Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

Riepilogo

Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.

Abstract

Per molti anni, eccezionalmente forte e rapidamente formato interazione biotina streptavidina è stata utilizzata con successo per purificazione parziale dei complessi RNA/proteine biologicamente importanti. Tuttavia, questa strategia soffre di uno dei principali svantaggi che limita il suo utilizzo più ampio: l'interazione biotina/streptavidina può essere rotto solo sotto denaturare condizioni che anche compromettere l'integrità dei complessi eluiti, quindi precludendo loro successive analisi funzionale e/o ulteriore purificazione da altri metodi. Inoltre, i campioni eluiti sono spesso contaminati con le proteine di sfondo che non specifico associano con streptavidina perline, che complica l'analisi dei complessi purificati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una variante della biotina/streptavidina strategia in cui biotina è collegata a un RNA substrato tramite un linker foto-spaccabili e i complessi immobilizzati su streptavidina perline sono eluiti selettivamente alla soluzione in un formato nativo di onda lunga UV, lasciando le proteine di sfondo sui branelli. Substrati di associazione più breve RNA possono essere sintetizzati chimicamente con biotina e il linker foto-spaccabili legame covalente all'estremità 5' del RNA, mentre più substrati di RNA possono essere forniti con i due gruppi di un oligonucleotide complementare. Queste due varianti del metodo UV-eluizione sono state testate per la purificazione dei complessi elaborazione snRNP-dipendente U7 che fendono istone pre-mRNA all'estremità 3' e hanno entrambi dimostrato di reggono il confronto ad altri precedentemente sviluppato metodi di purificazione. I campioni eluiti UV contengono quantità molto facilmente rilevabile delle snRNP U7 che era esente dagli agenti inquinanti principali proteine e adatto per l'analisi diretta di spettrometria di massa e saggi funzionali. Il metodo descritto può essere prontamente adattato per la purificazione di altri complessi di associazione di RNA e utilizzato in combinazione con siti di legame del DNA singolo - e double-stranded per purificare proteine DNA-specifico e complessi macromolecolari.

Introduzione

Negli eucarioti, precursori di RNA polimerasi II-generato mRNA (pre-mRNA) sottoporsi a diversi eventi di maturazione nel nucleo prima di diventare pienamente funzionali modelli di mRNA per la sintesi proteica nel citoplasma. Uno di questi eventi è di processamento dell'estremità 3'. Per la stragrande maggioranza dei pre-mRNA, 3' fine trattamento comporta clivaggio accoppiato di poliadenilazione. Questa reazione in due fasi è catalizzata da un complesso relativamente abbondante composto da più di 15 proteine¹. Animale replica-dipendente dell'istone pre-mRNA vengono elaborati all'estremità 3' da un meccanismo differente in cui il ruolo chiave è giocato da U7 snRNP, una scarsa abbondanza complesso composto da U7 snRNA di ~ 60 nucleotidi e più proteine^2,3 . Le coppie di basi U7 snRNA con specifiche sequenze di istone pre-mRNA e uno delle subunità della snRNP U7 catalizza la reazione di scissione, generando maturo istone mRNA senza un poli (a) coda. 3' terminare l'elaborazione di istone pre-mRNA richiede anche gambo-ciclo Binding Protein (SLBP), che associa un gambo-ciclo conservato situato a Monte del sito di clivaggio e migliora l'assunzione delle snRNP U7 al substrato^2,3. Gli studi finalizzati ad individuare i singoli componenti delle snRNP U7 sono stati impegnativi a causa della bassa concentrazione delle snRNP U7 in cellule animali e la tendenza del complesso di dissociare o subiscono parziale proteolisi durante la purificazione come conseguenza dell'utilizzo detergenti delicati^4,5,6, lavaggi sale alte e/o più passaggi cromatografici^7,8,9.

Recentemente, per determinare la composizione dell'apparato di elaborazione U7-dipendente, un breve frammento di biotina contenenti pre-mRNA di istone 3' o 5' è stato incubato con un estratto nucleare e i complessi montati sono stati catturati su rivestite con streptavidina agarosio perline^5,6,10. A causa di eccezionalmente forte interazione biotina streptavidina, proteine immobilizzate su streptavidina perline sono stati eluiti sotto condizioni di denaturazione bollendo in SDS e analizzati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Mentre questo approccio semplice ha individuato una serie di componenti delle snRNP U7, ha reso relativamente grezzi campioni, spesso contaminati con un gran numero di proteine sfondo non specifico associato a perle di streptavidina, potenzialmente mascherare alcuni componenti di i macchinari di lavorazione e prevenire la loro rilevazione su argento macchiato gel^5,6,10. D'importanza, questo approccio anche precluso qualsiasi studi funzionali con il materiale isolato e suo ulteriore purificazione per omogeneità di metodi aggiuntivi.

Sono state proposte una serie di modifiche nel tempo per affrontare la natura praticamente irreversibile dell'interazione biotina/streptavidina, con la maggior parte di loro essendo progettato per indebolire o l'interazione o per fornire un braccio spaziatore chimicamente spaccabili nella biotina-contenere i reagenti^11,12. L'inconveniente di tutte queste modifiche era che riducono in modo significativo l'efficienza del metodo e/o condizioni di non-fisiologica spesso richieste durante la fase di eluizione, compromettere l'integrità o la attività delle proteine purificate.

Qui, descriviamo un approccio diverso per risolvere il problema inerente della strategia di biotina/streptavidina utilizzando RNA substrati in cui la biotina è covalente al 5' estremità tramite una foto-spaccabili 1-(2-nitrofenil) frazione etilico che è sensibile alla lunghezza d'onda UV^13,14. Abbiamo testato questo approccio per la purificazione dell'apparato di elaborazione limitante U7-dipendente dalla drosofila e mammiferi nucleari estratti¹⁵. Dopo una breve incubazione di biotina contenenti pre-mRNA di istone e il linker foto-spaccabili con un estratto nucleare, i complessi di elaborazione assemblati sono immobilizzati su perle di streptavidina, lavati accuratamente e delicatamente rilasciati alla soluzione in un nativo forma di esposizione a ~ 360 nm UV luce. Il metodo UV-eluizione è molto efficiente, veloce e semplice, producendo una quantità sufficiente delle snRNP U7 per visualizzare i componenti di scheggia colorazione da appena 100 µ l di Estratto di¹⁵. Il materiale UV-eluito è privo di proteine sfondo e adatto per analisi di spettrometria di massa diretto, fasi di purificazione supplementare e saggi enzimatici. Lo stesso metodo può essere adottato per la purificazione di altri complessi di RNA/proteine che richiedono relativamente brevi siti di legame di RNA. Biotina e il linker foto-spaccabili può anche essere in covalenza collegati al singolo - e double-stranded DNA, potenzialmente estendendo il metodo UV-eluizione per la depurazione di vari complessi di DNA/protein.

Sintesi chimica di substrati di RNA contenenti covalenza collegato biotina e il linker foto-spaccabili è pratico solo con le sequenze che non superano i nucleotidi ~ 65, diventando costoso e inefficiente per sequenze significativamente più lungo. Per risolvere questo problema, abbiamo anche sviluppato un metodo alternativo che è adatto per molto più tempo obiettivi vincolanti di RNA. In questo approccio, RNA di qualsiasi sequenza del nucleotide e lunghezza è generato in vitro di T7 e SP6 la trascrizione e ricotto per un breve oligonucleotide complementare che contiene biotina e il linker foto-spaccabili all'estremità 5' (trans configurazione). Il duplex risultante viene successivamente utilizzato per purificare proteine leganti singoli o complessi macromolecolari su streptavidina perline seguendo lo stesso protocollo descritto per i substrati di RNA contenenti foto-spaccabili biotina associata covalentemente (cis configurazione). Con questa modifica, la biotina foto-spaccabili utilizzabile in combinazione con le trascrizioni in vitro generato contenente centinaia di nucleotidi, estendendo il metodo UV-eluizione per la purificazione di una vasta gamma di RNA/proteine.

Protocollo

1. preparazione del substrato

Nota: Substrati RNA inferiore a ~ 65 nucleotidi possono essere sintetizzati chimicamente con biotina (B) e il linker di foto-spaccabili (pc) (insieme denominati foto-spaccabili biotina o pcB) legame covalente all'estremità 5' RNA (configurazionecis ). Substrati di RNA contenenti siti di legame significativamente più lunghi devono essere generati in vitro da T7 (o SP6) trascrizione e successivamente ricotto per un oligonucleotide di breve adattatore complementare contenente parte di pcB all'estremità 5' (trans configurazione) (Figura 1).

1. Per siti di legame costituito da meno di ~ 65 nucleotidi, utilizzare un fornitore commerciale (Tabella materiali) per sintetizzare chimicamente il RNA di interesse con pcB covalenza collegato all'estremità 5' RNA (Figura 1A e Figura 2A). Sciogliere in acqua sterile per ottenere la concentrazione desiderata e memorizzare in piccole aliquote a-80 ° C.
2. Per i siti di legame significativamente più a lungo ~ 65 nucleotidi, forma un duplex parziale di un in vitro generato RNA di interesse e un oligonucleotide complementare adattatore contenente la frazione di pcB all'estremità 5' (Figura 3A).
   1. Eseguire T7 trascrizione su un DNA del plasmide linearizzato o un appropriato modello PCR per generare RNA con il sito di legame di interesse esteso all'estremità 3' da una sequenza arbitraria di ~ 20-nucleotide.
   2. Utilizzare un fornitore commerciale (Tabella materiali) per sintetizzare chimicamente un oligonucleotide di adattatore che è complementare all'estensione 3' nel RNA T7-generato e contiene pcB all'estremità 5' (Figura 3A).
      Nota: Due distanziali 18-atomo e nucleotidi non complementari 2-3 possono trovarsi all'estremità 5' dell'oligonucleotide per ridurre potenziale sterico fra il complesso associato e streptavidina perline. È anche auspicabile che il oligonucleotide è uniformemente modificato con un 2' O-metil gruppo per aumentare la resistenza del duplex e per fornire la resistenza contro vari nucleasi.
   3. Temprare il RNA T7-generato il oligonucleotide adattatore pcB.
      1. Mix 20 pmol del RNA e 100 pmol dell'oligonucleotide adattatore pcB (rapporto molare 1:5) in un 1,5 mL tubo contenente 100 µ l di tampone di associazione con la seguente composizione: 75 mM KCl, pH di 15 mM HEPES 7.9, 15% glicerolo, acido etilendiamminotetracetico 10mm (ed).
         Nota: È importante utilizzare una quantità minima dell'oligonucleotide adattatore che sia sufficiente a formare un duplex con la maggior parte (se non tutti) substrato pre-mRNA utilizzato nella reazione di ricottura. Questo potrebbe essere convenientemente determinato dall'etichettatura RNA substrato all'estremità 5' con ³²P, ricottura del substrato con etichettato con quantità crescenti dell'adattatore del oligonucleotide utilizzando vari buffer condizioni e monitoraggio la ritenzione della segnale radioattivo su streptavidina perline dopo diversi lavaggi delle perline con il buffer di associazione.
      2. Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 min.
      3. Lasciare che l'acqua si raffreddi a temperatura ambiente.

2. complesso assemblaggio

1. Supplemento 1 mL di un estratto nucleare del mouse (o un altro estratto di scelta) con pH di EDTA 80 mM 8 a una concentrazione finale di 10 mM per bloccare aspecifiche nucleasi di metallo-dipendenti che sono presenti nell'estratto.
   Nota: Questo si tradurrà in buffer nell'estratto per la stessa composizione che nel buffer di associazione di regolazione (Vedi punto 1.2.3.1). EDTA non influenza in vitro l'elaborazione di istone pre-mRNA, ma può essere dannoso nel purificare proteine o complessi della proteina che assemblare in modo magnesio-dipendente. In questi casi, EDTA dovrebbe essere evitato.
2. Aggiungere 5-10 pmol di RNA substrato taggato con la frazione di pcB in cis (vedi passaggio 1.1) o trans (Vedi punto 1.2.3.3) a 1 mL di estratto contenente da 10 mM EDTA.
   Nota: La quantità di RNA deve essere attentamente valutati in una serie di esperimenti di prova. Usando troppo RNA substrato per la purificazione di un complesso limitano forse controproducente, aumentando significativamente sullo sfondo delle proteine di legame aspecifici RNA senza avere alcun effetto sulla resa di proteine specifiche.
3. Incubare il RNA substrato con l'estratto per 5 minuti sul ghiaccio, mescolando occasionalmente il campione.
   Nota: Sia il tempo e la temperatura di incubazione devono essere stabiliti empiricamente e possono variare sensibilmente, a seconda della natura specifica del complesso RNA/proteine.
4. Girare la miscela di incubazione in una microcentrifuga pre-raffreddata per 10 min a 10.000 x g per rimuovere qualsiasi potenziale precipitati e accuratamente raccogliere il surnatante evitando trasferendo il pellet.

3. immobilizzazione dei complessi RNA/proteine streptavidina perline.

1. ~ 100 µ l della sospensione di streptavidina agarosio perlina di trasferimento da un fornitore commerciale (Tabella materiali) in una provetta da 1,5 mL e aumentare il volume con il buffer di associazione (75 mM KCl, pH di 15 mM HEPES 7.9, 15% glicerolo, 10mm EDTA).
   Nota: Questo buffer dovrebbe avere la stessa composizione che nella miscela di ricottura e nell'estratto utilizzato per assemblaggio complesso (punto 2.1).
2. Raccogliere le perle nella parte inferiore del tubo di filatura per 2-3 min a 25 x g e aspirare il supernatante.
3. Ripetere la stessa procedura di lavaggio/spinning 2 - 3 volte per equilibrare le perline con il buffer di associazione.
   Nota: Al termine di questo passaggio, il pellet di perline dovrebbe avere un volume di ~ 30 µ l.
4. Caricare il supernatante contenente il complesso assemblato (punto 2.4) sopra le perline di agarosio streptavidina equilibrato.
5. Ruotare di 1 h a 4 ° C per immobilizzare RNA e i complessi associati le perline.
6. Raccogliere le perle nella parte inferiore del tubo di filatura per 2-3 min a 25 x g.
   Nota: Utilizzare un'oscillazione il rotore principale per evitare perdita sostanziale di perline se tendono ad aderire al lato del tubo in rotori angolari.
7. Aspirare il supernatante e sciacquare le perle due volte con 1 mL di buffer di associazione, utilizzando le stesse condizioni di centrifugazione.
8. Aggiungere 1 mL di buffer di associazione e ruotare il campione 1 h a 4 ° C.
   Nota: Questo passaggio può essere abbreviato se il complesso formato sul substrato tende a dissociarsi.
9. Rotazione verso il basso le perle per 2-3 min a 25 x g, aggiungere 1 mL di tampone e trasferire la sospensione ad un nuovo tubo.
10. Ruotare per un ulteriore 1 h o più breve, se il complesso non è stabile, rotazione verso il basso per 2-3 min a 25 x g e trasferire le perle in una provetta di 500 µ l a 200 µ l di tampone di associazione.

4. UV-eluizione.

1. Accendere una lampada UV che emettono luce UV di 365 nm per 5-10 minuti prima di raggiungere la piena brillantezza ad alta intensità.
   Nota: Questo è essenziale per ottenere la massima energia di emissione UV all'inizio di irradiazione.
2. Riempire il fondo di un piatto di Petri (100 x 15 mm) con ghiaccio strettamente imballata e capovolgerla coperchio del piatto.
3. Brevemente vortice nella provetta contenente il complesso immobilizzato, posizionarlo orizzontalmente sul ghiaccio e copertura con la lampada pre-riscaldata, assicurando che il campione si trova entro la distanza di 2-3 cm della superficie del bulbo.
   Nota: Se la distanza è troppo grande, utilizzare ulteriori piastre di Petri o altri oggetti adatti per portare il campione più vicino al bulbo.
4. Irradiare per un totale di 30 min, frequentemente invertendo e Vortex il tubo per garantire un'esposizione uniforme della sospensione ai raggi UV e per evitare il surriscaldamento.
   Nota: Per fornire raffreddamento addizionale, il passaggio di UV-eluizione può avvenire in una stanza fredda. Passare a una capsula di Petri con ghiaccio fresco in caso di fusione del ghiaccio eccessivo.
5. Rotazione verso il basso le perle per 2-3 min a 25 x g e raccogliere il surnatante.
6. Re-spin il supernatante utilizzando le stesse condizioni e raccogliere il surnatante.
   Nota: Lasciare una piccola quantità di surnatante nella parte inferiore per evitare di trasferire il residui perline.

5. esempio analisi dalla macchiatura d'argento seguita da spettrometria di massa.

1. Elettroforesi del gel di SDS/poliacrilammide di uso per separare una frazione del surnatante eluiti UV e la frazione stessa del materiale lasciato le perline seguendo eluizione UV.
   Nota: L'analisi può anche includere un'aliquota dei branelli ritirati dal campione prima UV-eluizione.
2. Macchia il gel contenente proteine separate utilizzando un argento disponibile in commercio kit di colorazione.
3. Valutare l'efficienza di UV-eluizione confrontando le intensità delle proteine presenti nel surnatante UV-eluiti e quelli lasciati sui branelli dopo irradiazione UV.
4. Asportare le fasce della proteina di interesse e determinare la loro identità tramite spettrometria di massa utilizzando protocolli standard^10,15.

6. globale analisi del campione eluito UV mediante spettrometria di massa.

1. Analizzare direttamente una frazione del surnatante UV-eluita mediante spettrometria di massa per determinare l'intero proteoma del materiale purificato in modo imparziale.
   Nota: Questo può essere fatto di solubilizzazione dei campioni purificati con tripsina seguita da protocolli standard spettrometria di massa per determinare l'identità del genera peptidi^10,15.

Risultati

Il metodo UV-eluizione è stato testato con due substrati di RNA sintetizzati chimicamente legate covalentemente all'estremità 5' ad il pcB (configurazionecis ): pcB-SL (Figura 1) e pcB-dH3/5m RNAs (Figura 2). Il 31-nucleotide pcB-SL RNA contiene una struttura di gambo-ciclo seguita da una coda di filamento singola 5-nucleotide e la sua sequenza è identica all'estremità 3' dell'istone maturo mRNA (cioè., dop...

Discussione

Il metodo qui descritto è semplice e oltre che incorporano un foto-spaccabili linker e il passaggio di UV-eluizione non differisce dai metodi comunemente usati che sfruttano estremamente forte interazione biotina streptavidina. Il passaggio di UV-eluizione è molto efficiente, rilasciando in genere oltre il 75% del RNA immobilizzato e proteine da streptavidina perline, lasciando dietro di sé un elevato background di proteine che legano non specificamente ai talloni associate. Eliminando questo sfondo, il passo di UV-el...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612