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要約

ここでは、連絡先バブル膜法を用いた脂質膜の形成のためのプロトコルを提案する.有機溶媒、油水界面単分子層を形成するという水のバブルが吹かれます。2 つのピペットは、層を形成する泡のドック操作されます。

要約

脂質二重膜脂質組成の様々 な膜の下でチャネル膜相互作用の検査を許可する、イオン チャネルの機能研究のユニークな実験的プラットフォームを提供します。中でも、液滴インターフェイス層の人気を得ていますただし、大型膜面サイズは、低電気ノイズの記録を妨げています。平面脂質二分子膜の利点を組み合わせた連絡先気泡膜 (CBB) 法と脂質組成を変化させると二分子膜の力学をそれぞれ操作する能力などのパッチ ・ クランプ方法を設けています。従来のパッチ ・ クランプの実験のセットアップを使用して、CBB 試験が容易に行えます。簡単に言えば、有機溶媒 (ヘキサデカン)、ガラス ピペットで電解質溶液が吹かれると、ピペット圧力が安定気泡サイズを取得維持されます。泡が泡でリポソームから提供される脂質膜 (純粋な脂質または混合脂質) 自発的に並んでいます。次に、2 つ単分子膜並んで泡 (~ 50 μ m 径) ガラス ピペットの先端には、二重膜形成のためドッキングされます。チャンネル再構成リポソームのバブルへの導入は、ホールセル記録に匹敵する単一チャネル信号対雑音比と現在の録音を可能にする、膜チャネルの設立に します。非対称の脂質組成の CBBs 容易に形成されています。CBB が以前泡を吹き、新しいものの形成によって繰り返し更新されます。CBBs。 ここに様々 な化学的および物理的な摂動 (例えば膜灌流と二分子膜緊張) を課すことができる、CBB の形成のための基本的な手順を提案します。

概要

イオン チャネルの細胞膜は単にサポート材料パートナー イオン流束を生成するためです。機能的には、膜はイオン チャンネルが埋め込まれて、電気絶縁体、すべての細胞膜が静止膜電位を別れて。従来、任意の膜電位は、チャネルを介して電圧電流の測定、外部回路から課されました。別の膜電位でのイオン流束のこの定量的評価では、これらのチャネルのイオン選択性透過などゲーティング機能1,2分子の特性を明らかにしました。イオン チャネルの機能解析のための膜プラットフォームは、細胞膜や脂質二分子膜です。歴史的に、シングル チャネル電気現在録音は脂質二重膜3,4で最初に実行された、関連技術をパッチ ・ クランプの方法 (図 1Aなどの細胞膜の開発しました。)5,6。以来、これらの 2 つの手法を個別にさまざまな目的 (図 1)7,8の進化しています。

膜脂質と二分子膜は、現在のチャネル蛋白質の機能と構造を支える役割研究の焦点です。したがって、膜脂質組成を変化させる方法の準備状況は、需要が高いです。平面脂質二分子膜 (PLB)8,9,10,11、油中水滴二層12、液滴インターフェイス層 (DIB)13,などの脂質二分子膜形成方法14,15,16,17,18,19テクニック (図 1) は、一般的な選択肢、20脂質組成の変動を受けるチャネル機能を調べることのための機会を提供することです。DIB は技術的に従来の PLB よりもはるかに簡単ですが、DIB の大きいサイズがシングル チャネル伝導性の通常サイズと現在のレコーディングを勉強のために適用するパッチ取り付けの阻害要因を作成 (< 100 pS)。

バック グラウンド ノイズを回避するために膜面積を最小化する必要があります。この問題は、脂質二重層 (図 1) の電気生理学的な技術の開発の歴史の繰り返しを思い出します。(先端ディップ法; ピペットの先端に形成された小型膜 (直径 1-30 μ m) 初期の頃の図 1C)21,22,商工会議所 (図 1B) の疎水性中隔のフリースタンディング膜 (直径 ~ 100 μ m) を使用してのではなく、 23日。多くの低いバック グラウンド ノイズ24電気計測のヒント ディップ法。PLB25,26, 先端ディップ22,23,27, パッチク ランプ-28,29,30,と私たちの経験31の方法は、水に油の膜の原理を使用して脂質二重層を形成、斬新なアイデアに私たちを導いた。連絡先バブル膜 (CBB) メソッド20,32としてこれを紹介しています。このメソッドで水滴を油相 (図 1D) にぶら下がっているのではなく水のバブルからの吹きガラス ピペット (先端を直径約 30 μ m) と(図 1と 2)、油相にどこ、バブルは、安定した圧力を適用することによって管理されます。バブルの表面で水-油界面における自発的に単分子膜形態。2 つのガラス ピペットの操作によって 2 つの気泡がドッキングしているし、2 つの単分子膜は平衡二分子膜領域を降伏、互いに近づくと、2 層が形成されます。バブルのサイズは、(保持圧力)、内バブル圧と同様に二層サイズによって制御されます。50 μ m の平均粒径がよく使用されます。泡のボリュームは小さい (< 100 pL)、バルク電解質相を構成する 1 マイクロリットルの範囲内にあるピペット ソリューションの大きいボリュームに接続されています。

CBB 法 (表 1) を使用する多くの利点があります。脂質二分子膜形成技術として様々 な組成の脂質膜を作り出すことができると従来の折りたたみ法33によるものよりも、非対称膜がより容易に形成された32 。2 層機械的に操作できます、静水圧差34,35曲げるだけことができる従来の PLB とは異なり。保持圧力を変更すると、泡で拡張または縮小、増加または減少させる膜張力32に 。2 層は、単分子膜、形態学的研究における膜の凍結破壊技術36,37のように機械的に取り外し可能が、CBB、策略により繰り返さデタッチし、アタッチ サイクル32.バブル内の電解液の少量は、二層にチャネル再構成リポソームの効率的な融合でき、チャネルの録音を得ることの確率は従来の PLB 手法でよりはるかに高い。小さな気泡容積も急速な灌流 (~ 20 ms) 内で一度別注入が可能ピペットが泡のいずれかを挿入します。パッチ ・ クランプのメソッドとは異なり、ただちに、壊れた、CBB 膜が再結成し、ピペットは、日に数回を使用できます。パッチ ・ クランプと PLB メソッドの利点を統合することにより、CBB はチャネル膜相互作用の前例のない研究を可能にする膜の物理化学的条件の変化する汎用性の高いプラットフォームを提供します。

CBB 形成過程の詳細なプロトコルを提示する前に膜形成の物理化学的背景膜形成に関する実験の難しさを解決するパッチ取り付けのために有用される最初にされます。それが発生しました。

CBB 実験は、界面化学科学38の教訓を伝えます。CBB のシャボン玉吹きストローから空気中に水のバブルが有機溶剤に吹かれて同様に、どこに似ています。膜脂質、水のバブルや有機溶剤のいずれかに含まれていない場合、水のバブルが膨張ほとんど 1 つに気づくでしょう。両親媒性脂質がない場合は、油水界面での表面張力が高いと泡を吹くためバブル内の圧力が高くなります。これはラプラス方程式の実現 (ΔP = 2 γ/R、どこ ΔP 内バブル圧力、γ は表面張力、R はバブルの半径)。有機相または電解質溶液での脂質の濃度が高い場合、単分子膜の脂質の密度増加、ギブスの吸着等温線によって決定される (-dγ = Γ私dµ私、表面の過剰は私Γ化合物は、μ は私がコンポーネントの化学ポテンシャル私)39、低い表面張力とバブル形成の容易さに 。CBB の接線角度 (図 2) から 2 層を観測できるし、単分子膜と膜の間の接触角を測定可能です。この角度は、単分子膜の surface tensions と二分子膜間の平衡を表します (若い方程式: γbi = γmo cos(θ)、どこ γbiは二分子膜張力 γmo膜張力はある、θ は接触角)。接触角の変化は、単分子膜の張力は接触角の変化から膜電位の関数として評価されることを考える二分子膜緊張の変化を示す (若いリップマン式: γmo = Cm V2/4 (cos (θ0) - cos (θv))、ところ Cm膜容量、V は膜電位を、θ0と θvは、それぞれ 0 と V mV で接触角)40,41 ,42。2 つの泡が十分に近い、彼らは自発的に互いに接近します。これは van der Waals 力によるものと我々 は視覚的に CBB 形成における動的な過程を観察できます。

CBB システムは個別のフェーズで構成されています: バルク石油相、すなわち、水の泡、単層および接触層 (図 3) でコーティングします。これらは、膜相周辺 2 単分子膜43,44に挟まれた薄い有機相溶媒を含むトーラスなど、PLB において複数のフェーズを連想させる。CBB の単分子膜の相は、二層のリーフレットと連続と脂質分子単層とリーフレットの間拡散します。単分子膜の相は、脂質の貯蔵所として機能する主要なフェーズを構成する気泡表面のほとんどをカバーします。単分子膜の脂質の疎水性尾はバルク油相を外側に延長ので、二層内部または疎水性コアはバルク油相に開きます。したがって、2 層に近い油相に注入される疎水性の物質は膜内部に容易にアクセスすることができます。これは我々 が開発した最近45、急速に (秒) 以内、膜脂質組成を変更シングル チャネル現在録音中膜灌流法です。2 層でコレステロール含有量が45の内外でのコレステロール血流を切り替えることにより可逆的に制御できることがわかった。関連する物質の濃度勾配の解消がマランゴニ効果46,として知られている拡散をすぐに単層および二層に関連する物質の濃度が異なる場合に、47。 その一方で、単一層にフリップフ ロップが遅い48,49,50。

CBB メソッドを使用すると、2 層が、電解質の pH 低 1 としてなど、多彩な物理化学的条件の下で形成されるシステム注 mV として高い膜電位、最大 3 M (K+、ナ+)塩濃度5160 ° C までの温度

そこに、CBB の形成のためのいくつかのオプションとチャネル分子の結合があります。油水界面単分子膜の形成に有機溶剤 (脂質アウト メソッドで脂質が追加されます。図 4A、4 C)やリポソーム (脂質の方法; としてバブル図 4B、4 D)特に、脂質のメソッドは非対称膜15,32の形成のためことができます。チャネル蛋白質に再構成されたに対しチャネル分子 (例えば、チャネル形成ペプチド) 水溶液に可溶、バブル (図 4A, B)52,53, に直接追加されます。リポソームは、バブル (図 4C, D) に追加されます。ここで、チャネル ペプチド (巨大 B (pTB); 脂質で法による CBBs の形成図 4A) または蛋白質 (KcsA カリウム チャネル、図 4C) が表示されます。

プロトコル

1. リポソーム

  1. (例えば、10 mg/mL) 望ましい集中にクロロホルムでリン脂質 (例えば粉末で 10 mg) を分散させます。
  2. クロロホルムを蒸発させます。
    1. 場所丸底フラスコ、ロータリーエバポレーターでそれは N2ガス シリンダーに接続 (材料の表を参照してください) のセットでリン脂質液。(30 分程度) 後表示される薄いリン脂質膜まで室温で N2の流れの下でフラスコを回転します。
    2. オープンのフラスコを真空ポンプに接続されているデシケータに配置します。真空ポンプを使用して、徹底的にクロロホルムを削除するいくつかの時間デシケータの中を吸引します。
  3. フラスコに電解液の適切なボリュームを追加し、リン脂質懸濁液 2 mg/mL を取得するリン脂質を中断します。
  4. 数十秒お風呂超音波発生装置を使用してのための懸濁液の超音波 (材料表を参照) を多層小胞 (MLV) 懸濁液を得る。
  5. イオン チャネル蛋白質を含むプロテオリポソーム調製された、タンパク質溶液を追加 (; 適切な洗剤を使用して可溶化蛋白質 2% のボリュームは最大) MLV 懸濁液お風呂超音波発生装置を使用していくつかの秒の超音波と。

2. 準備する大口径ガラス ピペット

  1. ピペットの引き手にガラスの毛細管を設定し、二段引きで罰金テーパ先端マイクロ ピペットを作製します。
  2. マイクロ ピペットを on、マイクロフォージ 30 ~ 50 μ m の直径を持つテーパ部にプラチナ フィラメント マイクロ ピペットの先端を連絡してください。
  3. 簡単にフィラメントを熱する (5 s) し、すぐにオフします。
    注: この操作では加熱でクラック ポイント、マイクロ ピペットの先端が断ち切られる、30 ~ 50 μ m の直径を持つ広い穴を残してというフォーム。

3. 浅い凹状井戸 (撥水加工仕上げのためケイ) スライド グラスの表面を治療します。

  1. 蒸留水やエタノールと浅い井戸でスライド ガラスの表面をきれいにします。
  2. ホール スライド ガラス上に反応試薬 (撥水加工) の適切なボリューム (例えば、100 μ L) を適用します。
  3. 完全に空気で試薬を乾燥させます。
  4. 倒立顕微鏡のステージ上のスライド ガラスを配置します。

4. CBB の形成し、電気生理学的測定を行う

  1. シリル ホール スライド ガラスの浅い井戸にヘキサデカンの 100 μ L を追加します。
    注: 脂質メソッドのリン脂質中に分散させたヘキサデカン (20 mg/mL) 事前。
  2. マイクロ ピペット、ツベルクリンの注射器を使用しての長さの半分に電解質溶液を埋めます。
  3. 電解質溶液をピペットに浸る銀/塩化銀線電極を許可する圧力ポートとマイクロ ピペット ホルダーにマイクロ ピペットを設定します。
  4. パッチ ・ クランプの増幅器と電気地面に他の 1 つのヘッド ステージ ピペット ホルダーのいずれかに接続します。
  5. マイクロをマイクロ ピペット ホルダーの圧力ポートに接続します。
  6. 倒立顕微鏡のステージ上の適切な位置にマイクロ ピペットを設定するには、マニピュレーターを操作します。
  7. 潜在的な電極のオフセットを調整します。
    1. 場所 1 μ 同じ電解質溶液を電解質ドームを作成する、ホール スライド ガラスの浅い井戸の周りの平らな面にマイクロ ピペットを埋めるために使用します。
    2. 電解質のドームにマニピュレーターを操作することによって両方のマイクロ ピペットの先端を浸します。
    3. パッチ ・ クランプ アンプの電位オフセットを調整します。
    4. CBB を壊すことによって実験の終わりの正しいオフセットを確認を介してアプリケーションの高い膜電位 (放電; アンプで Zap を使用して)、1 つ (バブル核融合) に融合される泡 2 つを引き起こしています。
    5. その計算値は対象の潜在的な真の膜の潜在的な応用膜非対称電解質溶液を使用、する場合の液絡部潜在的な54を修正します。
      注: 潜在的な液絡部は JPCalc55プログラムを使用して計算されます。
  8. リポソーム液を先端から描画します。
    注: 脂質アウト法を用いた水溶性チャンネルを調べると、リポソーム液の吸引必要はありません。
    1. リポソーム液 1 μ L をホール スライド ガラス (リポソーム含むドーム) の浅い井戸の周りの平らな面に配置します。
    2. マニピュレーターを操作し、リポソームを含むドームに、マイクロ ピペットの先端を挿入します。
    3. ガラスシリンジを使用してマイクロ ピペット ホルダー内の圧力を下げることによってリポソーム含有溶液を吸引します。
    4. 他のピペットの手順を繰り返します。
  9. マニピュレーターを操作、浅い井戸でヘキサデカンにピペットの先端を浸しなさい。
  10. バブル (例えば、直径 50 μ m)、目的のサイズに達するまで圧力を高めることによってゆっくりと水に泡を吹くし、その後同じ圧力を維持します。
  11. 泡を破棄するには、バブルのサイズを安定に保つは難しい場合、オイル空気インターフェイスを先端を通過します。
  12. 手順 4.8 から 4.9 を繰り返して安定した気泡を形成します。
  13. (図 5) での間の接触を許可するように、泡を操作します。
    注: 場合によっては、泡 CBB を形成するために自発的に互いに接近します。他のケースで泡がありますが、お互いに連絡しないでください。この場合、それぞれのプッシュ泡他機械的に。
  14. サイズが定数内バブル圧力でも徐々 に変わるために、バブルのサイズを維持するために圧力を微調整します。
  15. 潜在的な膜をパッチ ・ クランプのアンプを使用して適切な値に設定し、(図 6) を emerge する現在のチャネルを待ちます。

5. 二重層容量を測定します。

  1. 潜在的なランプを適用することで二分子膜キャパシタンス (Cエル) を測定します。
    注: ランプ コマンドで電圧変化率が-10 mV/10 ミリ秒後 10 mV/10 ms (または 1 V/s) と、斜面の変更時に現在のジャンプの振幅に対応 (例えばmembrane'scapacitance の値の読み取り、100 pA → 100 pF)。
  2. 評価 2 つの膜面積泡は他の 1 つの積み重ねし、二分子膜 (図 6) のエッジを表示する 2 層レベルで顕微鏡の焦点します。
    注: 二重膜形状は円形、主と地域、半径から計算されます。
  3. 二層エリアで電気容量で割って特定膜キャパシタンス (Csp) を計算 (Csp Cエル/A を =)。
  4. 膜厚 (疎水性コアの厚み) を計算 Dcを使用して (、εrと ε0を表す二重膜の疎水性領域の誘電率と比誘電率 (εrε0)/Cspを =真空のそれぞれ)。

結果

典型的な CBB いた (図 5, 6) 50 μ m の直径、ヘキサデカン特定膜容量 0.65 μ F/cm2であった。バブルの大きさは任意内気泡圧によって制御されます。小さな泡が低ノイズ録音に必要な先端の直径は少ないはずです。たとえば、直径 50 μ m の気泡径、先端径を 30 μ m にする必要があります。

ディスカッション

CBB 脂質二分子膜形成法は、単層20並んで油中水滴の原則に基づいています。技術的には、CBBs を形成するための手順が簡単、特にガラス マイクロ ピペットの操作に精通したパッチ ・ クランプの研究者。インジェクターを持つ 2 つのピペット マニピュレーターがありますパッチ クランプの電気生理学的のセットアップが容易に、CBB で使用されます。一方、CBB は従来の PLB ?...

開示事項

著者はある利益相反を開示します。

謝辞

著者は、テクニカル サポートに真理子山武と雅子高島を感謝したいです。この作品が支持された部分で科研費による補助金番号 16 H 00759 と 17 H 04017 (SO)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)Sigma-AldrichP3644
A/D ConverterMolecular DivicesDigidata1550A
Ag/AgCl electrodeWarner Instruments64-1317
Bath SonicatorBransonM1800H-J
CameraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
Glass CapillaryHarvard Apparatus30-0062
HepesDojindo342-01375
Hole SlideglassMatsunami GlassS339929
Inverted MicroscopeOlympusIX73
Isolation TableHerzTDI-86LA(Y)2
Micro InjenctorNarishigeIM-11-2
Micro ManipulatorNarishigeEMM
MicroforgeNarishigeMF-830
Micropipette holder
n-HexadecaneNacalai07819-32
Patch-Clamp AmplifierHEKAEPC800
Pipette PullerSutter Instrument Co.P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		Avanti Polar Lipids850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )Avanti Polar Lipids840457
Potassium ChlorideNacalai28514-75
Rotary EvapolatorIwakiREN-1000
Succinic AcidNacalai32402-05
Vacuum PumpBuchiV-100

参考文献

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