JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

Abstract

השומנים bilayers מספקים פלטפורמה ניסיוני ייחודי ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים, המאפשר הבחינה של הערוץ-הממברנה אינטראקציות תחת קרום שונים יצירות השומנים. ביניהם, bilayer ממשק ' droplet ' צברה פופולריות; עם זאת, גודל ממברנה גדולות מעכבת את ההקלטה של רעש רקע חשמל נמוכה. הקמנו בועה קשר bilayer (CBB) בשיטה המשלבת את היתרונות של מישורי ליפידית ושיטות תיקון-קלאמפ, כגון היכולת להשתנות הרכב השומנים, לתמרן את המכניקה bilayer, בהתאמה. באמצעות הגדרת לניסויים תיקון קונבנציונלי-קלאמפ, מבוסס CBB ניסויים ניתן בקלות לבצע. בקצרה, פתרון אלקטרוליט ב פיפטה מזכוכית הוא התפוצץ לתוך שלב בממיסים אורגניים (hexadecane), הלחץ פיפטה נשמר להשיג מידה קצף יציב. הבועה רצוף באופן ספונטני שומנים חד שכבתי (ליפידים טהור או שומנים מעורבים), אשר מסופק מן ליפוזומים הבועות. בשלב הבא, שני מצופה טפט בועות (~ 50 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטות זכוכית מעוגנות bilayer בשורה. הקדמה של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך הבועה מוביל שילוב של ערוצים bilayer, המאפשר הקלטה הנוכחי ערוץ אחד עם יחס אות לרעש לזו של תיקון-קלאמפ הקלטות. CBBs להרכב השומנים אסימטרי נוצרות בקלות. CBB מתחדש שוב ושוב על ידי לפוצץ את הבועות הקודם ויוצרים חדשים. לפליטת כימיים שונים (למשל, ממברנה זלוף, bilayer המתח) ניתן לגזור על CBBs. שעל זה, אנו מציגים את ההליך הבסיסי לשימוש CBB היווצרות.

Introduction

עבור יון ערוצי, קרום התא הוא לא פשוט חומר התומך אלא שותף ליצירת יון שטף. מבחינה תפקודית, הקרום מבודד חשמלי ביון אשר מוטבעים ערוצים, כל קרום התא מוקנות עם קרום מנוחתו פוטנציאליים. כמקובל, ממברנה שרירותי פוטנציאל שהוטל מ מעגל חיצוני שבו נמדדה זרם חשמלי דרך הערוצים. זו הערכה כמותית של שטף יון-פוטנציאל ממברנה שונים חשף המאפיינים המולקולריים של ערוצי אלה, כגון יון סלקטיבי הסתננות שלהם פונקציות חסימה1,2. פלטפורמת ממברנה ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים היא קרום התא או קרום bilayer השומנים. מבחינה היסטורית, הקלטות הנוכחי חשמל ערוץ אחד בוצעו לראשונה השומנים bilayers3,4, טכניקות הרלוונטיים פותחו עבור קרום התא, כגון שיטת תיקון-קלאמפ (איור 1א' )5,6. מאז, אלה שתי טכניקות התפתחו בנפרד עבור מטרות שונות (איור 1)7,8.

ממברנה ליפידים וממברנות bilayer נכון להיום המוקד של מחקר על השתתפותם ב התומך את המבנה והתפקוד של ערוץ חלבונים. לכן, הזמינות מוכן של שיטות כדי להשתנות הרכב השומנים ב bilayers הוא ביקוש גבוה. השומנים bilayer היווצרות שיטות כגון השומנים מישורי bilayer (PLB)8,9,10,11, מים בתוך שמן droplet bilayer12וכן droplet ממשק bilayer (דיב)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , טכניקות 19 (איור 1) הן אפשרויות נפוצות, מתן הזדמנות לבחינת הפונקציה הערוץ תחת משתנה השומנים יצירות20. אני אמנם טכנית הרבה יותר קל לייצר יותר PLB קונבנציונאלי, גודלו של המילה יצרה תמריץ שלילי עבור תיקון-clampers ליישם אותו ללמוד הקלטות הנוכחי ערוץ אחד עם מוליכות בגודל הרגיל (< 100 pS).

כדי לעקוף את רעשי הרקע, יש למזער את האזור bilayer. בעיה זו מזכיר את מספר החזרות של ההיסטוריה בפיתוח שיטות אלקטרופיזיולוגיות עבור השומנים bilayers (איור 1). בימים הראשונים, הוקמה bilayer בגודל קטן (1-30 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטה (טיפ-מח ש שיטת; איור 1 C) 21 , 22 , 23, במקום שימוש bilayer שעמד חופשי (~ 100 מיקרומטר בקוטר) מחצה הידרופובי בתוך תא (איור 1B). שיטת טיפ-מח ש המותר עבור מדידות חשמל עם הרבה רעש נמוכה יותר רקע24. החוויות שלנו עם PLB25,26, עצה-מח ש22,23,27, תיקון-קלאמפ28,29,30, שיטות 31 הובילה אותנו רעיון חדש של יצירת bilayers השומנים על ידי שימוש בעקרונות bilayer המים בתוך שמן. לנו יש מכונה זה הבועה קשר bilayer (CBB) שיטת20,32. בשיטה זו, ולא מחזיק טיפות מים שלב שמן (איור 1D), בועת מים הוא מפוצץ מ פיפטה מזכוכית (עם עצה בקוטר של 30 מיקרומטר) לשלב שמן (איור 1E ו- 2), איפה בועה נשמר על-ידי החלת בלחץ קבוע. צורות טפט באופן ספונטני על הממשק מים-שמן על פני השטח של הבועה. לאחר מכן, שתי בועות מעוגנות באמצעות המניפולציה של שני פיפטות זכוכית, bilayer נוצרת גם monolayers שני מתקרבים אחד לשני, מניב שטח bilayer שיווי משקל. גודל הבועה נשלטת על ידי הלחץ אינטרה-הבועה (להחזיק לחץ), ואת גם גודל bilayer. קוטר ממוצע של 50 מיקרומטר משמש לעתים קרובות. למרות הנפח של הבועה הקטן (< 100 pL), זה קשור נפח גדול של הפתרון פיפטה זה בטווח microliter, המהוות שלב אלקטרוליט בצובר.

ישנם יתרונות רבים כדי להשתמש בשיטת CBB (טבלה 1). כמו טכניקה היווצרות ליפיד bilayer, ממברנות של קומפוזיציות שונות שומנים בדם יכול להיות מיוצר, ממברנות אסימטרי בקלות רבה יותר בנוי32 מאשר אלו על ידי שיטת מתקפלים33קונבנציונלי. Bilayer יכול להיות מכנית מניפולציות, בניגוד PLB קונבנציונלי יכול להיות כפוף רק עם34,הפרש הלחץ ההידרוסטטי35. על-ידי שינוי הלחץ החזקה, הבועות או להרחיב או לכווץ, שמוביל מתח הממברנה עלייה או ירידה32. Bilayer מכנית להסרה לתוך monolayers, הדומה ההקפאה-שבר טכניקה36,37 של ממברנות במחקרים מורפולוגי, אבל עם CBB, תרגיל המאפשר חזר על ניתוק וצירוף מחזורים32 . נפח קטן של הפתרון אלקטרוליט בתוך הבועה מאפשר מיזוג יעיל של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך bilayer, ההסתברות להשיג הקלטות הערוץ היא גבוהה הרבה יותר עם טכניקה PLB קונבנציונלי. אמצעי האחסון בועה קטנה גם מאפשר זלוף מהירה (בתוך ~ 20 ms) עוד פעם הזרקה פיפטה הוכנס גם הבועות. שלא כמו שיטת תיקון-קלאמפ, ברגע שבור, קרום CBB נוצר מחדש באופן מיידי, שוב ושוב, מדי סוכר יכול לשמש מספר פעמים ביום. על-ידי שילוב היתרונות של תיקון-קלאמפ והשיטות PLB, CBB מספק פלטפורמה תכליתי לגוון את התנאים physicochemical של הקרום, ומאפשר ללימודי חסרת תקדים של הערוץ-הממברנה אינטראקציות.

לפני הצגת פרוטוקול מפורט של תהליך היווצרות CBB, רקע physicochemical של היווצרות bilayer מוצג הראשון, אשר יהיה שימושי עבור תיקון-clampers לפתור קשיים ניסיוני הנוגע היווצרות קרום כי אתה נתקל.

ניסויים CBB להקנות את לקחי מדע הכימיה משטח38. CBB דומה בועת סבון התפוצץ מקשית לתוך האוויר, איפה באופן דומה, בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני. אחד לא ישים לב כי בועת מים בקושי מנופח ממברנה שומנים לא נכללת גם את בועת מים או הממס האורגני בהיעדרו של amphipathic שומנים, המתח-ממשק מים-שמן גבוה, הלחץ אינטרה-בועת עבור פיצוץ בועה יהיה גבוה. זהו מימוש משוואת לפלס (ΔP = 2 וγ/R, כאשר ΔP הוא הלחץ אינטרה-הבועה, γ הוא מתח הפנים ו- R הוא רדיוס בועה). כאשר ריכוז ליפידים השלב אורגני או הפתרון אלקטרוליט הוא גבוה, הצפיפות של ליפידים ב טפט עולה, כפי שמכתיבה את איזותרמה ספיחה גיבס (-dγ = Γאני dµאני, איפה Γאני עודף משטח של המתחם, ממוצעאני הוא הפוטנציאל הכימי של רכיב אני)39, המוביל מתח נמוך והקלות של היווצרות בועה. ב CBB, יכול להיות שנצפו על bilayer מזווית וצורניים (איור 2), זווית מגע בין חד שכבתי bilayer הוא מדיד. זווית זו מייצגת איזון בין את surface tensions של טפט bilayer (משוואת צעירים: γbi = γמו cos(θ), איפה γbi הוא המתח bilayer, γמו הוא המתח טפט ו θ באמצעות הוא הזווית קשר). שינויי הזווית קשר מצביעים על שינויים במתח bilayer, בהתחשב בכך המתח טפט יוערך משינויים ב זווית הקשר כפונקציה של קרום פוטנציאליים (משוואת יאנג-ליפמן: γמו = Cm V2 /4 (cos (θ באמצעות0) - cos (θ באמצעותv)), כאשר Cm הוא קיבול הממברנה, V הוא קרום פוטנציאליים ו θ באמצעות0 וθ באמצעותv הן הזוויות-0 ו- V mV, בהתאמה)40,41 ,42. כאשר שתי בועות קרוב מספיק, הם מתקרבים אחד לשני באופן ספונטני. זאת בשל הכוח Waals ואן דר, ניתן להבחין ויזואלית תהליך דינמי זה במבנה CBB.

מערכת CBB מורכב שלבים ברורים: כלומר, שלב שמן בתפזורת, מים בועות מצופה טפט ולאחר bilayer קשר איתם (איור 3). אלה מזכירים שלבי מרובים שנצפתה PLB, כמו הטורוס המכילות הממס מסביב השלב bilayer וגם שלב אורגניים דקים דחוקה על ידי שני monolayers43,44. ב CBB, לשלב טפט היא רציפה עם העלעל bilayer, מולקולות ליפיד בקלות לפזר בין את טפט העלעל. שלב חד שכבתי מכסה את רוב פני השטח בועה, המהוות את שלב עיקרי זה משמש מאגר השומנים. כי הזנב הידרופוביות של ליפידים של טפט מרחיב כלפי חוץ כדי לשלב שמן בתפזורת, הפנים bilayer או הליבה הידרופובי פותח לשלב שמן בכמות גדולה. לפיכך, חומר הידרופובי מוזרק לשלב שמן קרוב bilayer הוא מסוגל לגשת בקלות הפנים bilayer. זוהי הטכניקה זלוף ממברנה שפיתחנו לאחרונה45, לפיו הרכב השומנים ב- bilayer משתנה במהירות (תוך שנייה) במהלך הקלטות הנוכחי ערוץ אחד. מצאנו כי תכולת כולסטרול bilayer יכול להיות הפיכה נשלט על ידי מיתוג את זלוף כולסטרול45לסירוגין. בכל מקרה שבו הריכוז של החומר הרלוונטי טפט, bilayer שונה, מעבר הצבע ריכוז של חומר רלוונטי מפורקת באופן מיידי באמצעות דיפוזיה, הידוע בשם אפקט ס שלושה קמפוסים:46, 47. מצד שני, כפכפים מעבר monolayers הן איטיות48,49,50.

שימוש בשיטת CBB, bilayer נוצר בתנאים physicochemical מגוונים, כגון pH אלקטרוליט המתחילים 1 51, ריכוז מלח (K+, Na+, וכו '.) עד 3 מ', פוטנציאל הממברנה גבוהה כמו ±400 mV, ומערכת טמפרטורה של עד 60 מעלות צלזיוס.

ישנן מספר אפשרויות עבור היווצרות CBB ההתאגדות של מולקולות ערוץ בו. על היווצרות טפט על הממשק מים-שמן, שומנים מתווספות או הממס האורגני (שיטת השומנים-out; איור 4 א, ג 4) או בתוך בועה כמו ליפוזומים (שומנים בדם-אין שיטה; איור 4 B, 4 D). ראוי לציין, השיטה השומנים-in מאפשר היווצרות של ממברנות אסימטרי15,32. ערוץ מולקולות מסיסים בתמיסה המימית (למשל, פפטידים להיוות ערוץ) מתווספים ישירות לתוך52,בועה (איור 4A, B)53, ואילו ערוץ חלבונים הם מחדש לתוך ליפוזומים, אשר יתווספו לאחר מכן לתוך הבועה (איור 4C, D). במסמך זה, היווצרות של CBBs על ידי שיטת השומנים-in עבור גם ערוץ פפטיד (polytheonamide B (pTB); איור 4 A) או חלבון (ערוץ אשלגן KcsA, איור 4C) מוצג.

Protocol

1. מכינים ליפוזומים

  1. לפזר פוספוליפידים (למשל, 10 מ ג אבקת) ב כלורופורם-ריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"ג/מ"ל).
  2. להתנדף כלורופורם.
    1. המקום הפתרון פוספוליפיד הבקבוק העגול-התחתון, ערכת אותו על המאדה (ראה טבלה של חומרים) מחובר גליל גז2 N. סובב את הבקבוק תחת זרימה2 N בטמפרטורת החדר עד סרט דק פוספוליפיד מופיע (לאחר ~ 30 דקות).
    2. למקם את הבקבוק פתוח desiccator מחובר אליו משאבת ואקום. באמצעות המשאבה ואקום, תשאף הפנימי של desiccator במשך מספר שעות כדי להסיר את הכלורופורם ביסודיות.
  3. להוסיף אמצעי אחסון המתאים של פתרון אלקטרוליט הבקבוק, להשעות את פוספוליפיד להשיג 2 מ"ג/מ"ל פוספוליפיד ההשעיה.
  4. Sonicate התליה על כמה עשרות שניות בעזרת sonicator אמבט (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל השעיה מרובה שכבות שלפוחית (קמפנילה MLV).
  5. עבור הכנת proteoliposomes המכילים חלבונים ערוץ יון, להוסיף פתרון חלבון (עם החלבונים solubilized באמצעות חומרי ניקוי המתאים; 2% נפח היא מקסימלית) כדי ההשעיה קמפנילה MLV ו sonicate למשך מספר שניות באמצעות את sonicator אמבט.

2. מכינים פיפטות זכוכית גדול נשא

  1. הגדר זכוכית נימי פולר פיפטה, הרכיבו micropipettes עם טיפ מחודדות בסדר באמצעות משיכת שני שלבים.
  2. להגדיר את micropipette על microforge וליצור קשר עם קצה micropipette נימה פלטינה-החלק מחודדות בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר.
  3. מחממים את הסיב בקצרה (5 s) מיד לכבות אותו.
    הערה: זו מניפולציה טופסי הצבעה כדי לפצח החימום, לפיה קצה micropipette מנותקת, עוזב משעמם רחב בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר.

3. לטפל השטח של שקופיות זכוכית עם באר קעורה רדוד (Siliconization סיום דוחה מים)

  1. לנקות את השטח של השקופית זכוכית עם באר רדוד עם מים מזוקקים, אתנול.
  2. החל אמצעי אחסון המתאים (למשל, 100 µL) של ריאגנט siliconizing (דוחה מים) על גבי הזכוכית שקופית חור.
  3. יבש הכימית לגמרי באוויר.
  4. מניחים את השקופית זכוכית על השלב של מיקרוסקופ הפוכה.

4. יוצרים את CBB ולבצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות

  1. להוסיף 100 µL של hexadecane לתוך הבאר רדוד של חור siliconized שקופיות זכוכית.
    הערה: עבור שיטת השומנים-אאוט, פוספוליפידים מופצים ב- hexadecane (20 מ"ג/מ"ל) מראש.
  2. למלא את הפתרון אלקטרוליט חצי אורך micropipette, באמצעות מזרק טוברקולין.
  3. הגדר את micropipette על גבי המחזיק micropipette עם יציאת לחץ, ומאפשר האלקטרודה תיל Ag/AgCl לטבול לתוך הפתרון אלקטרוליט פיפטה.
  4. חבר אחד של בעלי micropipette לשלב ראש של מגבר תיקון-קלאמפ ואת השני אל הקרקע חשמל.
  5. חבר microinjector של הנמל לחץ של בעל micropipette.
  6. הגדר את micropipette עמדה ראויה מעל הבמה של מיקרוסקופ הפוכה על-ידי מניפולציה של micromanipulator.
  7. כוונון ההיסט של אלקטרודה פוטנציאליים.
    1. מקום 1 µL של הפתרון אלקטרוליט אותו נהגו למלא את micropipette על פני השטח שטוחים סביב הבאר רדוד של הזכוכית שקופית חור, יצירה של כיפת אלקטרוליט.
    2. לטבול את הקצה בשני micropipettes הכיפה אלקטרוליט על-ידי מניפולציה של micromanipulator.
    3. להתאים את הפוטנציאל היסט אלקטרודה של המגבר תיקון-קלאמפ.
    4. לאשר את ההיסט הנכון בסוף ניסויים על ידי שבירת CBB את דרך יישום של פוטנציאל גבוה קרום (פירוט חשמל; באמצעות זאפ על המגבר), גורם שתי בועות נכרכים לתוך אחד (בועה fusion).
    5. תקן את נוזלי צומת פוטנציאלי54 במקרים שבהם משמשים פתרונות אלקטרוליט אסימטרי, כך הערך המחושב מתווסף קרום יישומית פוטנציאל קרום נכון פוטנציאליים.
      הערה: צומת נוזלי פוטנציאליים מחושבת באמצעות התוכנית JPCalc55.
  8. לצייר את הפתרון ליפוזום מהקצה.
    הערה: ערוצי מסיסים במים נבדקים באמצעות השיטה השומנים-אאוט, suctioning של הפתרון ליפוזום אינו הכרחי.
    1. במקום µL 1 של ליפוזום פתרון על משטח שטוח סביב הבאר רדוד של הזכוכית שקופית חור (המכילות ליפוזום dome).
    2. לתפעל את micromanipulator והכנס את קצה micropipette לתוך הכיפה המכילות ליפוזום.
    3. האחות הפתרון המכילות ליפוזום על ידי הורדת הלחץ בתוך המחזיק micropipette באמצעות microinjector.
    4. חזור על התהליך עבור פיפטה אחרים.
  9. לתפעל את micromanipulator, טבלו את קצה micropipette hexadecane הבאר רדוד.
  10. לפוצץ בועה מים באיטיות על ידי הגדלת הלחץ עד הבועה מגיע לגודל הרצוי (לדוגמה, 50 מיקרומטר בקוטר), לשמור על הלחץ אותו לאחר מכן.
  11. למחוק את הבועות על-ידי העברת המידע באמצעות ממשק שמן-האוויר אם זה קשה לשמור על גודל הבועות יציב.
  12. חזור על שלבים 4.8 ל 4.9 עד נוצרות בועות יציבה.
  13. לטפל בועות כדי לאפשר קשר ביניהם (איור 5).
    הערה: לפעמים הבועות מתקרבים אחד לשני באופן ספונטני כדי ליצור את CBB. במקרים אחרים, הבועות קרובים אבל אל תצור קשר עם אחד את השני. במקרה זה, לדחוף את הבועות אחד את השני באופן מכני.
  14. לכוונן את הלחץ כדי לשמור על גודל הבועה, בגלל הגודל רשאית לשנות בהדרגה אפילו בכל הלחץ קבוע אינטרה-הבועה.
  15. הגדר את הקרום פוטנציאל לערך המתאים באמצעות המגבר תיקון-קלאמפ ולחכות הערוץ הנוכחי כדי להגיח (איור 6).

5. למדוד Bilayer קיבוליות

  1. למדוד את הקיבולת החשמלית bilayer (Cel) על-ידי החלת רמפה פוטנציאליים.
    הערה: כאשר שיעור השינוי מתח בפקודה הרמפה mV 10/10 ms (או 1 V/s) ואחריו-10 mV/10 ms, משרעת של הקפיצה הנוכחי על שינויים המדרון מקביל הקריאה של הערך membrane'scapacitance (למשל הרשות הפלסטינית 100 ← 100 pF).
  2. להעריך את האזור bilayer של שתי בועות בערימה אחד על השני, להתמקד המיקרוסקופ ברמת bilayer כדי להציג את קצה bilayer (איור 6).
    הערה: הצורה bilayer בעיקר מעגלית, האזור מחושב לפי הרדיוס.
  3. לחשב את קיבול הממברנה ספציפי (Csp) על-ידי חלוקת את הקיבולת החשמלית על-ידי האזור bilayer (Csp = Cel/A).
  4. לחשב את עובי bilayer (עובי של גרעין הידרופובי) באמצעות Dc = (חדוהrחדוה0) /Csp (איפה חדוהr וחדוה0 מייצגים המקדם הדיאלקטרי של אזור הידרופובי bilayer המקדם הדיאלקטרי של ואקום, בהתאמה).

תוצאות

CBB טיפוסי היה בקוטר של 50 מיקרומטר (איור 56) והיה קיבול הממברנה ספציפי ב hexadecane µF 0.65/cm2. גודל הבועה נשלטה באופן שרירותי על ידי לחץ אינטרה-הבועה. כאשר בועות קטנות נחוצים להקלטות רעש נמוכה, הקוטר טיפ צריך להיות correspondingly קטן. לדוגמה, עבור גודל בועה ש?...

Discussion

השיטה CBB של היווצרות ליפיד bilayer מבוסס על העיקרון של טיפונת מים בתוך שמן על ידי חד שכבתי20. טכנית, נהלי ויוצרים CBBs קלים, במיוחד עבור תיקון-קלאמפ חוקרים, שאינם בקיאים לתמרן את micropipettes זכוכית. הגדרת אלקטרופיזיולוגיות עבור המלחציים תיקון משמש ברצון CBB כאשר שני סימולטורי פיפטה עם microinj...

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות מריקו Yamatake, מסקו הטקשימה לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על-ידי KAKENHI גרנט מספרים 16H 00759 ו-17 H 04017 (וכו).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)Sigma-AldrichP3644
A/D ConverterMolecular DivicesDigidata1550A
Ag/AgCl electrodeWarner Instruments64-1317
Bath SonicatorBransonM1800H-J
CameraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
Glass CapillaryHarvard Apparatus30-0062
HepesDojindo342-01375
Hole SlideglassMatsunami GlassS339929
Inverted MicroscopeOlympusIX73
Isolation TableHerzTDI-86LA(Y)2
Micro InjenctorNarishigeIM-11-2
Micro ManipulatorNarishigeEMM
MicroforgeNarishigeMF-830
Micropipette holder
n-HexadecaneNacalai07819-32
Patch-Clamp AmplifierHEKAEPC800
Pipette PullerSutter Instrument Co.P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		Avanti Polar Lipids850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )Avanti Polar Lipids840457
Potassium ChlorideNacalai28514-75
Rotary EvapolatorIwakiREN-1000
Succinic AcidNacalai32402-05
Vacuum PumpBuchiV-100

References

  1. Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (2009).
  8. Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S., Okada, Y. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. , 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a., Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -. G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. . Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , (2003).
  39. Butt, H. -. J., Kappl, M. . Surface and Interfacial Forces. , (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H., Miller, C. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. , 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. . Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143Droplet

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved