ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

要約

Botin ストレプトアビジン戦略を使用して精製した RNA ・ タンパク質複合体は、更なる精製および機能解析の不適切なフォームで変性条件下に溶出されます。ここでは、ネイティブと完全に機能 RNA ・ タンパク質複合体をもたらす RNA と穏やかな UV-溶出のステップの写真分解リンカーを利用してこの戦略の変更について述べる。

要約

長年、ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な急速に形成された相互作用を生物学的に重要な RNA ・ タンパク質複合体の部分的な浄化のため正常に利用されています。しかし、この戦略に苦しんでのより広範な利用を制限する 1 つの主要な欠点: ビオチン/ストレプトアビジン相互作用はまた排除したがって溶出の複合体の整合性を混乱させる条件の変化の下でだけ分けることができます、その後の機能的分析および/または他の方法でさらに精製。さらに、溶出サンプルは頻繁にストレプトアビジン ビーズ、銀染色及び質量分析法によって精製した複合体の解析を複雑に関連付ける特異的背景蛋白質と汚染されています。これらの制限を克服するために開発したビオチンは写真分解リンカーにより RNA 基板に接続されているし、ストレプトアビジン ビーズに固定化した複合体のソリューションに選択的に溶出されますビオチン/ストレプトアビジン戦略のバリアント、長波長紫外線、ビーズの背景蛋白質を残してネイティブ フォーム。一方、2 つのグループに相補的なオリゴヌクレオチドが長い RNA 基板を提供することができますは、短い RNA 結合基板をビオチンと、RNA の 5' 末端に接続した写真分解リンカー化学的に合成できます。UV 溶出法のこれらの 2 つのバリエーション 3' 端にヒストン Mrna を劈開 U7 snRNP に依存した処理の複合体の浄化のためテストされ、彼らは両方証明以前他に好意的に比較する精製方法を開発しました。UV 溶出サンプルには、主要な蛋白質の汚染物の無料され、質量分析法と機能アッセイによる直接分析に適した U7 snRNP の容易に検出可能な量が含まれています。この方法は、容易に他の RNA 結合の複合体の浄化のために適応し、DNA に固有の蛋白質と高分子複合体を浄化するために単一および二重鎖 DNA 結合部位と組み合わせて使用できます。

概要

真核生物の RNA ポリメラーゼ II によって生成された mRNA 前駆体 (Mrna) は細胞質でのタンパク質合成のための完全に機能の mRNA テンプレートになる前に核の成熟イベントがいくつかを受けます。これらのイベントの 1 つは、3' 端処理です。Mrna の大半には、3' 端処理には胸の谷間に起こる結合が含まれます。この 2 段階の反応は比較的豊富な複合体によって触媒以上 15 の蛋白質¹から成る。動物レプリケーション依存性ヒストン Mrna は 3' 末端で U7 snRNP、U7 に snRNA の ~ 60 のヌクレオチドと複数タンパク質^2,3から成る複雑な低豊富で、重要な役割を果たした別の機構によって処理されます。.ヒストン mRNA と U7 snRNP のサブユニットの 1 つの特定のシーケンスで U7 に snRNA 塩基対が開裂反応を触媒する、成熟したヒストンを生成せず、多 mRNA 尾します。ヒストン mRNA の 3' 端処理も必要と茎ループ結合タンパク質 (SLBP)、保存された茎ループの位置を結合する胸の谷間サイトの上流と基板^2,3U7 snRNP の募集を強化します。目的で U7 snRNP の個々 のコンポーネントを識別する研究は、動物細胞で U7 snRNP の低濃度として分離または使用した結果浄化中に部分的な分解を受ける複合体の傾向のために挑戦されています。中性洗剤^4,5,6、高い塩の洗浄および/または複数のクロマト グラフの手順^7,8,9。

最近、U7 に依存した処理機械の組成を決定するヒストン mRNA が 3' または 5' でビオチンを含むの短い断片だった核エキスと培養および組み立ての複合体は、ストレプトアビジン コーティングで捕えられました。アガロース ビーズ^5,6,10。ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な相互作用のためストレプトアビジン ビーズに固定化した蛋白質は SDS の沸騰によって条件の変化の下で溶出され銀製の汚損及び質量分析法によって分析します。比較的粗サンプル、しばしば多数の背景蛋白質特異的行きの可能性のいくつかのコンポーネントをマスキング、ストレプトアビジン ビーズ混入が得られた一方、この単純なアプローチは、U7 snRNP のコンポーネントの数を識別加工機械と銀の検出を防止する染色ゲル^5,6,10。重要なは、このアプローチはまた追加のメソッドによって分離材料と同質性にさらに精製機能研究を排除しました。

ビオチン/ストレプトアビジン相互作用には、いずれかの相互作用を弱めるかで化学分解スペーサー アームを提供するために設計されているそれらのほとんどの事実上不可逆的な性質に対処するため時間の経過と共に変更の数を提案した、ビオチンを含む試薬^11,12。すべてのこれらの変更の欠点は、彼らが著しく整合性または浄化された蛋白質の活動を危険にさらす、溶出のステップ中にメソッドおよび/または多くの場合必要な非生理的条件の効率を減らすことだった。

ここでは、固有の問題を解決する別のアプローチについて述べる RNA を用いたビオチン/ストレプトアビジン戦略の 5 ' ビオチンが共有結合に接続された基板を経由で終了写真分解 1-(2-ニトロフェニル) はエチル基UV^13,14を長波長に敏感。我々 はショウジョウバエから制限 U7 依存処理機械の浄化のためのこのアプローチをテストし、哺乳類の核抽出¹⁵。ヒストン mRNA 含んでいるビオチンの短い潜伏と核エキスで写真分解のリンカー、組み立て加工団地のストレプトアビジン ビーズに固定化した、徹底的に洗って、やさしくネイティブ ソリューションをリリース~ 360 nm の紫外線ライトへの露出によってフォーム。UV 溶出方法は非常に効率的、迅速かつ簡単な U7 snRNP エキス¹⁵として 100 μ L から染色スライバーでそのコンポーネントを視覚化するための十分な量を収穫します。UV 溶出素材は背景蛋白質の無料直接質量分析、追加精製工程、酵素アッセイに最適です。同じメソッドは、比較的短い RNA 結合部位を必要とする他の RNA ・ タンパク質複合体の精製に採用されることがあります。ビオチンと写真分解リンカーも共有可能にシングル- と二本鎖 DNA の可能性のある様々 な DNA/タンパク質複合体の精製の UV 溶出法を拡張します。

ビオチンが共有結合を含む RNA 基板の化学合成に接続されているし、写真分解のリンカーで高価になり大幅に長い系列を非効率的な 〜 65 ヌクレオチドを超えないようにシーケンスのみ実用的ですが。この問題に対処するため、はるかに長い RNA バインディング ターゲットに適している方法を開発しました。このアプローチで任意の長さとヌクレオチドのシーケンスの RNA は生成された体外T7 または sp6 によってトランスクリプションによって、ビオチンおよび 5' 端 (トランスで写真分解のリンカーを含む短い相補的なオリゴヌクレオチドをアニールしました。構成)。結果二重個々 結合蛋白質または共有添付写真分解のビオチンを含む RNA の培地について同じプロトコルに従うストレプトアビジン ビーズの高分子複合体の浄化に使用後 (cis構成)。この変更には、UV 溶出の広範な範囲の RNA ・ タンパク質精製法の拡張のヌクレオチドの数百を含む体外生成成績と組み合わせて写真分解のビオチンを使用できます。

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プロトコル

1. 基板の準備

注: ~ 65 ヌクレオチドより短い RNA 基板は、ビオチン (B) と共有結合 RNA 5' 側 (cis構成) に接続 (一緒に写真分解ビオチンまたは pcB と呼ばれる) 写真分解 (pc) リンカーを化学的に合成できます。大幅に長く結合部位を含む RNA 培地生成された体外T7 (または SP6) 転写する必要があるし、その後 5' 端 (トランスで基板部分を有する短い補完アダプター オリゴヌクレオチドに焼なまし構成) (図 1)。

1. 用未満 65 ~ ヌクレオチドから成る結合部位 (材料表) の商業メーカー化学興味の RNA を総合する pcB と共有 (図 1 a 図 2 a) RNA 5' 側に接続します。必要な濃度を達成するため、小さい因数-80 ° c で保存する滅菌水に溶解します。
2. 結合部位大幅 〜 65 ヌクレオチド、フォーム以上の体外部分二重生成されます関心と 5' 端 (図 3 a) で基板部分を有するアダプターの相補的なオリゴヌクレオチドの RNA。
   1. 関心 〜 20 塩基任意で 3' 端に拡張の結合部位を持つ RNA を生成する線形プラスミッド DNA または適切な PCR テンプレートのいずれかで T7 転写を実行します。
   2. T7 で生成された RNA の 3' 拡張機能を補完するもの、5' 端 (図 3 a) で pcB を含むアダプター オリゴヌクレオチドを化学的に合成するのに商業メーカー (資材表) を使用します。
      注: 2 つの 18 原子スペーサーと 2-3 非相補的なヌクレオチド連結複合体とストレプトアビジン ビーズの間潜在的な立体障害を軽減するオリゴヌクレオチドの 5' 端に配置できます。オリゴヌクレオチドが均一に 2' O メチル グループ、二重の強度を高めると、様々 な核酸に対する抵抗を提供するために変更されることをお勧めします。
   3. PcB アダプター オリゴヌクレオチドに T7 で生成された RNA をアニールします。
      1. RNA のミックス 20 pmol と 1.5 mL のアダプター基板オリゴヌクレオチド (1:5 モル比) の 100 pmol 管結合バッファーを構成する次の 100 μ L 含む: 75 mM KCl、15 mM HEPES pH 7.9, 15% グリセロール、10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)。
         注: アニーリングの反作用で使用されるほとんどの (ないすべて) の mRNA 基板で二重を形成するのに十分なアダプター オリゴヌクレオチドの最小限の量を使用することが重要です。これ便利な事ができた³²P、アダプター オリゴヌクレオチドを使用しての増加額でラベル付けされた基板をアニールの 5' 端に RNA 基板のラベル化による様々 なバッファー条件との保存の監視、ストレプトアビジン ビーズ ビーズ結合バッファーをいくつかの洗浄後に放射性の信号。
      2. 5 分のための沸騰水でチューブを配置します。
      3. 部屋の温度に冷却するために水を許可します。

2. 複雑なアセンブリ

1. 最終濃度抽出物に存在する非特異的な金属依存性核酸をブロックする 10 mM 80 mM EDTA ph 8 マウス核エキス (または選択した別の抽出物) 1 mL を補足します。
   注: これは結合バッファーと同じ組成に抽出でバッファーを調整することになります (手順 1.2.3.1 参照)。EDTA はヒストン Mrna の体外処理には影響しませんが、タンパク質やマグネシウム依存的に組み立てる蛋白質の複合体の浄化で有害な場合があります。これらのケースでは EDTA の避けるべきであります。
2. Cis 諸国における pcB 基が付いた RNA 基板の 5-10 pmol を追加 (手順 1.1 参照) またはトランス(ステップ 1.2.3.3 参照) 10 mM EDTA を含む抽出液の 1 mL に。
   注: RNA の量は、一連の試用実験で慎重に評価する必要があります。多分逆効果、特定タンパク質の収量に影響がなくても RNA 結合蛋白質の無指定の背景を大幅増加制限の複合体の浄化のためあまりにも多くの RNA の基板を使用します。
3. 時々 サンプルを混合氷の上 5 分の抽出と RNA 基板を孵化させなさい。
   注: 両方、孵化の温度、時間を経験的に確立する必要があり、RNA ・ タンパク質複合体の特定の性質によって大きく異なることがあります。
4. 任意の潜在的な沈殿物を削除し、慎重にペレットを転送、上清を回避するを収集し 10,000 x g で 10 分間予冷遠心培養混合物をスピンします。

3. ストレプトアビジン ビーズの RNA ・ タンパク質複合体の固定化。

1. 1.5 mL チューブに商業サプライヤー (材料表) からストレプトアビジン アガロース ビーズ懸濁液の ~ 100 μ L を転送し、結合バッファー (75 mM KCl、15 mM HEPES pH 7.9, 15% グリセロール、10 mM EDTA) と音量を上げます。
   注意: このバッファーはアニーリングの混合物と、複雑なアセンブリ (ステップ 2.1) 使用される抽出物と同じ構図になりません。
2. 25 x g で 2-3 分間回して管の下部にビーズを収集し、上清を吸引します。
3. 2-3 回洗濯/回転と同じ手順を繰り返す結合バッファーでビーズを平衡に。
   メモ: この手順の最後に、ビーズのペレットが必要の巻 〜 30 μ L。
4. 釣合いストレプトアビジン アガロース ビーズの組み立ての複合体 (ステップ 2.4) を含む上清をロードします。
5. RNA とビーズに連結された複合体を固定する 4 ° C で 1 時間を回転させます。
6. 25 x g で 2-3 分間回して管の下部にビーズを収集します。
   注: 角ロータのチューブの側面に付着するのに傾向がある場合、ビーズの実質的な損失を避けるために空振りローターを使用します。
7. 上清を吸引し、同じ遠心分離条件を使用して、結合バッファーの 1 つの mL で 2 回ビーズをすすいでください。
8. 1 mL の結合バッファーを追加し、4 ° C で 1 h サンプルを回転させる
   注: 基板上に形成された複合体を分離する傾向がある場合は、この手順を省略できます。
9. 25 x g で 2-3 分のビーズ スピンダウン バッファーの 1 つの mL を追加し、懸濁液を新しいチューブに転送。
10. さらに 1 時間または複合体が安定していない場合、短い回転、25 x g で 2-3 分の間回しなさい、結合バッファーの 200 μ L で 500 μ L のチューブにビードを転送します。

4. UV 溶出します。

1. 高強度 UV ランプの輝きに達する前に 5-10 分の 365 nm の紫外線を発光オンします。
   注: これは照射の開始時の UV 発光の最大エネルギーを達成するために不可欠です。
2. 堅く詰められた氷を敷いたペトリ皿 (100 mm × 15 mm) の下を埋めるし、皿のふたをスタックします。
3. 簡単に渦管固定化の複合体を含む水平方向や上に置きます氷カバー サンプルが電球の表面の 2-3 cm の距離内にあることを確認、予め温めておいたランプ。
   注: 距離があまりにも大きい場合使用追加シャーレまたは他の適したオブジェクト電球に近いサンプルをもたらす。
4. 合計 30 分、頻繁に反転とボルテックスの照射管紫外線に懸濁液の均一照射を確保し、過熱を防止します。
   注: 追加の冷却を提供するには、UV 溶出のステップ実行できます冷蔵室で。過剰な氷の融解の場合新鮮な氷を敷いたペトリ皿に切り替えます。
5. 25 x g で 2-3 分のビーズ スピンダウンし、上清を収集します。
6. 再同じ条件を使用して上清をスピンし、上清を収集します。
   注: は、残ったビーズを転送しないようにする底で上清の少量を残してください。

5 銀染色によりサンプル分析は質量分析に続きます。

1. 使用 SDS/ポリアクリルアミド電気泳 UV 溶出上清の一部と左側に次の UV 溶出ビーズ材料の同じ割合を分離します。
   注: 分析の UV 溶出する前にサンプルから撤退のビーズの因数もあります。
2. 市販銀染色キットを使用して分離されたタンパク質を含むゲルを染色します。
3. UV 溶出上清および UV 照射ビーズで左で現在の蛋白質の強度を比較することによって UV 溶出効率を評価します。
4. 興味の蛋白質バンドを消費税し、標準プロトコル^10,15を用いる質量分析法によって彼らのアイデンティティを決定します。

6. UV 溶出サンプル質量分析法による解析。

1. 直接浄化された材料の全体のプロテオームを公平な方法で決定する質量分析法による UV 溶出上澄みの割合を分析します。
   注: この行うことができます精製試料の溶液処理による生成ペプチド^10,15のアイデンティティを決定する標準的な質量分析のプロトコルに続いてトリプシン。

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結果

UV 溶出メソッドが共有 pcB 構造 (cis構成) に 5' 端に接続されている化学的に合成された RNA 基板を二枚テストされた: pcB SL (図 1) と pcB-dH3/5 m Rna (図 2)。5 ヌクレオチド単一の孤立した尾に続いて茎ループ構造を含み、そのシーケンスは、成熟したヒストンの 3' 末端と同じ 31-ヌクレオチドの pcB SL RNA mRNA (すなわち?...

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ディスカッション

ここで説明する方法は簡単で、写真分解のリンカーを組み込むほか、UV 溶出のステップはビオチンとストレプトアビジンの非常に強い相互作用を活用する一般的に使用されるメソッドから違いはありません。UV 溶出のステップは非常に効率的で、通常固定化 RNA の 75% 以上をリリース、ストレプトアビジン ビーズ、ビーズに非特異に結合するタンパク質の高いバック グラウンドを残してから?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612