JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

Abstract

במשך שנים רבות, חזק במיוחד, במהירות בנוי האינטראקציה בין ביוטין streptavidin יש כבר בהצלחה מנוצל לשם טיהור חלקי של מתחמי RNA/חלבון חשוב מבחינה ביולוגית. עם זאת, אסטרטגיה זו סובלת חיסרון מרכזי אחד המגביל את ניצול רחב יותר: האינטראקציה של ביוטין/streptavidin יכול להיות שבור רק תחת תנאים גם לשבש את תקינות מתחמי eluted, ומכאן מסלק denaturing שלהם אנליזה פונקציונלית עוקבות ו/או נוספות טיהור באמצעות שיטות אחרות. בנוסף, הדגימות eluted נגועים תכופות עם החלבונים רקע המשייכים nonspecifically streptavidin חרוזים, שמסבך הניתוח של מתחמי מטוהרת על ידי צביעת כסף ספקטרומטר מסה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו משתנה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin בו ביוטין מצורף של המצע RNA באמצעות מקשר צילום-cleavable, מתחמי ותשמרו על חרוזים streptavidin הם eluted באופן סלקטיבי על פתרון טופס מקורי על-ידי גלי ארוך UV, עוזב את החלבונים רקע על החרוזים. סובסטרטים איגוד ה-RNA קצר יותר יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין והמקשר צילום-cleavable covalently מצורף לסוף 5' RNA, ואילו עוד מצעים RNA יכול להתבצע עם שתי הקבוצות באמצעות oligonucleotide משלימים. אלה שתי גרסאות של השיטה • UV-תנאי נבדקו עבור טיהור של מתחמי עיבוד snRNP תלוית U7 זה קליב היסטון pre-mRNAs בקצה 3' והוכיח שניהם להשוות לשני בחיוב בעבר פיתחו שיטות טיהור. הדגימות UV eluted הכיל כמויות לזיהוי בקלות snRNP U7 שהיה ללא מזהמים חלבון גדול ומתאים לניתוח ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי. השיטה המתוארת ניתן להיות ברצון הותאם עבור טיהור של מתחמי מחייב אחרים RNA, הפועל בשיתוף עם אתרי קישור יחיד, כפול-גדילי DNA לטהר חלבונים ספציפיים הדנ א ואת מתחמי macromolecular.

Introduction

ב פרוקריוטים, מבשרי RNA פולימראז II-שנוצרו mRNA (pre-mRNAs) עוברים מספר אירועים ההבשלה בגרעין לפני שהפך תקינים mRNA תבניות עבור סינתזת החלבון בציטופלסמה. אחד האירועים הללו הוא עיבוד קצה 3'. עבור הרוב המכריע של טרום-mRNAs, עיבוד קצה 3' כרוך המחשוף מצמידים פוליאדנילציה. תגובה דו-שלבית זה מזורז על ידי קומפלקס יחסית שופע בהיקף של יותר מ-15 חלבונים1. בעלי חיים תלויי-שכפול היסטון pre-mRNAs מעבד בקצה 3' מנגנון שונה שבו הוא שיחק תפקיד מפתח על ידי U7 snRNP, שפע נמוך מורכבים בהיקף של snRNA U7 של נוקלאוטידים ~ 60 וחלבונים מספר2,3 . U7 snRNA בסיסי זוגות עם רצף מסוים היסטון pre-mRNA, לאחד subunits של snRNP U7 מזרז את התגובה המחשוף, יצירת היסטון בוגרת mRNA ללא poly(A) זנב. 3' עיבוד קצה של היסטון pre-mRNA דורש גם גזע לופ מחייב חלבון (SLBP), אשר נקשר שנשמרת גזע-לולאה ממוקם במעלה הזרם של אתר המחשוף ומגבירה את גיוס snRNP U7 המצע2,3. מחקרים שמטרתם זיהוי רכיבים בודדים של snRNP U7 היה מאתגר בשל ריכוז נמוך snRNP U7 בתאים בעלי חיים ואת הנטייה של המתחם מביצועם או עוברים proteolysis חלקית במהלך טיהור כתוצאה מהשימוש דטרגנטים קלים-4,-5,-6, שוטף מלח גבוהה ו/או מספר צעדים כרומטוגרפי7,8,9.

לאחרונה, כדי לקבוע את ההרכב של מכונות עיבוד U7 תלוית, נדגרה קטע קצר של ביוטין המכילים pre-mRNA היסטון 3' או 5' עם תמצית גרעיני, מתחמי שהורכב נתפסו על מצופים streptavidin agarose חרוזים5,6,10. בעקבות האינטראקציה בין ביוטין streptavidin חזק במיוחד, חלבונים ותשמרו על חרוזים streptavidin היו eluted תחת denaturing תנאים על ידי הרתחה ב מרחביות, נותחו על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה. בעת גישה פשוטה זו זוהו מספר מרכיבי snRNP U7, זה הניב דגימות גסה יחסית, לעיתים קרובות מזוהם עם מספר רב של חלבונים רקע מאוגדים nonspecifically streptavidin חרוזים, שעשוי להיות מיסוך רכיבים מסוימים של את מכונות עיבוד ומניעת אצלם הזיהוי על כסף מוכתם ג'לים5,6,10. חשוב, גישה זו גם מנעה כל מחקרים תפקודית ועם החומר המבודד שלו טיהור נוספת כדי הומוגניות על ידי שיטות נוספות.

הוצעו מספר שינויים לאורך זמן לפנות את אופי האינטראקציה ביוטין/streptavidin, עם רובם תוכננה גם להחליש את האינטראקציה או לספק זרוע מרווח מבחינה כימית cleavable ב כמעט בלתי הפיך ביוטין המכילות ריאגנטים11,12. החיסרון של כל השינויים האלה היה כי הם להפחית באופן משמעותי את יעילות השיטה ו/או נדרש לעיתים קרובות תנאים שאינם-פיזיולוגיים במהלך השלב • תנאי, לסכן את תקינות או פעילות של החלבונים מטוהרים.

כאן, אנו מתארים גישה שונה כדי לפתור את הבעיה הטבועה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin באמצעות ה-RNA סובסטרטים שבו ביוטין covalently מחובר 5' סוף דרך 1 צילום-cleavable-(2-nitrophenyl) moiety אתיל זה רגיש זמן לנופף UV13,14. בדקנו גישה זו לטיהור של מכונות עיבוד U7 תלוית המגביל מ דרוזופילה ותמצית מידע יונקים גרעיני15. בעקבות של דגירה קצרה של ה-pre-mRNA היסטון ביוטין המכיל את מקשר צילום-cleavable עם תמצית גרעיני, מתחמי עיבוד שהורכב ותשמרו על streptavidin חרוזים, ביסודיות שטופים בעדינות פרסמה פתרון ביליד טופס על-ידי חשיפה לאור nm UV ~ 360. השיטה • UV-תנאי היא מאוד יעילה, מהירה וישירה, מניב כמויות מספיקות של snRNP U7 להמחיש מרכיביו מאת נכספת מכתים מ קטנה כמו 100 µL של תמצית15. החומר UV-eluted היא חינם של חלבונים רקע מתאים ניתוח ישירה ספקטרומטר מסה, צעדים נוספים טיהור מבחני אנזימטיות. יכול להיות מאומץ באותה השיטה לטיהור של אחרים מתחמי RNA/חלבון שדורשים אתרי קישור RNA קצר יחסית. ביוטין והמקשר צילום-cleavable יכול גם להיות covalently מצורף אל יחיד, כפול-גדילי ה-DNA, פוטנציאל הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של מתחמי DNA/חלבונים שונים.

סינתזה של סובסטרטים RNA המכיל covalently מצורף ביוטין, מקשר צילום-cleavable היא מעשית רק עם הרצפים עולה על ~ 65 נוקלאוטידים, נהיה יקר ולא יעיל עבור רצפי באופן משמעותי יותר. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גם גישה חלופית מתאימה יותר מטרות איגוד ה-RNA. בגישה זו, ה-RNA של כל רצף נוקלאוטיד לאורכה שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 או SP6 ואת annealed כדי oligonucleotide משלימה קצרה שמכיל ביוטין והמקשר צילום-cleavable בקצה 5' (טרנס תצורה). דופלקס תוצאות משתמשים לאחר מכן לטהר את הפרט מחייב חלבונים או קומפלקסים macromolecular על חרוזים streptavidin בעקבות באותו פרוטוקול המתואר לשם סובסטרטים RNA שמכיל ביוטין cleavable-צילום מצורף covalently (חבר העמים תצורה). עם השינוי הזה, ביוטין צילום-cleavable ניתן להשתמש בשילוב עם במבחנה שנוצר תעתיקים המכיל מאות נוקלאוטידים, הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של רחב טווח של RNA/חלבון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת הרקע

הערה: מצעים RNA קצרים יותר מאשר נוקלאוטידים ~ 65 יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין (B) והמקשר צילום-cleavable (pc) (המכונה יחד ביוטין צילום-cleavable או pcB) covalently המצורפת לקצה RNA 5' (תצורתציס ). מצעים RNA המכיל אתרי קישור באופן משמעותי יותר צריך להיות שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 (או SP6), לאחר מכן annealed כדי oligonucleotide מתאם משלימים קצר המכיל pcB moiety בקצה 5' (טרנס תצורת) (איור 1).

  1. אתרי קישור בהיקף של פחות מ 65 ~ נוקלאוטידים, להשתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית RNA עניין עם מעגלים מודפסים covalently המצורפת לקצה RNA 5' (איור 1A ואיור 2A). מתמוססים במים סטריליים כדי להיכנס לריכוז הרצוי ואחסן aliquots קטן ב- 80 ° c
  2. עבור אתרי קישור באופן משמעותי יותר מ ~ 65 נוקלאוטידים, טופס דופלקס חלקית של של במבחנה נוצר RNA של עניין oligonucleotide מתאם משלימים המכיל את moiety pcB בקצה 5' (איור 3 א).
    1. מבצע T7 שעתוק הדנ א של פלסמיד ליניארית או תבנית ה-PCR המתאימה ליצירת RNA עם אתר איגוד עניין המורחבת בקצה 3' על ידי רצף ~ 20-נוקלאוטיד שרירותי.
    2. השתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית של oligonucleotide מתאם משלים הסיומת 3' ב- RNA שנוצר על-ידי T7 ומכיל pcB בקצה 5' (איור 3 א).
      הערה: שני 18-atom מפרידי ו- 2-3 נוקלאוטידים שאינם משלימים ניתן להציב בקצה 5' של oligonucleotide כדי להפחית מכשלה הסטריים פוטנציאלי בין מתחם מאוגד streptavidin חרוזים. רצוי גם oligonucleotide הוא שונה בצורה אחידה עם 2' O-methyl קבוצה כדי לשפר את הכוח של דופלקס וכדי לספק עמידות נגד nucleases שונים.
    3. Anneal של RNA שנוצר על-ידי T7 כדי oligonucleotide מתאם pcB.
      1. מיקס 20 pmol של RNA ואת pmol 100 של oligonucleotide pcB מתאם (היחס 1:5 טוחנת) ב- mL 1.5 צינור µL 100 המכיל מאגר מחייב עם ההרכב הבא: 75 מ מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA).
        הערה: חשוב להשתמש כמות מזערית של oligonucleotide מתאם זה מספיק ליצור דופלקס עם סובסטרט pre-mRNA רוב (אם לא כל) המשמשים את התגובה מחזק. זה יכול בנוחות תיקבע על-ידי תיוג RNA המצע בקצה 5' עם 32P, חישול המצע שכותרתו עם הגדלת כמויות של מתאם oligonucleotide באמצעות שונים מאגר השמירה של תנאים וניטור אות רדיואקטיבי streptavidin חרוזים לאחר מספר שוטף של החרוזים עם המאגר מחייב.
      2. מקם את הצינור במים רותחים במשך 5 דקות.
      3. לאפשר למים להתקרר לטמפרטורת החדר.

2. מתחם הרכבה

  1. תוספת 1 מ"ל של תמצית גרעיני העכבר (או תמצית אחרת של הבחירה) עם 80 מ מ EDTA pH 8 כדי ריכוז סופי של 10 מ מ כדי לחסום nucleases תלויי-מטאל לא ספציפית הנוכחים התמצית.
    הערה: זה יגרום התאמת מאגר של התמצית להרכב אותו עד כדי כך במאגר של איגוד (ראה שלב כ- 1.2.3.1). EDTA אינה משפיעה על עיבוד במבחנה של היסטון pre-mRNAs, אך ייתכן מזיקים לטיהור חלבונים או מתחמים חלבון להרכיב באופן תלוי-מגנזיום. במקרים אלה, יש להימנע EDTA.
  2. להוסיף 5-10 pmol של המצע RNA עם moiety pcB ב- cis התגית (ראה צעד 1.1) או טרנסג'נדרים (ראה שלב 1.2.3.3) עד 1 מ"ל של התמצית המכיל 10 מ מ EDTA.
    הערה: הכמות של RNA צריך להיות המוגמרת בסדרה של ניסויים למשפט. באמצעות מדי סובסטרט RNA ולטיהור מתחם המגביל אולי לא מועיל, משמעותי בשיפור הרקע של RNA ספציפי מחייב חלבונים מבלי השפיע על היבול של חלבונים ספציפיים.
  3. דגירה המצע RNA עם תמצית למשך 5 דקות על קרח, מדי פעם לערבב את הדגימה.
    הערה: הן הזמן ואת הטמפרטורה של הדגירה צריך שתוקם מדעית והם עשויים להשתנות באופן משמעותי, בהתאם לאופי המתחם RNA/חלבון ספציפי.
  4. לסובב את התערובת הדגירה ב microcentrifuge טרום מקורר במשך 10 דקות ב 10,000 g x כדי להסיר את כל פוטנציאל פוחת משקעים ולאסוף בזהירות הימנעות supernatant העברת בגדר.

3. בטקטיקות של מתחמי ה-RNA/חלבון על חרוזים Streptavidin.

  1. להעביר ~ 100 µL streptavidin agarose חרוז השעיה מן הספק מסחרי (טבלה של חומרים) צינור 1.5 mL, להגדיל את נפח עם המאגר מחייב (75 מ"מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ EDTA).
    הערה: מאגר זה צריך להיות ההרכב אותו עד כדי כך את התערובת מחזק, תמצית המשמש להרכבה מורכבים (שלב 2.1).
  2. לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למשך 2-3 דקות ב 25 x g, וארוקן את תגובת שיקוע.
  3. חזור על הפעולות כביסה/ספינינג אותו 2 - 3 פעמים כדי equilibrate את החרוזים עם המאגר מחייב.
    הערה: בסוף שלב זה, בגדר של החרוזים צריך נפח של ~ 30 µL.
  4. לטעון את תגובת שיקוע המכיל המתחם שהורכב (שלב 2.4) מעל החרוזים agarose equilibrated streptavidin.
  5. סובב h 1 ב 4 ° C כדי לשתק RNA ו את מתחמי המאוגד על החרוזים.
  6. לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למשך 2-3 דקות ב 25 x g.
    הערה: השתמש חבטה החוצה הרוטור כדי למנוע אובדן משמעותי של החרוזים אם הם נוטים לדבוק הצד של הצינור בהרוטורים זוויתי.
  7. וארוקן את תגובת שיקוע ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל מאגר מחייב, באמצעות צנטריפוגה באותם התנאים.
  8. להוסיף 1 מ"ל של המאגר איגוד ולסובב את הדגימה h 1-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלב זה יכול להתקצר אם המתחם הקימו על המצע נוטה מביצועם.
  9. ספין למטה החרוזים למשך 2-3 דקות ב 25 x g, להוסיף 1 מ"ל של המאגר, להעביר את המתלים צינור חדש.
  10. סובב עבור h 1 נוספים או קצר יותר, אם המתחם אינה יציבה, ספין למטה למשך 2-3 דקות ב g 25 x, להעביר את החרוזים צינור 500 µL µL 200 איגוד המאגר.

4. UV-• תנאי.

  1. הפעל בעוצמה גבוהה מנורת UV פולטות אור UV nm 365 למשך 5-10 דקות לפני שהגיע מלא זוהר.
    הערה: זה חיוני כדי להשיג אנרגיה מקסימלית של פליטת UV בתחילתו של הקרנה.
  2. למלא את תחתית צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם קרח אציקלוביר, לערום אותו מעל המכסה של המנה.
  3. בקצרה מערבולת הצינור המכיל המתחם קיבוע, במקום זה בצורה אופקית על קרח ולכסות עם המנורה מראש ומחוממת, המבטיח כי המדגם ממוקם במרחק של 2-3 ס מ של פני השטח של הנורה.
    הערה: אם המרחק הוא גדול מדי, להשתמש פטרי נוספים או אובייקטים אחרים מתאימים להביא את הדגימה קרוב יותר אל הנורה.
  4. להאיר עבור סכום כולל של 30 דקות, לעתים קרובות היפוך, vortexing את הצינור כדי להבטיח חשיפה אחידה של ההשעיה UV וכדי למנוע התחממות יתר.
    הערה: כדי לספק קירור נוספים, הצעד • UV-תנאי יכול להתבצע בחדר קר. לעבור צלחת פטרי עם קרח טרי במקרה של יתר הקרח נמס.
  5. ספין למטה החרוזים למשך 2-3 דקות ב 25 x g ולאסוף את תגובת שיקוע.
  6. ספין מחדש את תגובת שיקוע משתמש באותם התנאים ולאסוף את תגובת שיקוע.
    הערה: השאר כמות קטנה של תגובת שיקוע בתחתית כדי למנוע העברה של חרוזים שיורית.

5. דגימת על ידי צביעת כסף ואחריו ספקטרומטר מסה.

  1. שימוש מרחביות/לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה להפרדת שבריר של תגובת שיקוע UV-eluted לבין השבר באותו חומר הותיר את החרוזים הבאים • תנאי UV.
    הערה: הניתוח עשוי לכלול גם את aliquot של חרוזים מופנמים מדגם לפני • UV-תנאי.
  2. מכתים את ג'ל המכיל חלבונים מופרדים באמצעות כסף זמין מסחרית מכתים קיט.
  3. להעריך את היעילות של UV-• תנאי על-ידי השוואת עוצמות של חלבונים נוכח תגובת שיקוע של UV-eluted, אלו שנשארו מאחור החרוזים בעקבות הקרנת UV.
  4. בלו הלהקות חלבון עניין, לקבוע את זהותם באמצעות ספקטרומטר מסה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים10,15.

6. ניתוח הכללית של UV-eluted מדגם ידי ספקטרומטר מסה.

  1. ישירות לנתח שבריר תגובת שיקוע UV eluted באמצעות ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את פרוטאום כולו של החומר מטוהרים בצורה בלתי לא משוחדת.
    הערה: ניתן לבצע זאת על ידי טיפול בבית-פתרון של הדגימות מטוהרים עם טריפסין ואחריו פרוטוקולים סטנדרטיים ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את זהותו של צור פפטידים10,15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטה • UV-תנאי נבדקה יחד עם שני מצעים RNA מסונתז כימית covalently מצורף בקצה 5' pcB moiety (תצורתציס ): pcB-SL (איור 1) ו- pcB-dH3/5 מ' RNAs (איור 2). 31-נוקלאוטיד pcB-SL RNA מכיל מבנה גזע לופ ואחריו זנב תקועים 5-נוקלאוטיד יחיד והוא רצף שלו זהה 3' סוף היסטון בוגרת mRNA (כ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וחוץ שילוב מקשר צילום-cleavable, השלב • UV-תנאי אינו נבדל מן השיטות הנפוצות לנצל מאוד חזקה האינטראקציה בין ביוטין streptavidin. הצעד • UV-תנאי יעילה מאוד, בדרך כלל שחרור יותר מ-75 אחוזים הרנ א קיבוע ומקושרת מהחלבונים streptavidin חרוזים, כשמאחוריו רקע גבוה של חלבונים הלא ספציפית לא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgements

אנו מודים העמיתים שלנו, משתפי פעולה על תרומתם לעבודה שלנו. מחקר זה נתמך על ידי NIH להעניק GM 29832.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Streptavidin-AgaroseSigmaS1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lampCole-ParmerUX-97600-00
Replacement bulbCole-ParmerUX-97600-19100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cisDharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotorBeckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)PromegaP1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)PromegaP1280
Pierce Silver Stain KitThermoFisher Scientific24612

References

  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143RNAstreptavidincleavableUVU7 snRNP3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved