JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השלבים, ' עלויות ' הציוד הנדרש לייצר e. coli-המבוסס על תמציות תא וליישם במבחנה תגובות סינתזת חלבון תוך 4 ימים או פחות. למנף את אופי גמיש הפלטפורמה עבור יישומים רחב, נדון תנאי ריאקציה, כי ניתן להתאים אופטימיזציה.

Abstract

במהלך 50 השנים האחרונות, סינתזה של חלבון נטול תאים (CFPS) התפתחה טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לרתום את קיבולת גנים ברמת השעתוק והתרגום של תאים בתוך מבחנה. על ידי obviating הצורך לשמר את הכדאיות של התא, על ידי ביטול המכשול הסלולר, CFPS כבר למעין המתעוררים יישומים ב- biomanufacturing של חלבונים מאתגרת באופן מסורתי, כמו גם יישומים שטנץ מהירה עבור הנדסה מטבולית, גנומיקה תפקודית. השיטות שלנו ליישום של e. coli-מבוסס פלטפורמת CFPS לאפשר למשתמשים חדשים רבים של יישומים אלה. כאן, אנו מתארים שיטות להכין תמצית באמצעות מדיה מועשר מבחנות במבוכה, שיטה ישימה של פירוק התא מבוסס sonication tunable. זו תמצית ואז ניתן ביטוי חלבון מסוגל לייצר µg 900/mL או יותר של חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר תיקיה (sfGFP) ברק 5 שעות מהגדרת הניסוי כדי ניתוח נתונים, בהתחשב בכך ריאגנט המתאים מניות שהוכנו מראש. העלות המשוערת הפעלה של קבלת ריאגנטים הוא 4,500 דולר אשר יתמוך אלפי תגובות בעלות של $0.021 לכל µg של חלבון המיוצר או $0.019 לכל µL של תגובה. בנוסף, השיטות ביטוי חלבון מראה את הקלות של ההתקנה התגובה ראיתי במערכות זמינים מסחרית עקב אופטימיזציה של ריאגנט תערובות מראש, בכל חלק של העלות. כדי לאפשר למשתמש למנף את אופי גמיש פלטפורמת CFPS עבור יישומים רחב, זיהינו במגוון היבטים של פלטפורמת שניתן מכוון או מותאם בהתאם המשאבים הזמינים לבין התוצאות של ביטוי חלבון הרצוי.

Introduction

סינתזת חלבון נטול תאים (CFPS) התפתחה טכנולוגיה נעול מספר הזדמנויות חדשות עבור ייצור החלבון, גנומיקה תפקודית, הנדסה מטבולית ועוד בתוך1,50 שנה שעברה2. לעומת תקן ויוו פלטפורמות ביטוי חלבון, CFPS מספק שלושה יתרונות מרכזיים: 1) הטבע ללא תא של הפלטפורמה מאפשרת הייצור של חלבונים זה יהיה פוטנציאל רעיל או זרות תא3,4 5, ,6; 2) איון של הדנ א, ההקדמה של תבנית ה-DNA קידוד של gene (s) עניין לנתב את כל האנרגיה מערכתית בתוך התגובה לייצור של protein(s) עניין; ו 3) מהות הפלטפורמה הפתוחה מאפשר למשתמש לשנות ולנטר את תנאי ריאקציה ו קומפוזיציה בזמן אמת7,8. זו גישה ישירה אל התגובה תומך את הגדלת של מערכות ביולוגיות עם תנאים חמצון-חיזור לייצור חלבונים הרומן, כוונון של תהליכים מטבוליים2,9, וא מורחב 10. ישיר גישה גם מאפשר למשתמש לשלב את התגובה CFPS עם פעילות מבחני במערכת יחיד-סיר עבור מהירה יותר-מבחן עיצוב לבנות מחזורי11. היכולת לבצע את התגובה CFPS נפח קטן טיפות או במכשירים המבוססים על נייר נוספת תומך במאמצי הגילוי תפוקה גבוהה, שטנץ מהירה12,13,14,15 ,16. בשל יתרונות אלה ואת אופי הכנס-הפעל של המערכת, CFPS באופן ייחודי איפשר מגוון רחב של יישומי ביוטכנולוגיה למשל, ייצור חלבונים שקשה לבטא solubly ויוו17, 18,19,20, הגילוי של המחלה21,22,23, על פי דרישה biomanufacturing18,24 ,25,26,27, ו חינוך28,29, אשר כולם להראות את הגמישות ואת השירות של פלטפורמת נטול תאים.

CFPS מערכות יכול להיווצר מתוך מגוון של lysates גסה של שני הקווים תא prokaryotic, האיקריוטים. דבר זה מאפשר אפשרויות מגוונות במערכת של בחירה, שלכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות בהתאם ליישום של עניין. CFPS מערכות גם שוני רב בין זמן הכנה, עלות, יעילות. הכי נפוץ מנוצל תא תמציות מופקות מן נבט חיטה, ארנב רטיקולוציט, חרקים תאים ותאים Escherichia coli , הלה. החסכוני ביותר לתאריך תוך כדי לייצר את התשואות הנפחי הגבוה ביותר של חלבון30 . בעוד מערכות אחרות CFPS יכול להיות יתרון עבור מכונות מולדת השינוי post-translational שלהם, המתעוררים יישומים המשתמשים של e. coli-מכונות מבוסס מסוגלים לגשר על הפער על ידי יצירת site-specifically phosphorylated, חלבונים glycosylated על פי דרישה31,32,33,34,35.

תגובות CFPS ניתן להפעיל גם אצווה, רציף-exchange תא-חינם (CECF) או תבניות (CFCF) ללא תאים זרימה רציפה. הפורמט אצווה הוא מערכת סגורה החיים התגובה שלו הוא מוגבל בשל שמפחית כמויות המגיבים ואת ההצטברות של תוצרי לוואי המעכבת של התגובה. CECF ושיטות CFCF להגדיל את אורך החיים של התגובה, ובכך לגרום התשואות חלבון נפח מוגבר לעומת התגובה אצווה. זו מושגת על-ידי מתן לוואי של סינתזת חלבונים להסיר מיכל התגובה בזמן המגיבים חדשים מסופקים לאורך כל הקורס של התגובה2. במקרה של CFCF, החלבון של עניין ניתן גם להסיר מן החדר התגובה, תוך כדי CECF, החלבון שרידי עניין בבית הבליעה התגובה המורכב של36,קרום חדיר למחצה37. שיטות אלה יקרים במיוחד להתגבר על עניים התשואות הנפחי של חלבונים-קשה-אקספרס של עניין38,39,40,41,42, 43. האתגרים ביישום הגישות CECF ו- CFCF הם 1) בעוד הם תוצאה של שימוש יעיל יותר של מכונות ביו אחראי תמלול ותרגום, הם דורשים כמויות גדולות יותר ובמיוחד של ריאגנטים המגבירה העלות הכוללת ו- 2) הם דורשים setups התגובה מורכבים יותר, ציוד מיוחד לעומת אצווה תבנית44. על מנת להבטיח נגישות עבור משתמשים חדשים, הפרוטוקולים המפורטים להלן המיקוד על הפורמט אצווה בעוצמות התגובה של µL 15 עם המלצות ספציפיות להגברת שעוצמת התגובה הסולם מיליליטר.

השיטות שהוצגו במסמך זה לאפשר שאינם מומחים עם מיומנויות מעבדה בסיסיות (כגון סטודנטים לתואר ראשון) ליישם את צמיחת תאים, לחלץ הכנה של אצווה תבנית התגובה ההתקנה עבור e. coli-CFPS מערכת מבוססת. גישה זו היא חסכונית לעומת ערכות זמינים מסחרית מבלי להתפשר על הקלות של התגובה מבוסס ערכת ההתקנה. יתר על כן, גישה זו מאפשרת יישומים במעבדה ובשדה. כאשר אתה מחליט ליישם CFPS, משתמשים חדשים כדאי ביסודיות להעריך את היעילות של חלבון קונבנציונאלי מערכות ביטוי להשקעה הפעלה, כפי CFPS לא יכול להיות מעולה בכל מקרה. CFPS בשיטות המתוארות כאן לאפשר למשתמש ליישם באופן ישיר מגוון רחב של יישומים, כולל גנומיקה תפקודית, בדיקות, ייצור חלבונים שאינן פתירות ויוו הביטוי, כמו גם שדה תפוקה גבוהה יישומים כולל ביולוגיים וערכות חינוכיות עבור ביולוגיה סינתטית. יישומים נוספים כגון הנדסה מטבולית, כוונון של תנאי ביטוי חלבון, גילוי מחלות ושימוש הסולם בשיטות CECF או CFCF עדיין אפשריים אך עשויים לדרוש ניסיון עם פלטפורמת CFPS עבור שינוי נוסף של התגובה תנאים. השיטות שלנו לשלב הגידול, צלוחיות, בושם במבוכה ומדיה מועשר עם יחסית מהירה ושיטות לשחזור של פירוק התא דרך sonication, ואחריו מלכודת התגובה CFPS מפושטת אשר מנצל premixes ממוטבת45. בעוד השיטות צמיחה סלולרי צריך להיות סטנדרטית במידה מסוימת בתוך שדה זה, שיטות פירוק תאים משתנים במידה רבה. בנוסף sonication, שיטות פירוק הנפוצות כוללות הניצול של מכבש צרפתי, עם מהמגן, חלמוני חרוז, או ליזוזים אחרים שיבוש ביוכימי ופיזית שיטות46,47,48, 49. באמצעות השיטות שלנו, כ 2 מ ל תמצית תא גולמי מתקבלים לכל 1 ליטר של תאים. כמות זו של תמצית התא יכול לתמוך ארבע מאות תגובות CFPS µL 15, כל לעשיית ~ 900 µg/mL של הכתב sfGFP חלבון מן התבנית פלסמיד pJL1-sfGFP. בשיטה זו עלויות $0.021/µg של sfGFP מיוצר (.019$ / µL של תגובה), ללא העלות של עבודה וציוד (משלימה איור 1). מתחיל מאפס, בשיטה זו ניתן ליישם כבר 4 ימים על ידי אדם אחד וחזור CFPS תגובות יכולה להסתיים תוך שעות (איור 1). בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול באמצעי אחסון עבור אצוות גדול יותר של ריאגנט הכנה לצרכים של המשתמש. חשוב, ניתן ליישם את הפרוטוקול המובאת כאן על ידי מעבדה שהוכשרו הלא-מומחים כגון סטודנטים לתואר ראשון, כפי שהוא רק דורש מיומנויות מעבדה בסיסית. ההליכים המתוארים להלן ווידאו המלווה את פותחו במיוחד כדי לשפר את הנגישות של פלטפורמת CFPS e. coli לשימוש רחב.

Protocol

1. התקשורת והכנה צמיחת תאים

  1. יום 1
    1. רצף של e. coli BL21*(DE3) תאים גליצרול במניה על גבי צלחת אגר LB ואת תקופת דגירה של פחות 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. הכנת 50 מ ל LB ומדיה אוטוקלב הפתרון על מחזור הנוזל למשך 30 דקות-121 מעלות צלזיוס. לאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. יום 2
    1. להכין 750 מ של מדיה x YTP 2 ו- 250 מ של תמיסת M D-גלוקוז 0.4 כפי שמתואר המידע משלימה.
    2. שופכים את המדיה x YTP 2 לתוך הבקבוק במבוכה בלוק של 2.5 L והפתרון D-גלוקוז לתוך בקבוק זכוכית בלוק 500 מ"ל. אוטוקלב שני פתרונות על מחזור הנוזל למשך 30 דקות-121 מעלות צלזיוס.
    3. ודא כי שני פתרונות סטרילי מאוחסנים 37 ° C אם צמיחת תאים המבוצעת ביום הבא, כדי להגדיל את שיעורי צמיחה על חיסון. אל תשלבו פתרונות עד חיסון.
      הערה: פתרונות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 d במקרה הצורך, למרות התקשורת x YTP 2 הוא מאד מועדים לזיהום.
    4. התחל תרבות לילה של BL21(DE3) מזריקים 50 מ של מדיה ליברות עם מושבה בודדת של BL21(DE3) באמצעות לולאה סטיריליים סטרילי טכניקה כדי למנוע זיהום.
    5. למקם את 50 מ של תרבות BL21*(DE3) ליברות 37 ° C 250 סל"ד רועד חממה ולגדול ללילה עבור h 15-18.
    6. להכין ולחטא את כל החומרים הנדרשים ימים 3 ו- 4, כולל: שני בקבוקים צנטריפוגה 1 ליטר, 4 x 50 מל קר חרוט צינורות (שוקלים וגושים שיא של שלוש), צינורות microfuge 1.5 mL רבים.
  3. יום 3
    1. הסר התרבות לילה 50 מ של BL21*(DE3) ב LB החממה חזק ולמדוד את ה OD600 על ספקטרופוטומטרים באמצעות 1:10 דילול עם מדיה ליברות. חישוב הנפח של צורך להוסיף 1 ליטר של מדיה עבור ההתחלה OD600 של 0.1 לילה תרבות (לדוגמה, אם יתר600 של 1:10 דילול נקרא כמו 0.4, לחסן 25 מ של ה OD מדולל600 = 4.0 תרבות לילה לתוך 1 ליטר 2 x YTP ז).
    2. הסר את המדיה x YTP 2 ומחוממת והפתרונות D-גלוקוז החממה 37 ° C יחד עם 50 מ של תרבות ליברות. בזהירות בטכניקה סטרילי, שופכים את הפתרון D-גלוקוז לתוך התקשורת x YTP 2 (הימנעות הצדדים + בקבוקי שתייה צידניות במבוכה).
      הערה: תוספת של D-גלוקוז משלים את המתכון 1 ליטר של 2 x YTPG.
    3. שמירה על טכניקה סטרילי, לחסן את 1 ליטר של פתרון 2 x YTPG עם הכמות המתאימה של התרבות 50 מ ל כדי להתחיל את תרבות 1 ליטר-OD 0.1600. מיד למקם את תרבות 1 ליטר חוסנו 37 ° C רועד חממה-200 סל ד.
    4. . קח את יתר הראשון600 קריאה לאחר השעה הראשונה של צמיחה (שלב ההשהיה טיפוסי לוקח 1 h). לא לדלל את התרבות. ממשיכים את המידות600 OD כ כל 20-30 דקות עד OD600 מגיע 0.6.
    5. כשמגיעים OD600 = 0.6, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' IPTG (הריכוז הסופי בתרבות 1 ליטר = 1 מ מ) לתרבות x YTPG 2.
      הערה: אינדוקציה אידיאלי OD600 היא 0.6; עם זאת, מגוון של 0.6-0.8 מקובל. אינדוקציה על ידי IPTG הוא ייצור אנדוגני של T7 RNA פולימראז (T7RNAP).
    6. לאחר אינדוקציה, למדוד יתר600 כ כל 20-30 דקות עד שהוא מגיע 3.0.
      הערה: לקרר לצנטריפוגה עד 4 ° C בתקופה זו. להכין מאגר S30 קר כמפורט המידע הנוסף. אם המאגר S30 מוכן מראש, ודא DTT לא יתווסף עד היום של שימוש.
    7. ברגע ה OD600 מגיעה 3.0 (איור 2 א), שופכים את התרבות לתוך בקבוק קר של צנטריפוגה 1 ליטר באמבט קרח-מים. להכין מלא מים 1 ליטר צנטריפוגה בקבוק של משקל שווה כדי לשמש איזון בצנטריפוגה.
      הערה: ספיגת ערכים משתנים בין כלי נגינה כלי נגינה. בעוד ה OD600 הקציר של BL21(DE3) הוא לא רגיש משתנה, מומלץ כי המשתמש להעריך ולמטב את המשתנה הזה כאמצעי לפתרון בעיות. מכשירים גדולים עלולים לגרום נמוכות יחסית קריאות OD600 לעומת מכשירים מבוססי cuvette קטנים יותר.
    8. Centrifuge את הבקבוקים 1 ליטר 10 דקות ב- 5,000 x g ו- 10 ° C עד הצניפה תאים.
    9. מוזגים תגובת שיקוע, השלך אותו על פי הנהלים פסולת ביולוגית של המוסד. במקום בגדר על קרח.
    10. בעזרת מרית סטרילי, לגרד בגדר תא מהבקבוק צנטריפוגה, להעביר אותו צינור חרוטי קר 50 מ.
    11. להוסיף 30 מ של מאגר S30 קר צינור חרוטי, resuspend בגדר תא על-ידי vortexing עם צרורות קצרים (20-30 s), תקופות מנוחה (1דקות.) על הקרח עד resuspended באופן מלא עם שום גושים.
    12. לאחר בגדר מלאה resuspended, להשתמש עוד צינור חרוטי 50 מ עם מים כמו איזון צנטריפוגה 10 דקות ב 5000-g ו- 10 ° C (טרום מקורר עד 4 ° C).
      הערה: בזאת 1סנט ממכוני 3 הנדרש כאשר קצירת התאים.
    13. שופכים את תגובת שיקוע והשלך אותו על פי הנהלים פסולת ביולוגית של המוסד. Resuspend בגדר 20-25 מ של מאגר S30 וקר צנטריפוגה 10 דקות ב 5000 x g ו- 10 ° C (טרום מקורר עד 4 ° C).
      הערה: בזאת את 2nd ממכוני 3.
    14. שוב, שופכים את תגובת שיקוע והשלך אותו על פי הנהלים פסולת ביולוגית של המוסד. להוסיף בדיוק 30 מ של מאגר S30, מערבולת שוב כדי resuspend בגדר.
    15. שימוש השפופרות חרוט 3 שנשקל מראש, קר 50 מ ל ו המילוי פיפטה סרולוגית עם פיפטה סטרילי, aliquot 10 מ"ל של גלולה resuspended/S30 מאגר תערובת לתוך כל הצינורות חרוט 3.
      הערה: פיצול התאים לתוך צינורות 3 אינו נדרש, אך שלב זה מתבטא כדורי תא קטן יותר (~ 1 g) לנוחות מוגברת על צעדים מאוחר יותר.
    16. Centrifuge לכל הצינורות, באמצעות איזונים המתאימים לפי הצורך, עבור 10 דקות ב 5000-g ו- 10 ° C (טרום מקורר עד 4 ° C).
      הערה: בזאת את הצעד הסופי לשטוף.
    17. שופכים את תגובת שיקוע והשלך אותו על פי הנהלים פסולת ביולוגית של המוסד. להסיר את המאגר S30 עודף על ידי בקפידה מנגב הפנימי של צינור חרוטי, כיפה עם טישו נקי; להימנע מלגעת בגדר.
    18. Reweigh הצינורות על איזון האנליטי ולהקליט את המשקל צניפה הסופי על כל שפופרת.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה. החבילות ניתן פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנה עד לצורך הכנת תמצית.

2. גולמי תא לחלץ הכנה - יום ד'

  1. להכנת תמצית, לשמור על תאים קר על קרח במהלך כל שלב. להוסיף 1 מ"ל קר S30 מאגר לכל 1g של התא המוני בגדר. ודא שכי dithiothreitol (DTT) יש כבר בתוספת למאגר S30 כדי ריכוז סופי של 2 מ מ.
    הערה: לקרר את microcentrifuge עד 4 ° C בתקופה זו.
  2. Resuspend בגדר תא על-ידי vortexing עם צרורות קצרים (20-30 s), תקופות מנוחה (1דקות.) על הקרח עד resuspended לגמרי. אם resuspension קשה, להשאיר את כדורי קרח למשך 30 דקות. להפשיר.
  3. העברה מ ל 1.4 של תאים resuspended לתוך צינור microfuge 1.5 mL.
  4. המקום המכיל 1.4 מ של תאים resuspended לתוך אמבט מים קרים בתוך שפופרת אחת של 1.5 mL. Sonicate עבור 45 s על ואחריו 59 s את מחזורי הכולל 3, עם משרעת להגדיר ב-50%. סגור, היפוך הצינורות לערבב בעדינות במהלך התקופות כבוי. בסך הכל, לספק 800-900 J של אנרגיה כל שפופרת microfuge 1.5 mL המכיל 1.4 מ של תאים resuspended (איור 3 א & 3B).
    הערה: השלב זה רגיש לסוג sonicator, מודל המשמש צריך להיות מותאם אם ציוד שונה מאשר המפורטים עבור הליך זה. שתי גישות משלימות יכול לשמש כדי הסולם הסכום של תמצית שהוכנו במהלך שלב זה: צינורות microfuge 1.5 מ"ל במספר 1) יכול להיות sonicated במקביל, ו/או אחסון 2) גדולים יותר יכולים להיות sonicated חרוט צינורות (עד 15 מ"ל של תא resuspension למחזור) , קנה מידה של כמות האנרגיה מועברת כאמור תיאר 29,45.
  5. מיד לאחר השלמת sonication, להוסיף µL 4.5 של 1 מ' DTT (שכשהם נוספים 2 מ"מ DTT) לתוך mL 1.4 של lysate, היפוך מספר פעמים כדי לערבב. מניחים את הצינורית על קרח. חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5 עבור כל צינורות נוספים של תאים resuspended לפני שימשיך צנטריפוגה.
  6. דוגמאות Microcentrifuge-18,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (איור 3C).
  7. Pipette את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 מ ל microfuge. נא לא להפריע בגדר; עדיף להשאיר כמה תגובת שיקוע מאחור כדי לשמור על טוהר יותר כדי לשבש את צניפה במאמצים כדי למקסם את התשואה.
  8. דגירה של תגובת שיקוע מהשלב הקודם ב 250 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות על ידי מקליטה הצינורות פלטפורמת חזק של החממה (זוהי התגובה נגר).
  9. דוגמאות Microcentrifuge ב 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  10. הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר, להעביר אותו צינור חדש. יוצרים רבים-100 µL aliquots של תמצית לאחסון.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, התמצית וניתן פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנה עד זקוק לתגובות CFPS. לפחות 5 מחזורים ההקפאה-הפשרה ניתן עברו בלי לרעת כדי לחלץ את הפרודוקטיביות (איור 4).

3. תא ללא חלבון סינתזה אצווה תבנית תגובות

  1. הפשרת פתרונות A ו- B, DNA תבנית, BL21(DE3) תמצית (אם קפוא), T7RNAP, aliquot של מים ברמה המולקולרית.
    הערה: ניתן למצוא CFPS התגובה תבנית מידע משלים. מתכונים פתרונות A ו- B הינם מסופקים מידע משלים , שיתאימו ריכוזים מסוים עבור ריאגנטים רבים לתמוך מערכת אנרגיה המבוסס על PANOx-SP עבור CFPS. התפקיד של כל ריאגנט מקובל וריאציה בריכוזים ריאגנט אלה שיכולים לתמוך CFPS היה נחוש50. פרוטוקול טיהור T7RNAP ניתן למצוא את המידע המשלים51. T7RNAP משלימה ניתן להגדיל את התשואות הנפחי אך אינה הכרחית אם T7RNAP הנגרמת במהלך גדילת התאים. תבנית ה-DNA פלסמיד (pJL1-sfGFP) ניתן להכין בעזרת ערכת maxiprep עם שני שוטף באמצעות המאגר שטיפת בערכה, ואחריו עיבוד דפוס DNA-ניקיון באמצעות ערכת טיהור PCR (איור 2B). תבניות DNA ליניארי יכול לשמש גם בתגובות CFPS.
  2. תווית הסכום הדרוש של צינורות microfuge זקוק לתגובות CFPS.
    הערה: ניתן לבצע תגובות בגדלים שונים של כלי, אך כלי קטן יכול להקטין נפחי חלבון התשואות (איור 2C). אולם תגובה באותו גודל הכלי שינוי קנה המידה עשויה להפחית גם את התשואות נפחי, כפונקציה של הפחתת ההחלפה חמצן, עקב ירידה ברמת פני השטח יחס נפח. בעת הגדלת נפח התגובה מעל 100 μL, מומלץ להשתמש בתחתית שטוח צלחות טוב 31,37,52.
  3. להוסיף µL 2.2 של פתרון A, µL 2.1 של פתרון ב', 5 µL של BL21*(DE3) לחלץ, 0.24 μg של T7RNAP (16 μg/mL הסופי ריכוז), 0.24 ng של תבנית ה-DNA (16 ריכוז סופי ng/mL) ומים כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 15 µL.
    הערה: מערבולת פתרונות A ו- B לעתים קרובות במהלך התגובה ההתקנה כדי למנוע שיקוע של רכיבים ולהבטיח כי כל תגובה מקבל aliquot הומוגנית של כל פתרון. להימנע vortexing התמצית, במקום להפוך את הצינור כדי לערבב.
  4. לאחר כל ריאגנטים נוספו התגובה, מערבבים כל שפופרת על-ידי pipetting למעלה ולמטה או בעדינות vortexing תוך הקפדה כי התערובת הסופית התגובה משולבים חרוז 15 µL בודדת בתחתית השפופרת microfuge 1.5 mL.
  5. מקם כל התגובה לתוך החממה 37 ° C מבלי לרעוד במשך 4 שעות, או 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: תגובות מוצלח יכול להיות איכותית העריכו באופן חזותי המבוסס על הצבע הירוק של המוצר sfGFP בתוך התערובת תגובה CFPS (דמות תלת-ממד). באפשרותך גם לאשר ביטוי של החלבון עניין מרחביות-דף (משלימה איור 2).

4. כימות של החלבון כתב, [sfGFP]

  1. לטעון µL 48 של 0.05 M HEPES, pH 8, לתוך כל טוב לצורך כימות (בדרך כלל מבוצע שהפקידים למחזור התגובה).
  2. הסר את התגובות של חממה. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב כל תגובה ולאחר מכן להעביר µL 48 של 0.05 M HEPES, pH 8 2 µL של תגובה. Pipet למעלה ולמטה שוב בתוך הבאר לערבב.
  3. לאחר כל התגובות הם נטען, מעורב, למקם את הצלחת היטב 96 fluorometer, למדוד קרינה פלואורסצנטית את הקצה של sfGFP.
    הערה: אורכי גל עירור, פליטה על כימות זריחה sfGFP הם 485 nm ו- 510 ננומטר, בהתאמה.
  4. באמצעות עיקול רגיל שנוצרה קודם לכן, קבע את [sfGFP] מן המקראות פלורסצנטיות שהושג.
    הערה: הוראות ליצירת עיקול רגיל של ריכוז sfGFP מול עוצמת קרינה פלואורסצנטית ניתנים מידע משלים (משלים איור 3). משתמשים יצטרכו להקים עיקול רגיל לכלי שלהם מאז רגישות המכשיר עשוי להשתנות.

תוצאות

הוצגו מבוסס sonication e. coli תמצית פרוטוקול הכנה ניתן להשלים במשך תקופה ארבעה ימים, עם איור 1 הממחיש את התפלגות פרוצדורלי מעל כל יום. אין גמישות כדי השלבים ניתן להשלים כל יום עם נקודות משהה שונות, אבל מצאנו את זרימת עבודה זו כדי להיות היעיל ביותר לביצוע. בנוס...

Discussion

סינתזה של חלבון נטול תא התפתחה טכנולוגיה חזקה ומאפשרת למגוון רחב של יישומים החל biomanufacturing וכלה שטנץ מהירה של מערכות ביוכימיות. רוחב היריעה של יישומים נתמך על ידי היכולת לפקח, לתמרן, להגדיל מכונות הסלולר בזמן אמת. למרות ההשפעה המתרחב של טכנולוגיה זו פלטפורמה, נותרה רחבה הסתגלות איטית עקב הד?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחברים רוצה להכיר ד ר ג'ניפר VanderKelen, אנדריאה Laubscher, ואת טוני Turretto לתמיכה טכנית, ווסלי קאו, ליין ויליאמס ו כריסטופר Hight לדיונים מועיל. המחברים גם לאשר מימון תמיכה מן ביל ו לינדה פרוסט קרן, מרכז עבור יישומים של ביוטכנולוגיה שברון ביוטכנולוגיה חלה הקרן למחקר גרנט, קאל פולי מחקר, Scholarly ו תוכנית גרנט פעילות יצירתית (RSCA 2017), הקרן הלאומית למדע (NSF-1708919). MZL מאשר מענק בוגר את המדינה אוניברסיטת קליפורניה. MCJ מכיר את הצבא מחקר במשרד W911NF-16-1-0372, הלאומית למדע מעניקה MCB-1413563 ו MCB-1716766, את חיל האוויר מחקר מעבדה מרכז מצוינות גרנט FA8650-15-2-5518, המענק סוכנות ההגנה צמצום האיום HDTRA1-15-10052/P00001, דוד ואת ולוסיל פקארד קרן, לתוכנית המורה-מלומד קמיל דרייפוס, המחלקה של אנרגיה בער גרנט דה-SC0018249, תוכנית המדע האנושי הגבולות (RGP0015/2017), המענק ETOP המכון הגנום המאוחד DOE, ו שיקגו ביו. האיחוד עם תמיכה של הכספים סרל ב שיקגו הקהילה לסמוך על התמיכה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

References

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer's disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144CFPSTX TLCFME

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved