Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

Zusammenfassung

RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.

Zusammenfassung

Seit vielen Jahren ist die außergewöhnlich starke und rasch gebildete Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin erfolgreich für die partielle Reinigung der biologisch wichtigen RNA/Proteinkomplexe verwendet worden. Diese Strategie leidet jedoch einen großen Nachteil, die die breitere Nutzung begrenzt: die Biotin/Streptavidin-Interaktion kann gebrochen werden, nur unter denaturierenden Bedingungen, die die Integrität der eluierten komplexe, so dass auch stören ihre anschließenden Funktionsanalyse und/oder weitere Reinigung durch andere Methoden. Darüber hinaus sind die eluierten Proben häufig mit Hintergrund-Proteine verunreinigt, die nonspecifically mit Streptavidin-Perlen, erschwert die Analyse der gereinigten komplexe durch silberne Färbung und Massenspektrometrie zuordnen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine Variante der Biotin/Streptavidin-Strategie in dem Biotin ist eine RNA-Substrat über einen Foto-spaltbaren Linker angebracht und die komplexe an Streptavidin Perlen immobilisiert sind selektiv eluiert Lösung in einer nativen Form durch langwellige UV, so dass die Hintergrund-Proteine auf die Perlen. Kürzere RNA bindenden Substraten können chemisch mit Biotin und der Foto-spaltbaren Linker kovalent an das 5'-Ende der RNA angeschlossen synthetisiert werden, während längeren RNA Substrate mit den beiden Gruppen von komplementären Oligonukleotids bereitgestellt werden können. Diese beiden Varianten der UV-Elution Methode zur Reinigung der U7 SnRNP-abhängige Verarbeitung komplexe, die Histone Pre-mRNAs am 3'-Ende cleave getestet wurden und beide bewiesen, günstig im Vergleich zu anderen zuvor Reinigungsverfahren entwickelt. Die UV-eluiert Proben enthalten leicht nachweisbare Mengen an der U7-SnRNP, die frei von großen Protein Verunreinigungen und geeignet für die direkte Analyse von Massenspektrometrie und funktionelle Assays wurde. Das beschriebene Verfahren kann leicht für die Reinigung der andere RNA-bindende komplexe angepasst und verwendet in Verbindung mit Einzel- und Doppelstrang-DNA-Bindungsstellen zur Reinigung von DNA-spezifische Proteine und makromolekulare komplexe.

Einleitung

In den Eukaryotes unterzogen RNA-Polymerase II-generierte mRNA Vorstufen (Pre-mRNAs) mehrere Reifung Ereignissen im Zellkern vor immer voll funktionsfähige mRNA-Vorlagen für die Proteinsynthese im Zytoplasma. Eines dieser Ereignisse ist 3' End-Verarbeitung. Für die überwiegende Mehrheit der Pre-mRNAs umfasst 3' Ende Verarbeitung Spaltung an Polyadenylation gekoppelt. Diese zweistufige Reaktion ist katalysiert durch ein relativ reichlich Komplex bestehend aus mehr als 15 Proteine¹. Tier-Replikation-abhängige Histon Pre-mRNAs werden am 3'-Ende durch einen anderen Mechanismus verarbeitet in denen die Schlüsselrolle von U7 SnRNP, eine niedrige Fülle Komplex bestehend aus U7 SnRNA ~ 60 Nukleotide und mehrere Proteine^2,3 gespielt wird . Die U7 SnRNA Basenpaare mit einer bestimmten Reihenfolge in Histon Pre-mRNA und eine der Untereinheiten der U7 SnRNP katalysiert die Spaltung Reaktion, Generierung von Reifen Histon mRNA ohne eine poly(A) tail. 3' End-Verarbeitung von Histon Pre-mRNA erfordert auch Stem-Loop Binding Protein (SLBP), die eine erhaltene Stamm-Schleife befindet sich bindet die Spaltstelle stromaufwärts und fördert die Einstellung von der U7 SnRNP Substrat^2,3. Studien zur Identifizierung einzelner Komponenten der U7-SnRNP wurden durch die geringe Konzentration von U7-SnRNP in tierischen Zellen und die Tendenz des Komplexes zu distanzieren oder teilweise Proteolyse zu unterziehen, während der Reinigung durch den Einsatz von anspruchsvoll Feinwaschmittel^4,5,6, hohe Salz wäscht und/oder mehrere chromatographische Schritte^7,8,9.

Vor kurzem, um die Zusammensetzung der U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen zu ermitteln, wurde ein kurzes Fragment von Histon Pre-mRNA enthält Biotin auf 3' oder 5' mit einem nuklearen Extrakt inkubiert und die montierten Anlagen wurden gefangen genommen, auf Streptavidin beschichteten Agarose Korne^5,6,10. Aufgrund der außergewöhnlich starken Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin Proteine auf Streptavidin Perlen immobilisiert eluiert unter denaturierenden Bedingungen durch Kochen in SDS und durch silberne Färbung und Massenspektrometrie analysiert. Während diesem einfache Ansatz eine Reihe von Komponenten der U7 SnRNP identifiziert, ergab es relativ primitiven Proben, oft mit einer großen Anzahl von Hintergrund-Proteinen nonspecifically verpflichtet Streptavidin Perlen, möglicherweise einige Komponenten der Maskierung kontaminiert die Verarbeitungsmaschinen und verhindern, dass ihre Erkennung auf Silber gefärbt Gele^5,6,10. Wichtig ist, diesen Ansatz ausgeschlossen auch funktionellen Studien mit dem isolierten Material und dessen weitere Reinigung zur Homogenität durch zusätzliche Methoden.

Eine Reihe von Änderungen wurden vorgeschlagen, im Laufe der Zeit an die praktisch Unumkehrbarkeit Biotin/Streptavidin-Interaktion, die meisten davon entwerfend, entweder die Interaktion zu schwächen oder zu einem chemisch spaltbaren Abstandhalter Arm in die Biotin-haltigen Reagenzien^11,12. Der Nachteil dieser Änderungen war, dass sie deutlich die Effizienz der Methode bzw. oft nicht physiologischen Bedingungen während der Elution Schritt, gefährden die Integrität oder die Aktivität der gereinigten Proteine reduzieren.

Hier beschreiben wir einen anderen Ansatz zur Lösung des inhärenten Problems der Biotin/Streptavidin-Strategie mittels RNA Substrate, in denen Biotin ist kovalent an das 5' Ende über eine Foto-spaltbaren 1-(2-Nitrophenyl) Ethyl-Verbindungsgruppe, die empfindlich gegen UV^13,14lange Welle. Wir testeten diese Vorgehensweise für die Reinigung der begrenzende U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen von Drosophila und Säugetieren nuklearen extrahiert¹⁵. Nach einer kurzen Inkubation von Histon Pre-mRNA enthalten Biotin und der Foto-spaltbaren Linker mit einem nuklearen Extrakt die versammelten Verarbeitung komplexe auf Streptavidin Perlen immobilisiert, gründlich gewaschen und sanft in eine Native Lösung veröffentlicht Form durch die Einwirkung von ~ 360 nm UV-Licht. Die UV-Elution Methode ist sehr effizient, schnell und unkompliziert, mit ausreichenden Mengen an der U7-SnRNP, seine Komponenten durch Splitter von weniger als 100 µL der Extrakt¹⁵Färbung zu visualisieren. Das UV-eluiert Material ist frei von Hintergrund-Proteine und für direkte Massenspektrometrie Analyse, zusätzliche Reinigungsschritte und enzymatische Assays geeignet. Die gleiche Methode kann zur Reinigung von anderen RNA/Proteinkomplexe angenommen werden, die relativ kurze RNA-Bindungsstellen erfordern. Biotin und der Foto-spaltbaren Linker können auch kovalent, Einzel - und doppelsträngige DNA, potenziell Verlängerung der UV-Elution Methode zur Reinigung von verschiedenen DNA/Protein-komplexe befestigt werden.

Chemische Synthese von RNA-Substrate mit kovalent angebracht Biotin und der Foto-spaltbaren Linker ist praktisch nur mit den Sequenzen, die nicht mehr als ~ 65 Nukleotide, teuer und ineffizient für deutlich längere Sequenzen. Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir auch einen alternativen Ansatz, der für viel länger RNA-bindende Ziele geeignet ist. Bei diesem Ansatz RNA von beliebiger Länge und Nukleotid-Reihenfolge ist generierten in Vitro durch T7 oder SP6 Transkription und geglüht, eine kurze ergänzende Oligonukleotid enthält Biotin und der Foto-spaltbaren Linker am 5'-Ende (trans (Konfiguration). Resultierende Duplex wird anschließend verwendet, um einzelne bindende Proteine oder makromolekulare komplexe auf Streptavidin-Perlen, die nach dem gleichen Protokoll beschrieben für die RNA-Substrate mit Foto-spaltbaren Biotin kovalent verbunden zu reinigen (GUS Konfiguration). Mit dieser Änderung kann die Foto-spaltbaren Biotin in Verbindung mit in Vitro generierten Protokolle mit Hunderten von Nukleotiden, Erweiterung der UV-Elution Methode zur Reinigung von einer breiten Palette RNS/Protein verwendet werden.

Protokoll

(1) Substrataufbereitung

Hinweis: RNA Substrate kürzer als ~ 65 Nukleotide mit Biotin (B) und der Foto-spaltbaren (pc)-Linker (zusammen bezeichnet als Foto-spaltbaren Biotin oder pcB) kovalent an die RNA 5'-Ende (Cis -Konfiguration) befestigt chemisch synthetisiert werden können. RNA-Substrate, enthält deutlich mehr Bindungsstellen generierten in Vitro durch T7 (oder SP6) Transkription sein müssen und anschließend geglüht, eine kurze ergänzende Adapter Oligonukleotid mit pcB glyko-am 5'-Ende (trans -Konfiguration) (Abbildung 1).

1. Für Bindungsstellen bestehend aus weniger als 65 ~ Nukleotide, verwenden Sie einen kommerzielle Hersteller (Table of Materials), um chemisch RNS von Interesse zu synthetisieren mit pcB kovalent befestigt an die RNA 5'-Ende (Abbildung 1A und Abbildung 2A). Lösen sich in sterilem Wasser die gewünschte Konzentration zu erreichen und Speicherung in kleinen Aliquote bei-80 ° C.
2. Für Bindungsstellen erzeugt deutlich mehr als ~ 65 Nukleotide, Form eine teilweise Maisonette einer in-vitro- RNA von Interesse und eine ergänzende Adapter Oligonukleotid mit pcB glyko-am 5'-Ende (Abbildung 3A).
   1. Führen Sie T7 Transkription auf entweder eine linearisierte Plasmid-DNA oder ein entsprechendes Template PCR-RNA mit der Bindungsstelle des Interesses verlängert durch eine willkürliche ~ 20-Nukleotid-Sequenz am 3'-Ende zu erzeugen.
   2. Verwenden Sie einen kommerzielle Hersteller (Table of Materials), um chemisch ein Adapter Oligonukleotid zu synthetisieren, das an die 3'-Erweiterung in der T7 erzeugten RNA komplementär und enthält pcB am 5'-Ende (Abbildung 3A).
      Hinweis: Zwei 18-Atom Abstandhalter und 2-3-ergänzende Nukleotide können am 5'-Ende des Oligonukleotids zur Verringerung möglicher sterische Behinderung zwischen dem gebundenen komplex und Streptavidin Perlen platziert werden. Es ist auch wünschenswert, dass das Oligonukleotid gleichmäßig mit einer 2' O-Methyl Gruppe, zu der Stärke des Duplex zu erhöhen und zur Resistenz gegen verschiedene Nukleasen geändert wird.
   3. Tempern Sie die T7-generierte RNA zu pcB-Adapter Oligonukleotid.
      1. Mix 20 Pmol der RNA und 100 Pmol des Adapter pcB Oligonukleotids (molares Verhältnis 1:5) in einer 1,5 mL tube mit 100 µL Bindung Puffer mit folgender Zusammensetzung: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15 % Glycerin, 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA).
         Hinweis: Es ist wichtig, eine minimale Menge des Oligonukleotids Adapter verwenden, die ausreicht, um ein Duplex mit den meisten (wenn nicht sogar alle) Pre-mRNA-Substrat in das Glühen Reaktion verwendet zu bilden. Dies konnte bequem bestimmt werden durch RNA-Substrat am 5'-Ende mit ³²P, Glühen die beschriftete Substrat mit steigenden Mengen der Adapter Oligonukleotid mit Kennzeichnung verschiedene Puffer-Bedingungen und die Beibehaltung der Überwachung der radioaktive Signal Streptavidin Perlen nach mehreren Wäschen der Perlen mit der Bindung Puffer.
      2. Platzieren Sie das Rohr in kochendem Wasser für 5 Minuten.
      3. Lassen Sie das Wasser auf Zimmertemperatur abkühlen lassen.

2. komplexe Montage

1. Ergänzung 1 mL einer Maus nuklearen Extrakt (oder eine andere Wahl-Extrakt) mit 80 mM EDTA pH 8, eine Endkonzentration von 10 mM, unspezifische Metall-abhängige Nukleasen zu blockieren, die in dem Extrakt vorhanden sind.
   Hinweis: Dadurch wird bei der Anpassung der Puffer in der Extrakt für die gleiche Zusammensetzung wie die in der Bindung Puffer (siehe Schritt 1.2.3.1). EDTA hat keinen Einfluss auf in-vitro- Verarbeitung von Histon Pre-mRNAs aber möglicherweise schädlich bei der Reinigung, Proteine oder Proteinkomplexe, die in einem Magnesium-abhängigen Weise montieren. In diesen Fällen sollte EDTA vermieden werden.
2. Hinzufügen von 5-10 Pmol von der RNA-Substrat mit dem Stichwort pcB glyko-in GUS-Staaten (siehe Schritt 1.1) oder Trans (siehe Schritt 1.2.3.3) zu 1 mL des Extrakts mit 10 mM EDTA.
   Hinweis: Die Menge an RNA muss sorgfältig in einer Versuchsreihe Studie ausgewertet werden. Verwenden zu viel RNA-Substrat für die Reinigung eines begrenzenden komplexes vielleicht kontraproduktiv, den Hintergrund der unspezifischen RNA-bindende Proteine deutlich zu erhöhen, ohne jede Wirkung auf die Ausbeute an spezifische Proteine.
3. Inkubieren Sie die RNA-Substrat mit dem Extrakt für 5 min auf Eis, gelegentlich mischen der Probenmaterials.
   Hinweis: Sowohl die Zeit und die Temperatur der Inkubation müssen empirisch festgelegt und variieren erheblich, je nach den Besonderheiten der RNS/Protein-Komplex.
4. Drehen Sie die Inkubation Mischung in einem vorgekühlten Microcentrifuge für 10 min bei 10.000 x g entfernen jede möglichen Ausscheidungen und sorgfältig zu sammeln, den Überstand zu vermeiden Übertragung der Pellets.

(3) Immobilisierung von RNA/Proteinkomplexe an Streptavidin Perlen.

1. Ein 1,5 mL-Tube übermitteln Sie ~ 100 µL Streptavidin Agarose Bead Aussetzung von einem kommerziellen Anbieter (Table of Materials) und erhöhen Sie die Lautstärke mit dem verbindlichen Puffer (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15 % Glycerin, 10 mM EDTA).
   Hinweis: Dieser Puffer sollte die gleiche Zusammensetzung wie das Glühen Mischung und der Extrakt für komplexe Montage (Schritt 2.1) verwendet haben.
2. Sammeln Sie die Perlen an der Unterseite des Rohres durch Spinnen für 2-3 min bei 25 X g und aspirieren Sie überstand.
3. Wiederholen Sie den Vorgang waschen/Spinnerei 2-bis 3-Mal um die Perlen mit dem verbindlichen Puffer equilibrate.
   Hinweis: Am Ende dieses Schrittes das Pellet der Perlen sollte haben ein Volumen von ~ 30 µL.
4. Laden Sie den Überstand mit der montierten Anlage (Schritt 2.4) über äquilibriert Streptavidin Agarose Korne.
5. Drehen Sie 1 h bei 4 ° C, RNA und die gebundene komplexe an den Perlen zu immobilisieren.
6. Sammeln Sie die Perlen an der Unterseite des Rohres durch Spinnen für 2-3 min bei 25 X g.
   Hinweis: Verwenden Sie eine Schaukel, Rotor um zu erheblichen Verlust der Perlen zu vermeiden, wenn sie neigen dazu, an der Seite des Rohres in eckige Rotoren halten.
7. Aspirieren Sie überstand und spülen Sie die Perlen zweimal mit 1 mL des Puffers Bindung, mit den gleichen Bedingungen der Zentrifugation.
8. Fügen Sie 1 mL des Puffers Bindung und drehen Sie die Probe 1 h bei 4 ° C.
   Hinweis: Dieser Schritt kann verkürzt werden, wenn die Anlage auf dem Substrat gebildet neigt zu distanzieren.
9. Spin-down die Perlen für 2 – 3 min. 25 X g, fügen Sie 1 mL des Puffers und die Aussetzung zu einem neuen Schlauch übertragen.
10. Für weitere 1 h kürzer, wenn die Anlage nicht stabil ist oder zu drehen, spin-down für 2-3 min bei 25 X g und die Perlen auf einem 500 µL Rohr in 200 µL Bindung Puffer übertragen.

4. UV-Elution.

1. Schalten Sie eine hochintensive UV-Licht emittierende 365 nm UV-Licht für 5-10 min vor vollem Glanz zu erreichen.
   Hinweis: Dies ist wichtig, die maximalen Energie der UV-Emission zu Beginn der Bestrahlung zu erreichen.
2. Füllen Sie den Boden einer Petrischale (100 x 15 mm) mit dicht gepackten Eis und legen Sie es über die Schüssel Deckel.
3. Kurz Wirbel das Röhrchen mit der immobilisierten Komplex, platzieren Sie es horizontal auf Eis und Abdeckung mit der vorgewärmten Lampe, um sicherzustellen, dass die Probe im Abstand von 2-3 cm von der Oberfläche des Kolbens befindet.
   Hinweis: Wenn der Abstand zu groß ist, verwenden Sie zusätzliche Petrischalen oder andere geeignete Objekte, die Birne des Beispiels näher bringen.
4. Bestrahlen Sie für insgesamt 30 min, häufig invertieren und vortexen das Rohr um gleichmäßige UV-Exposition des Fahrwerks sicherzustellen und um eine Überhitzung zu verhindern.
   Hinweis: Um zusätzliche Kühlung zu gewährleisten, kann der UV-Elution Schritt in einem kalten Raum durchgeführt werden. Wechseln Sie in eine Petrischale mit frischem Eis bei übermäßigen Eis schmilzt.
5. Spin-down die Perlen für 2 – 3 min. 25 X g und den Überstand zu sammeln.
6. Re-spin des Überstands mit den gleichen Bedingungen und den Überstand zu sammeln.
   Hinweis: Lassen Sie eine kleine Menge Überstand an der Unterseite zu vermeiden Übertragung der restliche Perlen.

5. Probe Analyse durch silberne Färbung gefolgt von Massenspektrometrie.

1. Verwendung SDS/Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einen Bruchteil des Überstands UV eluiert und den gleichen Anteil des Materials auf die Perlen UV Elution nach links zu trennen.
   Hinweis: Die Analyse gehören auch ein Aliquot der Perlen aus der Probe vor UV-Elution zurückgezogen.
2. Färben Sie das Gel, die getrennten Proteine mit einem handelsüblichen Silber Färbung Kit enthalten.
3. Bewerten Sie die Effizienz des UV-Elution durch den Vergleich der Intensitäten von Proteinen in der UV-eluiert überstand und die Links auf die Perlen nach UV-Bestrahlung.
4. Verbrauchsteuern Sie die Protein-Bands von Interesse und bestimmen Sie ihre Identität durch Massenspektrometrie mit Standardprotokollen^10,15.

6. globale Analyse der UV-eluiert Probe durch Massenspektrometrie.

1. Analysieren Sie direkt einen Bruchteil der UV-eluiert Überstand durch Massenspektrometrie das gesamte Proteom des gereinigten Materials unvoreingenommen zu bestimmen.
   Hinweis: Dies kann durch in-Lösung Behandlung der gereinigten Proben mit Trypsin gefolgt von standard-Massenspektrometrie Protokolle zur Ermittlung der Identität der generieren Peptide^10,15erfolgen.

Ergebnisse

Die UV-Elution Methode wurde getestet mit zwei chemisch synthetisierte RNA-Substraten kovalent befestigt am 5'-Ende der Platine glyko-(Cis -Konfiguration): pcB-SL (Abbildung 1) und pcB-dH3/5 m RNAs (Abbildung 2). 31-Nukleotid-pcB-SL-RNA enthält eine Haarnadelstruktur, gefolgt von einen 5-Nukleotid einzelne gestrandeten Schweif und seiner Sequenz ist identisch mit dem 3' Ende der Reife Histon mRNA (i.e., nach de...

Diskussion

Die hier beschriebene Methode ist unkompliziert und neben der Einbeziehung eines Foto-spaltbaren Linkers und der UV-Elution Schritt unterscheidet sich nicht von den gängigen Methoden, die die extrem starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin nutzen. Der UV-Elution Schritt ist sehr effizient, in der Regel die Freigabe mehr als 75 % der immobilisierten RNA und Proteine aus Streptavidin Perlen, hinterlässt einen hohen Hintergrund von Proteinen, die unspezifisch an die Perlen zu binden verbunden. Durch den Wegf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612