартной очистки. Osmolytes могут быть использованы для стабилизации и спасти белки из нерастворимых фракций, очистки увеличения урожайности²⁴.

Osmolyte экран был разработан с использованием установленных соединений, присутствующих в банк данных белков записи²⁵ и база данных²⁶ Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated пути (DEOP) и многократно оптимизированы с помощью стандартных белков. Экран построен около восьми подклассы osmolyte: глицерин, сахаров и полиолов, без моющих средств sulfobetaines (NDSBs), бетаины и их аналоги, органофосфатов, дипептиды, аминокислоты и их производные и окончательное разные группы. Каждый osmolyte присутствует в нескольких концентрации, основанный на его растворимость и эффективная концентрация диапазоны для сравнения.

протокол

1. Подготовка образца протеина

1. Сформулировать экраны стабильности как 500 мкл аликвоты в 96-луночных блоков и уплотнение для хранения. Передача 10 мкл каждого состояния стабильности экрана в соответствующий хорошо из 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов для экономии времени (рис. 4A).
2. Подготовка 1 мл около 1 мг^-1 мл белка раствора в систему соответствующего буфера. В то время как в состав соответствующего буфера меняется с каждым образец протеина, хороший первый буфер попробовать-фосфат натрия 10 мм с 100 мм NaCl, рН 7,2.
   Примечание: Приемлемым белка концентрации варьируются case-by-case, но диапазоны концентраций мл 0,5 - 5 мг^-1 , как правило, производят анализируемые кривых. Разбавляют буферы рекомендуются для использования с экранов стабильности во избежание маскирующие эффекты каждого состояния. Типичный буфера композиции являются приблизительно 10 мм буфер с около 100 мм NaCl.
3. Если выполнение эксперимента TSA, добавьте SYPRO оранжевый краситель образец протеина до конечной концентрации 20 x. Смешайте инверсии или краткий vortexing.
4. Передача 10 мкл раствора белка в каждой скважине 96-луночных пластины, подготовленный на этапе 1.1 (Рисунок 4B).
5. Печать и центрифуги 96-луночных плита на 2 мин на 600 x g обеспечить белка образца и экрана компонента смешиваются (рис. 4C).
6. Повторно запечатать стабильности экран глубинно блока и хранить экрана на 4 ° C на срок до 4 месяцев. Положите соль экран в темноте, как некоторые компоненты светочувствительной.
7. Если выполнение nanoDSF эксперимент, перейдите к шагу 2. Если выполнение TSA эксперимент, перейдите к шагу 4.

2. Подготовка nanoDSF эксперимент

1. Убедитесь, что оборудование является чистым, уделяя особое внимание пыль возле стойки образца. Если в системе имеется обратного рассеяния зеркало, очистите его использование этанола и ворса ткани.
2. Откройте образец, нажав на кнопку Открыть ящик . (Рис. 5A).
3. Загрузить капилляров с приблизительно 10 мкл от каждой скважины 96-луночных пластины, трогательно один конец капилляра в раствор, а затем поместить их в соответствующие капиллярного держатели образца стойки (рис. 5B). Будьте осторожны, чтобы не загрязнить в середине капилляров с отпечатки пальцев и т.д., как это может помешать флуоресценции чтений на протяжении всего эксперимента.
4. Иммобилизации капилляров с магнитной полосой уплотнения (рис. 5C).

3. Программирование nanoDSF эксперимент

1. Запуск предварительного сканирования, чтобы обнаружить позиции и интенсивности каждого капилляра, нажав кнопку Начать проверку обнаружения в закладке Сканировать обнаружения увеличение или уменьшение силы инцидентов возбуждения от первоначальной мощности от 10% до пик каждого капилляра сканирования составляет 4000-12000 единиц (рис. 5D).
2. Чтобы сложить и достаточно сосредоточены образца, рекомендуется проверки первоначальных расплава с крутой градиент температуры. На вкладке Плавления сканирования программа расплава сканирования, установив параметр Температуры склона -7,0 ° C мин^-1, Начать температура 25 ° c и Конечной температуры до 95 ° C, а затем запустить nanoDSF эксперимент, нажав Начала плавления кнопку. Если результирующая расплава кривых не показывать точки перегиба обнаружению, рассмотреть вопрос о концентрации образец далее или проверка, если белка складывается должным образом.
3. Повторите шаги 2.1-2.4 подготовить образцы для полного эксперимент.
4. На вкладке Плавления сканирования программа расплава сканирования, установив параметр Температуры склона -1,0 ° C мин^-1, Начать температура 25 ° c и Конечной температуры до 95 ° C, а затем запустить nanoDSF эксперимент, нажав Кнопка Начала плавления .

4. выполнение TSA эксперимент

1. Откройте образец нажав твердо отступ на правой стороне ящика. Поместите лоток 96-луночных в системе RT-PCR с хорошо A1 обратно-слева (рис. 4D).
2. Нажмите кнопку Новый эксперимент , чтобы начать создание TSA эксперимент.
3. На вкладке Свойства эксперимента , нажмите вариант Расплава кривой , когда спросил какой тип эксперимента вы хотите настроить? и другой вариант, когда спросил какие реагенты вы хотите использовать для определения последовательности целевых объектов?
4. В плиты установки / определить цели и образцы вкладки, введите целевое имя, а затем установить репортер ROX и утоления как None.
5. В плиты установки / назначить цели и образцы вкладка, назначить каждый хорошо пластину 96-луночных целевой имя, введенное на предыдущем шаге. В той же вкладке установите выбрать краситель для использования в качестве пассивного ссылку как None.
6. На вкладке Выполнить метод удалите шаги до тех пор, пока существует в общей сложности три. Установите первый шаг до 25,0 ° C, рамп ставка 100%, время 00:05; Второй шаг к 95.0 ° C, рамп ставке 1%, время 01:00; Третий шаг, чтобы 95.0 ° C, рамп ставка 100%, время 00:05. Выберите для сбора данных, с помощью раскрывающегося меню Сбора данных или нажав значок Сбора данных (Рисунок 6).
7. Задайте объем реакции на хорошо 20 мкл.
8. Нажмите на кнопку Начать Run , чтобы начать эксперимент TSA.

5. анализ данных

1. Выбор длины волны для построения кривой расплава с. Для nanoDSF экспериментов, отношение интенсивности флуоресценции в 330 Нм и 350 Нм (соответствующий триптофана в неполярных и полярных средах, соответственно)¹³ широко используется. Для большинства ВСТ, краситель выбросов максимальная подходит для построения кривой расплава (максимум выбросов SYPRO оранжевый составляет 569 Нм)¹².
2. Рассчитайте значения_m T каждого состояния путем определения точек перегиба кривой каждого расплава. Большинство систем nanoDSF автоматически рассчитать значения_m T, численного дифференцирования расплава кривых после сбора данных. Если программное обеспечение используется не автоматически вычислить значения_m T, бесплатно, альтернативных GUI-driven программного обеспечения таких как NAMI¹¹ можно автоматизировать анализ данных и вниз по течению обработки, давая возможность производить heatmap обобщение T_m значения для всего 96-луночных эксперимент (сопровождающих ссылка обеспечивает руководство и ресурсы для обработки данных с нами).
3. Сравните значения_m T всех условий опрошенных. На экранах стабильности содержат две скважины в каждом экране (А1 и А2), которые содержат только воду. Взяв ориентир значения только для воды позволяет расчет значения_m ΔT, адресации систематические ошибки и позволяет легко сопоставлять стабилизации эффекты. Более высокие значения_m T указывают термически стабилизирующие условия, которые рекомендуются для использования в нижнем течении. Перспективные условия часто показывают концентрационная зависимость в их стабилизации.

Результаты

Лизоцим был assayed с экранами стабильности и белок X, целевого белка в проекте вирус-X был assayed с osmolyte экраном. Оба белка обычно производится расплава кривых с четко определенной денатурации переходы в TSA и nanoDSF эксперименты (см. сопровождающие данные для представителя кривых). В некоторых случаях, где образцы, которые не производят интерпретируемых кривых с определенной денатурации перехода были истолкованы как денатурированного и не включены в T_m сравнений.

Рисунок 7 показывает результаты образца от соли экрана, иллюстрируя термически стабилизирующие свойства хлорида аммония к лизоцима. Концентрация зависимости, такие как показано выше часто свидетельствует о перспективных условий, но это может быть полезно сравнить результаты увеличения концентрации ионов с нескольких различных солей, чтобы увидеть, если тепловая стабилизация обычно возникает из увеличение в буфер ионной силы или если наличие конкретных ионов возлагает дополнительную стабильность.

Сравнение значения_m T лизоцима с рН экрана (рис. 8) показывает две части информации. Во-первых существует общая тенденция увеличения стабильности с уменьшением значения рН. Во-вторых диапазон T_m значения, полученные с помощью различных буферные системы с идентичными pH могут быть значительными.

Данные на рисунке 8 свидетельствует о том, что соглашение между TSA и nanoDSF в этом эксперименте в целом хорошо, но nanoDSF показывает тенденцию для выявления чуть выше значения_m T и немного больше T_m перемещает чем TSA. Однако некоторые скважины с pH выше 8.5 показывают большие расхождения между значениями_m T, полученные от TSA и nanoDSF. Различия могут объясняться потенциально механизму денатурации белка в различных рН; например гидрофобность чувствительных краска может дать сравнительно низкой T_m чтения, если гидрофобные регионов белка подвергаются растворителя значительно быстрее, чем окружающей среды триптофан остатков изменения полярности.

На рисунке 9 показана heatmap T_m значения, полученные с лизоцима, используя экран osmolyte. Условия с высоким T_m увеличивается по сравнению с контроля скважин (скважины А1 и А2, содержащий деионизированной воды) окрашены в темно-синий. Особенно стабилизации условий, указанных на рисунке 9 включают глицерина, 1 M D-сорбит, hypotaurine 100 мм и 10 мм Ала-Gly (колодцы A4-A6 и A9, E7 F8, соответственно).

На рисунке 10 показана heatmap T_m значения, полученные с TSA X. белка и nanoDSF экспериментов с Osmolyte экраном показывают, что большинство osmolytes испытания дают либо незначительные увеличения в T_m (в пределах 1 ° C) или иметь пагубные последствия на стабильность белков х. В частности dipicolinic кислота в концентрации 10 мм (хорошо D1), как представляется, Денатурируйте образцы при комнатной температуре. ВСТ и nanoDSF результаты быстро идентифицировать dipicolinic кислоты как несовместимые добавка для X белка, которых следует избегать при работе с белками. Тем не менее, высокие концентрации D-сорбитол и арабинозы (скважины A9 и B9, как на 1 М) а также глицерин и TMAO (колодцы A4-A6 и E1, соответственно) были определены как термически стабилизации.

Для лизоцима сочетания условий приносит самые высокие значения_m T от каждого экрана стабильности были протестированы на зонд для комбинированных синергетический эффект. На рисунке 11 показан общий рост в значениях_m T больше компоненты буферной системы добавляются (pH, соль и osmolyte). В случае МЧС, сульфата аммония и D-сорбит, T_m увеличить как большой, как 10 ° C можно наблюдать когда присутствуют все компоненты по сравнению с МЧС самостоятельно. Рисунок 11 показывает, что ощутимого синергетического эффекта может произойти, когда отдельные компоненты буфера оптимизированы и в сочетании с экранов стабильности.

В более общем плане Рисунок 11 также иллюстрирует масштабы ΔT_m значений, которые можно наблюдать в TSA и nanoDSF экспериментов. Величина ΔT_m достижимы зависит значительно на основе белков системы, но любое значение_m ΔT вокруг и выше 5 ° C часто свидетельствует о стабилизации благотворно.

Рисунок 1 : Биопоиском. Пример коллекции от экстремальных среды в проекте вирус-X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: схема TSA. Аннотированный пример типичного расплава кривой, полученные от TSA эксперимента. Эта кривая характеристика классической «двух государств» белка разворачивается, где образца населения переходит от сложить в денатурированном без обнаружению частично сложить интермедиатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Стабильность экраны рабочего процесса. Стандартный рабочий процесс оптимизации буфера с помощью экранов стабильности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Рабочий процесс стандарта TSA экспериментировать с экранами стабильности. Слева направо: (A) дозирование аликвоты стабильности экранов в 96-луночных плиту. (B) закупорить образец протеина с флуоресцентных красителей в пластину. (C) запаечная пластина перед центрифугированием. (D) размещение пластину в систему RT-PCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: рабочего эксперимента стандартного nanoDSF. (A) открытия капилляров, эстакады. (B) Загрузка капилляров в стойку. (C) иммобилизирующие капилляров с магнитной полосой герметизации. (D) программирование эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Пользовательский интерфейс для системы RT-PCR. TSA эксперимент был запрограммирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Соль экран образец данных. (A) отношение интенсивности флуоресценции в 350 Нм против 330 Нм для метки бесплатная nanoDSF эксперимент с лизоцима. Образцы соответствуют скважинам C7-C12 соли экрана (1,5 М - аммония хлорид 0,2 М). Вычисляемые значения_m T для каждого условия накладываются на участке. (Б) краткое изложение значения_m T рассчитано исходя из данных, представленных в Рисунок 7A. (C) флюоресценция света на 590 нм для TSA эксперимент с использованием лизоцима с красителем гидрофобность чувствительных репортер. Как Рисунок 7Aобразцы соответствуют скважинам C7-C12 соли экрана. Вычисляемые значения_m T накладываются на графике. D резюме значения_m T рассчитывается от данных присутствуют в рисунке 7C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: pH экран образец данных. Резюме сдвигов_m T, полученные с рН экран и лизоцима. Каждая точка представляет условие независимой; Указывает на то же значение рН представляют различные буферные системы на том же рН. Смены_m T рассчитываются относительно управления T_m 68,0 ° C для ВСТ экспериментов и 71.9 ° C для nanoDSF экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9 : Osmolyte экран образец данных (лизоцим). Краткое изложение T_m значения, полученные из метки бесплатная nanoDSF эксперимент с лизоцима и каждой скважины osmolyte экрана. Значения_m T (в ° C) по сравнению с скважин A1 и A2, которые содержат воду как элемент управления. Heatmap был создан на основании сравнения значений_m ΔT (голубой обозначает увеличение_m T и красный снижение_m T). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10: Osmolyte экран образец данных (X белка). (A) краткое изложение T_m значения, полученные из метки бесплатная nanoDSF эксперимент с X белка и osmolyte экране. Значения_m T сравниваются с скважин А1 и А2, которые содержат воду как элемент управления. Heatmap был создан на основании сравнения значений_m ΔT (голубой обозначает увеличение_m T и красный снижение_m T). (B) nanoDSF кривые, полученные из хорошо A9 (1 M D-сорбит, стабилизации состояния) и D1 (10 мм dipicolinic кислоты, дестабилизирующих условие). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 11 : Буфера оптимизации эффекта на T_м. Значения_m TSA T лизоцима в сочетании с условиями каждого экрана, которая предоставлена наибольшее увеличение T_m. 100 мм уксусная кислота, pH 4.2 и 100 мм МЧС, рН 5,6, были выбраны в качестве буферной системы, наряду с 1,5 М сульфата аммония, как соль. Osmolyte концентрации были идентичны тем, которые найдены на osmolyte экране: 10 мм Ала-Gly, 1 M D-сорбитол, 50 мм L-лизин и 100 мм hypotaurine. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение шести реплицирует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Молекула	Код PDB	Частота Сопредседатель кристаллизации
Фосфат	PO4	5132
Ацетат	АКТ	4521
2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic кислота (MES)	МОН	1334
Трис (гидроксиметил) aminomethane (tris)	TRS	1155
Формиат	FMT	1072

Таблица 1: резюме буфера молекулы Сопредседатель кристаллизации частоты в записи белка банк данных (PDB). Данные, полученные через PDBsum¹⁶ из в общей сложности 144,868 записей (откорректировано по состоянию на 12-5-18).

Дополнительная информация. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительная таблица 1. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительная таблица 2. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительная таблица 3. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Обсуждение

Важные аспекты в рамках Протокола включают шаг центрифугирования и надлежащей герметизации 96-луночных пластины для ВСТ экспериментов (шаг 1.5). Центрифугирование гарантирует, что белок образца и экран состояния вступают в контакт и перемешать. Кроме того если используется незапечатанных пластина для эксперимента TSA, существует значительный риск растворитель испаряется на протяжении эксперимента, вызывая увеличение концентрации образца и увеличивая вероятность недоношенных белок агрегации.

ВСТ и nanoDSF поддаются широкий спектр образцов белка; Подавляющее большинство образцов может производить интерпретируемых расплава кривых с краской на основе гидрофобность репортер или через nanoDSF краска бесплатно. Если стандартные флуоресценции источники не подходят для вашего протеина, простой модификации протокола, можно было бы изучить это выбор Флюорофор. Несколько альтернативных красители могут быть пригодны для ВСТ экспериментов. Примеры включают N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), смесь, которая флуоресцирует после реагируя с тиоловых²⁷и 4 - julolidine (dicyanovinyl) (DCVJ), соединение, которое меняется его флуоресценции, основанный на жесткость ее окружающей среды, увеличивая его флуоресценции как образец протеина разворачивается^28,29 (последний красителем часто требует высокой концентрации образца).

Альтернативные методы анализа кривой расплава доступны, если T_m не рассчитывается автоматически инструмент программного обеспечения. Если данные однородных и только одного шага denaturation проявляется в кривых расплава, усеченные набора данных могут быть установлены в сигмовидной кишки с помощью следующего уравнения Больцмана:

Где F — это интенсивность флуоресценции при температуре T, F_мин и F_Макс интенсивностью флюоресценции до и после перехода денатурации, соответственно, T_m середина Температура денатурации перехода и C — это наклон T_m. Хотя этот метод хорошо работает для простой двухэтапный денатурации процессов, она непригодна для сложных расплава кривых с нескольких переходов.

Одним из основных преимуществ TSA является его доступность; TSA эксперименты могут выполняться в любой системе, RT-PCR с фильтрами на длинах волн подходит для флуоресценции краска работу. Это в сочетании с низкой стоимостью расходных материалов, простота эксплуатации и относительно малое количество белков, необходимых, чтобы TSA полезен для широкого круга масштабов проекта, как в промышленности и научных кругов.

А также указывая условия благоприятные буфера, экраны содержат некоторые скважины, которые может дать ключи к присутствие конструкционных металлов в образец протеина. Скважины, которые могут представлять особый интерес в экране соли являются G6 и G7, содержащие ЭДТА 5 мм и 5 мм EGTA, соответственно. Значительный тепловой дестабилизации в этих скважинах может свидетельствовать о важных ионов металлов в протеине, которые изолированы от chelants. Соединений на osmolyte экране также потенциально обеспечивающие функции белка. Многие из этих соединений на экране принадлежат классы молекулы, которые являются общей субстраты ферментов. Например к их структурным сходством с установленным субстратов фермента, N-acetylglucosamine олигомеров³⁰может объясняться общей стабилизации, обеспечиваемой углеводов (присутствует в скважинах A11-B10) для лизоцима.

ВСТ и nanoDSF протоколы, описанные выше также могут быть адаптированы для изучения взаимодействий протеин лиганд. Лиганды, которые конкретно связать белок может увеличить его термической стабильности путем введения новых взаимодействий внутри комплекса. Дозозависимый позитивный сдвиг в белок T_m является многообещающим признаком успешного белка лиганд взаимодействия. Скорость, пропускную способность и низкую стоимость скрининга составные библиотек с ВСТ сделал это очень популярный метод в ранней стадии лекарств.

Оптимизации условий буфера целевых белков и их комплексов лиганд может быть существенно важное значение для успеха проекта, как много литературы примерах^31,,3233,34. С типичной assay, принимая младше 2 h, включая время настройки ВСТ и nanoDSF, в сочетании с экранов стабильности представляют собой быстрый и недорогой метод для оптимизации буфера.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1).