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요약

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

초록

지질 bilayers 수 있도록 다양 한 멤브레인에서 채널 막 상호 작용의 시험 지질 구성 하는 이온 채널의 기능 연구에 대 한 독특한 실험 플랫폼을 제공 합니다. 그 중 물방울 인터페이스 bilayer; 인기를 얻고 있다 그러나, 큰 막 크기 낮은 전기 잡음의 녹음 방해. 우리는 평면 지질 bilayer의 이점을 결합 하는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드 및 패치 클램프 방법, 지질 구성 변경 하 고 각각 bilayer 기계를 조작 하는 등 설립. 기존의 패치 클램프 실험에 대 한 설치 프로그램을 사용 하 여, CBB 기반 실험 수 쉽게 수행. 간단히, 유리 피 펫에서 전해질 솔루션 단계로 유기 용 매 (hexadecane), 날 려 및 피 펫 압력은 안정 되어 있는 거품 크기를 유지 하 고 있다. 거품은 거품에 리에서 제공 되는 지질 단층 (순수 지질 또는 혼합된 지질), 자발적으로 늘어서 있다. 다음, 두 개의 단층 늘어선 거품 (~ 50 µ m 직경에서) 유리 펫의 팁에서 bilayer 형성에 대 한 도킹 됩니다. 거품으로 채널 재구성 리의 소개 채널 신호 대 잡음 비율 단일 채널 현재 녹음 패치 클램프 기록의 비교를 허용 하는 bilayer의 이끌어 낸다. Cbb는 비대칭 지질 성분과 쉽게 형성 된다. CBB는 이전 거품 밖으로 하 고 새로운 것 들을 형성 하 여 반복적으로 갱신 됩니다. 다양 한 화학 및 물리적 섭 (예를 들어, 막 관류와 bilayer 긴장) Cbb 여기에 부과 될 수 있습니다, 그리고 선물이 CBB 형성에 대 한 기본 절차.

서문

이온 채널, 세포 막 하지만 되지 않습니다 단순히 지원 자료 파트너 이온 플럭스를 생성 하기 위한. 기능적으로, 막은 이온 채널 포함, 전기 절연체 이며 모든 세포 막 휴식 막 잠재력으로 헤어 하지 않습니다. 전통적으로, 임의의 막 잠재적인 채널을 통해 전기 전류를 측정 하는 외부 회로에서 부과 되었다. 다른 막 잠재력에 이온 플럭스의 양적 평가이 그들의 이온 선택 투과 등 제어 기능1,2채널, 분자 속성을 밝혔다. 이온 채널의 기능 연구에 대 한 막 플랫폼 세포 막 또는 지질 bilayer 막입니다. 역사적으로, 단일 채널 전기 현재 녹음 지질 bilayers3,4에 초연 했다 그리고 패치 클램프 방법 (그림 1A 와 같이 세포 막에 대 한 관련 기술 개발 ),56. 그 이후,이 두 가지 기술을 다른 목적 (그림 1)7,8별도로 진화 했습니다.

막 지질 bilayer 막 하 고 현재 채널 단백질의 기능과 구조를 지 원하는 그들의 역할에 대 한 연구의 초점입니다. 따라서, bilayers에 지질 구성을 변경 하는 방법의 준비 여부 수요가입니다. 평면 지질 bilayer (첨 두 부하)8,,910,11, 물에서 기름 방울 bilayer12, 드롭릿 인터페이스 bilayer (DIB)13, 등 지질 bilayer 형성 방법 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 기술 (그림 1) 일반적인 선택, 다양 한 지질 구성20에서 채널 기능을 조사 하기 위한 기회를 제공 하는. DIB는 기술적으로 훨씬 쉽게 기존의 첨 두 부하 보다 생산 하는 DIB의 대형 패치-clampers 단일 채널 현재 녹음 일반적인 크기의 전도도와 공부에 대 한 적용에 대 한 억제 만들었습니다 (< 100 pS).

배경 잡음을 회피, bilayer 영역을 최소화 해야 합니다. 이 문제는 electrophysiological 지질 bilayers (그림 1) 기술 개발 역사의 반복 회상 합니다. 초기에, 소형 bilayer (1-30 µ m 직경에서) 피 펫 (팁-딥 방법;의 끝에 형성 되었다 그림 1 C) 21 , 22 , 23, 보다는 (그림 1B) 챔버에 소수 성 심장에 독립형 bilayer (~ 100 µ m 직경에서)를 사용 하 여. 팁-딥 방법 훨씬 낮은 배경 잡음24전기 측정에 대 한 허용. 우리의 경험 첨 두 부하25,26, 팁-딥22,,2327, 및 패치 클램프28,,2930, 31 방법 이끌어 냈다 우리 물에서 기름 bilayer의 원리를 사용 하 여 형성 하는 지질 bilayers의 소설을 생각. 우리는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드20,32라고이. 이 방법에서는, 석유 단계 (그림 1D), 물방울 거 보다 물 거품은 날 려 (팁 약 30 µ m의 직경)와 유리 피 펫에서(그림 1와 2), 기름 단계로 어디에 거품은 지속적인 압력을 적용 하 여 유지 됩니다. 거품의 표면에 물-오일 인터페이스에 저절로 단층 양식. 다음, 두 거품 두 유리 펫의 조작을 통해 도킹 하 고 두 monolayers 접근, 서로 평형 bilayer 지역 양보는 bilayer 형성 됩니다. 거품의 크기는 내부 거품 압력 (압력을 들고), 그리고 마찬가지로 bilayer 크기에 의해 제어 됩니다. 50 µ m의 평균 직경은 자주 사용 됩니다. 거품의 볼륨은 작은 (< 100 pL), 대량 전해질 단계 구성 microliter 범위 내에 있는 피 펫 솔루션의 더 큰 볼륨에 연결 된다.

CBB 방법 (표 1)를 사용 하 여 많은 이득이 있다. 지질 bilayer 형성 기술, 다양 한 지질 성분의 세포 막 생성 될 수 있다, 그리고 비대칭 막 더 쉽게 형성된32 보다 그 기존의 접는 방법33. bilayer 조작할 수 있습니다 기계적으로, 액체 정역학 압력 차이34,35으로 구부러진 수 있습니다 기존의 첨 두 부하와는 달리. 지주 압력을 변경 하 여 거품을 확장 하거나 축소, 증가 또는 감소 막 긴장32로 이어지는. bilayer monolayers, 유사한 형태학 연구, 세포 막의 고정-골절 기법36,37 에 기계적으로 분리 하지만, CBB 책략 수 반복 분리 하 고 사이클32 연결에 대 한 . 거품 내 전해질 솔루션의 작은 볼륨 bilayer로 리 채널 재구성의 효율적인 융합 있으며 채널 녹음을 얻기의 확율은 기존의 첨 두 부하 기술 보다 훨씬 높다. 작은 거품 볼륨도 수 (~ 20 ms) 이내 빠른 관류 한번 다른 주입 피펫은 거품 중 하나에 삽입 됩니다. 패치 클램프 방법 달리 즉시 그리고 되풀이 하 여, CBB 막 다시 형성, 일단 하 고 펫 하루에 여러 번 사용할 수 있습니다. 패치 클램프 및 첨 두 부하 방법의 혜택을 통합 하 여는 CBB 제공 하는 막의 물리 화학적 조건을 변경 하는 다양 한 플랫폼 채널 막 상호 작용의 전례 없는 연구에 대 한.

CBB 형성 과정의 상세한 프로토콜을 제시 하기 전에 bilayer 형성의 물리 화학적 배경 막 형성에 관한 실험 어려움을 해결 하기 위해 패치-clampers에 대 한 도움이 될 것입니다 먼저 제시 그는 발생 했습니다.

CBB 실험 표면 화학 과학38의 교훈을 르 친다. CBB는 비누 거품 어디 마찬가지로, 물 거품은 날 려 유기 용 매에는 공중으로 빨 대에서 날 려와 비슷합니다. 한 때 막 지질 물 거품 또는 유기 용 매에 포함 되지 않습니다 물 거품 거의 비정상적 알아차릴 것 이다. Amphipathic 지질의 부재, 물-오일 인터페이스에 표면 장력, 높은 이며 거품 부 대 내 거품 압력 높을 것 이다. 이것은 라플라스 방정식의 실현 (ΔP = 2 γ/R, 어디 ΔP 내부 거품 압력 γ 표면 장력은 이며, R은 거품형 반지름). 유기 단계 또는 전해질 용액에 지질 농도가 높은 경우는 단층에 lipids의 밀도 증가, 깁스 흡착 등온선에 의해 규정 (-dγ = Γ나 dµ나, Γ나 가 표면 초과 화합물의, 그리고 μi 은 부품의 화학 잠재력 i)39, 낮은 표면 장력 및 거품 형성의 용이성. CBB는 bilayer 탄젠트 각도 (그림 2)에서 관찰 될 수 있다 고 단층 bilayer 사이의 접촉 각 측정은. 이 각도 단층의 surface tensions와 bilayer 사이 평형 나타냅니다 (젊은 방정식: γbi = γ모 cos(θ), 어디 γbi bilayer 긴장, γ모 단층 긴장 이며 θ 이다 접촉 각). 단층 긴장에 따른 접촉 각 잠재적인 막의 기능으로 평가 되는 접촉 각의 변화 bilayer 긴장에 있는 변화를 나타냅니다 (영 Lippmann 방정식: γ모 = Cm V2 /4 (cos (θ0)-cos (θv)), 어디 Cm 막 용량, V 막 잠재력, 이며 θ0 θv 는 각각 0과 V mV에서 연락처 각도)40,41 ,42. 두 거품은 충분히 가까이, 그들은 접근 서로 자발적으로. 이것은 반 데르 발스 힘 그리고 우리 시각 CBB 형성에서이 동적 과정을 관찰할 수 있다.

CBB 시스템 가지 고유 단계로 구성 됩니다: 즉, 대량 기름 단계는 단층 및 접촉 bilayer (그림 3)으로 거품을 물. 이들은 여러 단계 첨 두 부하, bilayer 단계와 두 개의 monolayers43,44여 끼여 얇은 유기 단계 용 매 포함 된 토 러 스 등에서 관찰의 연상. CBB에서 단층 단계 bilayer 전단지와 연속 이며 지질 분자 사이는 단층 및 전단지 쉽게 확산. 단층 단계 거품 표면, 지질 저수지 역할 주요 단계 구성의 대부분을 다루고 있습니다. 지질은 단층에서의 소수 성 꼬리 대량 기름 단계에 밖으로 확장, 때문에 bilayer 내부 또는 소수 핵심 대량 기름 단계로 열립니다. 따라서, 소수 성 물질은 bilayer 가까운 석유 단계에 주입 bilayer 인테리어에 쉽게 액세스할 수 있다. 이것은 우리가 개발 했다 최근45, 여는 bilayer의 지질 조성 변경 빠르게 (1 초) 이내 단일 채널 현재 녹음 중 막 관류 기술. 우리는 bilayer에 콜레스테롤 내용 역 켜고45콜레스테롤 관류를 전환 하 여 통제 될 수 발견. 관련 물질의 농도 기온 변화도 연수 효과46, 로 알려져 있는 유포를 통해 즉시 해산 단층 bilayer에 관련 된 물질의 농도 차이가, 그 47. 다른 한편으로는 monolayers에 걸쳐 플립플롭은 느린48,,4950.

CBB 메서드를 사용 하는 bilayer 1 낮은 전해질 pH 등 다양 한 물리 화학적 조건 형성은 51, 3 M까지 (+K, Na+)소금 농도, ±400 mV, 높은 막 잠재력 및 시스템 최대 60 ° c.의 온도

있다는 CBB의 형성에 대 한 몇 가지 옵션 및 채널 분자의 거기에. 물-오일 인터페이스에서 단층의 형성, 대 한 지질 (지질-아웃 방법; 유기 용 매에 추가 됩니다. 그림 4 A, 4 C) 또는 리 (지질에 방법;으로 거품 그림 4 B, 4 D)입니다. 특히, 지질에서 메서드는 비대칭 막15,32의 형성에 대 한 수 있습니다. 채널 단백질으로 재구성 되는 반면 채널 분자 (예를 들어, 채널을 형성 하는 펩 티 드) 수성 해결책에서 녹는 거품 (그림 4A, B)52,53에 직접 추가 리 거품 (그림 4C, D)에 추가 됩니다. 여기, 채널 펩타이드 (polytheonamide B (pTB); 지질 방법에 의해 Cbb의 형성 그림 4 A) 또는 단백질 (KcsA 칼륨 채널, 그림 4C) 표시 됩니다.

프로토콜

1. 리 준비

  1. 원하는 농도 (예를 들어, 10 mg/mL)에 클로 프롬에 인지질 (예를 들어, 가루에 10 mg)을 분산.
  2. 클로 프롬을 증발.
    1. 장소는 둥근 바닥 플라스 크 및 회전 하는 증발 기에는 N2 가스 실린더에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 설정에서 인지질 솔루션. 상 온에서 N2 흐름 아래 플라스 크를 돌려 얇은 인지질 영화 (~ 30 분) 후 나타납니다.
    2. 진공 펌프에 연결 된 desiccator에 열려있는 플라스 크를 놓습니다. 진공 펌프를 사용 하는 클로 프롬을 철저 하 게 제거 하는 몇 시간 동안 desiccator 내부 발음.
  3. 플라스 크에는 전해질 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 인지질 정지 2 mg/mL를 인지질을 일시 중단.
  4. 초 목욕 sonicator를 사용 하 여 여러 가지 수만 대 한 정지를 sonicate ( 재료의 표참조) 다층된 소포 (MLV) 정지를.
  5. 이온 채널 단백질을 포함 하는 proteoliposomes의 준비에 대 한 추가 단백질 해결책 (solubilized; 적절 한 세제를 사용 하 여 단백질 2% 볼륨은 최대) MLV 정지 하 고 목욕 sonicator를 사용 하 여 몇 초 동안 sonicate.

2. 큰 구멍 유리 펫 준비

  1. 피 펫 끌어당기는 사람에 유리 모 세관을 설정 하 고 micropipettes 당기 하는 2 단계를 통해 좋은 테이퍼 팁과 조작.
  2. microforge에는 micropipette를 설정 하 고 30 ~ 50 µ m의 직경을 가진 테이퍼 부분에 백 금 필 라 멘 트에 micropipette 팁 문의.
  3. 짧게는 필 라 멘 트가 열 (5 s) 즉시 그것을 해제.
    참고: 난방에 균열 지점, 약자는 micropipette의 끝은 잘라, 30 ~ 50 µ m의 직경을 가진 넓은 구멍을 떠나이 조작 형태.

3. 얕은 오목 잘 (물 마무리에 대 한 Siliconization) 유리 슬라이드의 표면 처리

  1. 증류수와 에탄올 얕은 잘 유리 슬라이드 표면 청소.
  2. 구멍 슬라이드 유리에 siliconizing 시 (물)의 (예를 들어, 100 µ L) 적절 한 볼륨을 적용 합니다.
  3. 건조 한 공기에 완전히 시.
  4. 유리 슬라이드는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다.

4. 형태는 CBB와 Electrophysiological 측정 수행

  1. 시 홀 슬라이드 글라스의 얕은 우물에 hexadecane의 100 µ L를 추가 합니다.
    참고: 지질-아웃 방법 인지질은 분산 hexadecane (20 mg/mL)에서 미리.
  2. Micropipette, 투베르쿨린 주사기를 사용 하 여의 절반 길이 전해질 용액을 채우십시오.
  3. Ag/AgCl 와이어 전극 피 펫 전해질 용액에 담가 허용 압력 포트와 micropipette 홀더에 micropipette를 설정 합니다.
  4. 패치 클램프 증폭기와 전기 지상에 다른 것의 머리 단계로 micropipette 소유자 중 하나를 연결 합니다.
  5. microinjector micropipette 소유자의 압력 포트에 연결 합니다.
  6. micromanipulator 조작 하 여는 micropipette는 거꾸로 한 현미경의 스테이지 위에 적절 한 위치를 설정 합니다.
  7. 잠재적인 전극 간격 조정.
    1. 전해질 돔 만드는 구멍 슬라이드 유리의 얕은 우물 주위 평평한 표면에 micropipette를 채우는 데 사용 되는 동일한 전해질 솔루션의 장소 1 µ L.
    2. micromanipulator 조작 하 여 전해질 돔에 모두 micropipettes의 끝을 담가.
    3. 패치 클램프 증폭기의 전극 오프셋된 전위를 조정 합니다.
    4. CBB는을 위반 하 여 실험의 끝에 올바른 오프셋을 확인 (거품 융해)을 하나로 융합 하 거품 두를 일으키는 응용 프로그램을 통해 높은 막 잠재력의 (전기 고장, 앰프에 전기 충격 기를 사용 하 여).
    5. 진정한 막 잠재력에 대 한 잠재적인 적용된 막을 계산 된 값이 추가 되도록 비대칭 전해질 솔루션 사용 하는 경우에 액체 접합 잠재적인54 를 수정 합니다.
      참고: 액체 접합 잠재적인 프로그램 JPCalc55를 사용 하 여 계산 됩니다.
  8. 팁에서 liposome 솔루션을 그립니다.
    참고: 때 수용 성 채널은 지질 아웃 방법을 사용 하 여, suctioning liposome 솔루션의 필요는 없습니다.
    1. Liposome 솔루션의 1 µ L 구멍 슬라이드 유리 (liposome 포함 된 돔)의 얕은 우물 주위 평평한 표면에 놓습니다.
    2. micromanipulator 조작 하 고 liposome 포함 된 돔에는 micropipette의 끝을 삽입 합니다.
    3. Micropipette 홀더는 microinjector를 사용 하 여 내부 압력을 낮추어 liposome 포함 된 솔루션을 발음.
    4. 다른 피 펫에 대 한 절차를 반복 합니다.
  9. micromanipulator 조작 하 고 얕은 우물에서 hexadecane에는 micropipette 끝을 찍어.
  10. 거품 (예를 들어, 50 µ m 직경에서) 원하는 크기에 도달할 때까지 압력을 증가 시켜 천천히 물 거품을 날 려 버릴 하 고 그 후 동일한 압력을 유지.
  11. 안정 되어 있는 거품의 크기를 유지 하기 어려운 경우 오일에 어 인터페이스를 통해 팁을 전달 하 여 거품을 삭제 합니다.
  12. 4.8 4.9 단계를 반복 하 여 안정적인 거품이 형성 된다.
  13. (그림 5) 사이 접촉을 허용 하는 거품을 조작 합니다.
    참고: 때때로, 거품은 CBB를 자발적으로 서로 접근 한다. 다른 경우에, 거품 가까이 있지만 서로 연락 하지 않습니다. 이 경우에, 밀어 거품 서로 기계적으로.
  14. 크기는 지속적인 내부 거품 압력 에서도 점차적으로 변경 될 수 있습니다 때문에 거품 크기를 유지 하기 위해 압력을 미세 조정할.
  15. 막 패치 클램프 증폭기를 사용 하 여 적절 한 값을 잠재적인 설정 하 고 (그림 6) 등장에 현재 채널에 대 한 기다립니다.

5. 측정 Bilayer 커패시턴스

  1. 잠재적인 램프를 적용 하 여 bilayer 전기 커패시턴스 (C엘)를 측정 합니다.
    참고: 때 램프 명령에서 전압 변화의 속도 10 mV/10 ms (1 V/s) 뒤에-10 mV/10 ms, 기울기의 변화에 따라 현재 점프의 진폭에 해당 membrane'scapacitance 값 (예: 읽기 100 pA → 100 pF).
  2. 두 bilayer 영역 평가 거품 다른 하나를 스택 및 초점 bilayer (그림 6)의 가장자리를 보려면 bilayer 수준에서 현미경.
    참고: bilayer 형태는 주로 원형, 그리고 지역 반지름에서 계산 됩니다.
  3. Bilayer 지역 전기 용량을 나누어 특정 막 커패시턴스 (Csp) 계산 (Csp = C엘/A).
  4. Bilayer 두께 (소수 성 코어의 두께)를 계산 Dc 를 사용 하 여 (여기서 εr 과 ε0 대표는 bilayer의 소수 성 영역의 유전율과 고 유전율 (εrε0) /Csp = 진공의 각각).

결과

전형적인 CBB (그림 56) 50 µ m의 직경 졌고 hexadecane에 특정 막 커패시턴스 0.65 μ F/c m2했다. 거품 크기는 임의로 내부 거품 압력에 의해 제어 됩니다. 작은 거품은 저 잡음 기록에 필요한 팁 직경 대응 하 게 작은 되어야 합니다. 예를 들어 직경에서 50 µ m의 거품 크기, 팁 직경 30 µ m 이어야 합니다.

토론

지질 bilayer 형성의 CBB 메서드 단층20줄지어 물에 기름 방울의 원리를 기반으로 합니다. 기술적으로, Cbb 형성에 대 한 절차는 쉽게, 특히 패치 클램프 연구자, 유리 micropipettes 조작에 능숙 합니다. Microinjectors와 함께 두 개의 피 펫 조작자 사용할 수 있을 때 패치 클램프에 대 한 electrophysiological 설치 쉽게는 CBB에 사용 됩니다. 다른 한편으로는 CBB 기존의 첨 두 부하의 후임은, 때문에 ...

공개

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

감사의 말

저자 마 리코 Yamatake와 마사코 다카시마 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 지원 부분에서 KAKENHI에 의해 부여 번호 16 H 00759 및 17 H 04017 (SO).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)Sigma-AldrichP3644
A/D ConverterMolecular DivicesDigidata1550A
Ag/AgCl electrodeWarner Instruments64-1317
Bath SonicatorBransonM1800H-J
CameraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
Glass CapillaryHarvard Apparatus30-0062
HepesDojindo342-01375
Hole SlideglassMatsunami GlassS339929
Inverted MicroscopeOlympusIX73
Isolation TableHerzTDI-86LA(Y)2
Micro InjenctorNarishigeIM-11-2
Micro ManipulatorNarishigeEMM
MicroforgeNarishigeMF-830
Micropipette holder
n-HexadecaneNacalai07819-32
Patch-Clamp AmplifierHEKAEPC800
Pipette PullerSutter Instrument Co.P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		Avanti Polar Lipids850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )Avanti Polar Lipids840457
Potassium ChlorideNacalai28514-75
Rotary EvapolatorIwakiREN-1000
Succinic AcidNacalai32402-05
Vacuum PumpBuchiV-100

참고문헌

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