JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

초록

지난 50 년 동안 셀 무료 단백질 합성 (CFPS)는 시험관 내에서 셀의 transcriptional 변환 용량을 활용 하는 강력한 기술으로 떠오르고 있다. 고, 세포의 생존 능력을 유지 하는 필요를 만듦으로써 세포 장벽을 제거 함으로써, CFPS 되었습니다 전통적으로 도전 단백질의 biomanufacturing에 신흥 응용 프로그램 뿐만 아니라 응용 프로그램에 기초에 대 한 신속한 프로토 타입 대사 공학 및 기능 유전체학 대장균을 구현 하기 위한 우리의 방법-CFPS 플랫폼을 기반으로 새 사용자가 이러한 응용 프로그램의 대부분을 액세스할 수 허용. 여기, 우리는 풍부한 미디어, 당황 하 고 플라스 크와 가변 쥡니다 기반 세포 세포의 용 해의 재현 방법을 통해 추출 준비 하는 방법을 설명 합니다. 그 적절 한 시 약 주식 미리 준비 된이 추출 다음 단백질 발현 데이터 분석, 실험적인 체제에서 단지 5 h에서 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)의 900 µ g/mL 이상의 생산 능력에 대 한 사용할 수 있습니다. 시 약의 예상된 시작 비용 $4500 단백질 생산의 µ g 당 0.021 달러 또는 $0.019 반응의 µ L 당 예상 비용 반응의 수천을 유지할 것입니다. 또한, 단백질 식 방법 거울 최적화 시 사전 믹스, 비용의 일부분에서의 상용 시스템에서 본 반응 설치의 용이성. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한 CFPS 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 사용자 수 있도록, 다양 한 조정 하 고 사용할 수 있는 리소스와 단백질 식 결과 따라 최적화 될 수 있는 플랫폼의 측면 확인 했습니다. 원하는.

서문

셀 무료 단백질 합성 (CFPS) 등에 대 한 단백질 생산, 기능 유전체학, 대사 공학, 지난 50 년1,2내에서 새로운 기회의 번호를 잠금 해제는 기술로 떠오르고 있다. 표준 vivo에서 단백질 식 플랫폼에 비해, CFPS 세 가지 주요 이점을 제공 합니다: 1) 플랫폼의 셀 무료 자연 수는 잠재적으로 독성 또는 셀3,4 외국 것 단백질의 생산 ,,56; 2) 게놈 DNA의 비활성화 및 서식 파일의 gene(s)를 인코딩 하는 DNA의 소개의;는 protein(s)의 생산에 대 한 반응 내에서 조직의 에너지의 모든 채널 그리고 3) 플랫폼의 오픈 자연 수정 하 고 반응 조건 및 실시간7,8구성 모니터링 사용자 수 있습니다. 반응에 대 한이 직접 액세스 지원 확장 된 화학 및 산화 환 원 조건 새로운 단백질의 생산 및 대사 과정2,9, 의 튜닝에 대 한 생물 학적 시스템의 확대 10. 또한 수 있습니다 더 빠른 디자인-빌드-테스트11주기 위한 단일 포트 시스템에 CFPS 반응 활동 분석 실험을 결합 하 여 사용자를 직접. 작은 볼륨 방울 CFPS 반응을 수행 또는 종이 기반 장치에 더 높은 처리량 검색 노력을 지원 및 신속한 프로토 타입12,,1314,15 용량 ,16. 이러한 장점와 시스템의 플러그 앤 플레이 성격, CFPS 고유 어렵다 녹 표현 vivo에서단백질의 생산 등 생명 공학 응용 프로그램의 다양 한 활성화는17, 18,,1920, 질병21,,2223, 수요 biomanufacturing18,24 의 검출 25,,2627및 교육28,29, 유연성과 셀 무료 플랫폼의 유틸리티 모두 보기.

CFPS 시스템 모두 간결한과 진 핵 세포 라인에서 원유 lysates의 다양 한에서 생성할 수 있습니다. 다양 한 옵션 선택, 시스템에서 각각의 장점과 단점의 응용 프로그램에 따라 수 있습니다. CFPS 시스템 또한 준비 시간, 비용 및 생산성에 크게 다릅니다. 가장은 일반적으로 활용 하는 세포 추출 물 밀 세균, 토끼 reticulocyte, 곤충 세포, 및 후자 되 단백질30의 가장 높은 체적 수확량을 생산 하는 동안 날짜를 가장 비용 효율적인 대장균 세포에서 생산 됩니다. . 다른 CFPS 시스템 될 수 있지만 그들의 타고 난 포스트 번역 상 수정 기계에 대 한 유리한, 신흥 대장균을 사용 하 여 응용 프로그램-기반된 기계 site-specifically phosphorylated 생성 하 여 격차를 해소 수 있다 고 수요31,32,33,,3435당화 단백질.

CFPS 반응 중 일괄 처리, 연속 교환 셀 프리 (CECF) 또는 연속 흐름 셀 무료 (CFCF) 형식에서에서 실행할 수 있습니다. 일괄 처리 형식은 닫힌된 시스템 반응 수명이 감소 양의 반응 및 반응의 억제 부산물의 축적으로 인해 제한 됩니다. CECF 및 CFCF 메서드는 반응의 수명을 늘릴를 그로 인하여 증가 체적 단백질 수율 일괄 처리 반응에 비해. 이것은 새로운 반응 반응2과정을 통해 제공 하는 동안 반응 용기에서 제거할 단백질 합성의 부산물을 함으로써 수행 됩니다. CFCF, 경우 관심의 단백질은 또한 CECF, 반 투과성 막36,37의 구성 하는 반응 챔버에 관심이 남아의 단백질에에서 반응 약 실에서 제거할 수 있습니다. 이러한 메서드는 관심38,39,40,,4142, 표현 하기 어려운 단백질의 가난한 체적 수확량을 극복에서 특히 귀중 한 43. CECF 및 CFCF 접근을 구현 과제는 1) 동안 그들은 결과 바이오 기계 전사 및 번역에 대 한 책임을 더 효율적으로 사용, 그들은 특히 2 및 전반적인 비용을 증가 시 약의 대량 필요) 그들은 더 복잡 한 반응 설정 및 배치 형식44에 비해 특수 장비 필요 합니다. 새 사용자에 대 한 접근성을 보장 하기 위해 프로토콜 설명 여기 반응이 볼륨 증가 밀리 리터 규모 반응 볼륨에 대 한 특정 권장 사항을 15 µ L의 배치 형식에 초점.

여기에 소개 하는 방법을 구현 세포 성장, 준비, 추출 및 형식 반응 설치는 대장균에 대 한 일괄 (학부 학생) 등 기본적인 실험실 기술 전문가 들은 활성화-CFPS 시스템을 기반으로. 이 방법은 반응 키트 기반 설치의 용이성을 희생 하지 않고 상업적으로 사용 가능한 키트에 비해 비용 효과적입니다. 또한,이 방법을 통해 응용 프로그램에서에서 실험실 그리고 분야에서. CFPS를 구현 하도록 결정, CFPS 모든 경우에 우수한 되지 않을 수도 있습니다 새로운 사용자 시작 투자에 대 한 기존의 단백질 표정 시스템의 효능을 평가 철저 하 게 해야 합니다. 여기에 설명 된 CFPS 메서드는 사용자가 직접 구현 하는 다양 한 응용 프로그램, 기능 유전체학, 높은 처리량 테스트, vivo에서 식 필드에 대 세공 되지 않은 단백질의 생산을 포함 하 여를 사용합니다 바이오 센서 및 합성 생물학에 대 한 교육 키트를 포함 하 여 응용 프로그램. 대사 공학 같은 추가 응용 프로그램 단백질 식 조건, 질병 탐지, 및 확장을 사용 하 여 CECF 또는 CFCF 메서드가 여전히 가능 하지만 반응의 추가 수정에 대 한 CFPS 플랫폼 경험을 해야 튜닝 조건입니다. 우리의 방법을 상대적으로 신속 하 고 재현성 쥡니다, 최적화 된 예비 배합 물45를 사용 하는 간소화 된 CFPS 반응 설치 다음을 통해 세포 세포의 용 해 방법 풍부한 미디어 및 당황 하 게 플라스 크, 성장에 결합 되어 있습니다. 세포 성장 방법이이 분야 내에서 다소 표준화 되, 하는 동안 세포 세포의 용 해 방법 넓게 변화 한다. 쥡니다, 뿐만 아니라 일반적인 세포의 용 해 방법 포함 프랑스 언론 활용, 한 균질 화기, 비드 고물 차, 또는 lysozyme 다른 생 화 학적 및 물리적 중단 방법46,47,48, 49. 조 세포 추출 물의 약 2 mL 셀의 1 L 당 가져온 우리의 방법을 사용 하 여. 이 양의 세포 추출 물 4 백을 지원할 수 있습니다 15 µ L CFPS 반응, 각 생산 ~ 900 µ g/mL 템플릿 플라스 미드 pJL1-sfGFP에서 기자 sfGFP 단백질의. 이 방법은 비용 $0.021 / µ g의 sfGFP 제작 ($.019 / µ L의 반응), 노동 및 장비 (보충 그림 1)의 비용을 제외 하 고. 처음부터 시작,이 방법은 한 사람에 의해 4 일에 구현할 수 있다 고 CFPS 반응 시간 (그림 1) 내에서 완료 될 수 있다 반복 합니다. 또한, 프로토콜 사용자의 요구에 맞게 시 약 준비의 큰 배치에 대 한 볼륨 확장할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여기에 제시 된 프로토콜만 기본적인 실험실 기술을 필요로 실험실 훈련 비-학부 학생 등 전문가 의해 구현할 수 있습니다. 아래에서 설명 하는 절차와 함께 비디오 특별히 개발 되었습니다 광범위 한 사용에 대 한 대장균 CFPS 플랫폼의 접근성을 개선 하기 위해.

프로토콜

1. 미디어 준비 및 세포 성장

  1. 주 1
    1. 글리세롤에서 행진 대장균 BL21*(DE3) 셀 파운드 한 천 격판덮개에 재고 및 적어도 18 h 37 ° c.에 품 어
    2. 121 ° c.에 30 분 동안 액체 주기 파운드 미디어와 고압 솔루션 50 mL를 준비 실내 온도에 상점.
  2. 주 2
    1. 추가 정보에 설명 된 대로 2 x YTP 미디어와 0.4 M D-포도 당 솔루션의 250 mL 750 mL를 준비 합니다.
    2. 2 x YTP 미디어를 압력가 2.5 L 당황 하 고 플라스 크와 D-포도 당 솔루션 압력가 500 mL 유리병에 붓으십시오. 고압 액체는 121 ° c.에 30 분에 두 솔루션
    3. 세포 성장 접종 시 성장 속도 최대화 하기 위해 다음 날에 수행 하는 경우 모두 살 균 솔루션 37 ° C에 저장 됩니다 확인 하십시오. 접종까지 솔루션을 결합 하지 마십시오.
      참고: 솔루션 2 x YTP 미디어는 높게 오염 하는 경향이 있지만, 필요한 경우 1-2 d 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
    4. 오염을 피하기 위하여 소독된 루프 및 무 균 기법을 사용 하 여 BL21(DE3)의 단일 식민지와 파운드 미디어의 50 mL를 접종 하 여 BL21(DE3)의 숙박 문화를 시작 합니다.
    5. BL21*(DE3) LB 문화 50 mL 37 ° C에 250 rpm 인큐베이터를 흔들어 놓고 하룻밤 15-18 h에 대 한 성장.
    6. 준비 하 고 3, 4, 등 일에 필요한 모든 재료를 소독: 두 1 L 원심 분리기 병, 4 x 찬 50 mL 원뿔 튜브 (무게 및 3에 대 한 기록 중), 그리고 많은 1.5 mL microfuge 관.
  3. 3 일
    1. 떨고 인큐베이터에서 파운드에 BL21*(DE3)의 50 mL 숙박 문화를 제거 하 고 측정 하는 1시 10분을 사용 하 여 분 광 광도 계에 OD600 파운드 미디어와 함께 희석. 계산 시작 OD600 0.1에 대 한 미디어의 1 패를 추가 하는 데 필요한 하룻밤 문화의 볼륨 (예를 들어 1:10 희석은 0.4, 읽기의 세600 undiluted OD600 의 25 mL를 접종 하는 경우 = 4.0 하룻밤 문화 1 L 2로 x YTP G)입니다.
    2. LB 문화 50 mL와 함께 37 ° C 배양 기에서 따뜻하게 2 x YTP 미디어와 D-포도 당 솔루션을 제거 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여 신중 하 게 붓고 D-포도 당 솔루션 (당황 하 고 플라스 크의 측면을 피하고) 2 x YTP 미디어.
      참고: D-포도 당의 추가 완료 2의 1 L에 대 한 제조 법 x YTPG.
    3. 유지 하 고 메 마른 기술, 접종 0.1 세600에서 1 L 문화를 시작 적절 한 양의 50 mL 문화 2 x YTPG 솔루션의 1 리터. 즉시 200 rpm에서 인큐베이터를 떨고 37 ° C에 접종된 1 L 문화 장소.
    4. 받아 성장의 첫 번째 시간 후 읽기 첫 번째 OD600 (지연 위상 전형적인 1 시간 소요). 문화를 희석 하지 마십시오. 측정 세600 매 20-30 분 약 세600 0.6에 도달할 때까지 계속 합니다.
    5. OD600 에 도달 되 면 = 0.6, 1 M IPTG의 1 mL을 추가 (최종 농도 1 L 문화에서 = 1 m m) 2 x YTPG 문화.
      참고: 이상적인 유도 OD600 은 0.6; 그러나, 0.6-0.8의 범위는 허용. IPTG에 의해 유도 생 생산의 T7 RNA 중 합 효소 (T7RNAP)입니다.
    6. 유도 후 측정 OD600 매 20-30 분 약 3.0에 도달할 때까지.
      참고:이 시간 동안에 4 ° C 원심 분리기를 식혀. 추가 정보에 설명으로 차가운 S30 버퍼를 준비 합니다. S30 버퍼는 사전에 준비 하 고, DTT 사용의 날까지 추가 되지 않습니다 확인 합니다.
    7. OD600 3.0 (그림 2A)에 도달 하면, 문화는 얼음 물을 욕조에 차가운 1 L 원심 분리기 병에 붓으십시오. 원심 분리기에 균형으로 사용 될 동등한 무게의 물 가득 1 L 원심 분리기 병을 준비 합니다.
      참고: 흡 광도 값 악기 악기에서 다. 동안 BL21(DE3)의 수확의 OD600 민감한 변수, 사용자 평가 및 문제 해결 측정으로이 변수를 최적화 하는 것이 좋습니다. 큰 광 작은 cuvette 기반 광에 비해 상대적으로 낮은 OD600 읽기 발생할 수 있습니다.
    8. 1 L 병 5000 x g와 작은 셀에 10 ° C에서 10 분 원심
    9. 천천히 상쾌한 및 기관의 생물 학적 폐기물 절차에 따라 처분 하 거 라. 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
    10. 메 마른 주걱을 사용 하 여, 원심 분리기 병에서 셀 펠 릿을 긁 고 찬 50 mL 원뿔 튜브에 그것을 전송.
    11. 차가운 S30 버퍼의 30 mL 원뿔 튜브에 추가 하 고 완전히 없는 청크와 resuspended 때까지 얼음에 짧은 파열 (20-30 s)와 나머지 기간 (1 분) vortexing에 의해 셀 펠 릿 resuspend.
    12. 일단 펠 릿 resuspended 완전히 x g와 10 ° C (-4 ° C에 냉각) 5000에서 밸런스와 10 분 동안 원심 분리기로 다른 50 mL 원뿔 튜브 물으로 사용 합니다.
      참고: 셀을 수확 때 필요한 3 세척의 1세인트 완료 했습니다.
    13. 상쾌한 및 기관의 생물 학적 폐기물 절차에 따라 처분 하 거 라. S30 버퍼 춥고 5000 x g와 10 ° C (-4 ° C에 냉각) 10 분 동안 원심 분리기의 20-25 mL와 펠 릿 resuspend
      참고: 3 세척의 2차 완료 했습니다.
    14. 다시, 상쾌한 및 기관의 생물 학적 폐기물 절차에 따라 처분 밖으로 붓는 다. S30 버퍼 및 resuspend는 펠 릿을 다시 소용돌이의 정확 하 게 30 mL를 추가 합니다.
    15. 사용 3 미리 무게, 차가운 50 mL 원뿔 튜브와 혈 청 학적인 피 펫 필러 살 균 피 펫, aliquot와 resuspended 펠 릿/s 30 버퍼 혼합물의 10 mL 3 원뿔 관의 각각에.
      참고: 3 관으로 셀 분할는 필요 하지 않습니다, 하지만이 단계 작은 세포 펠 릿에 결과 (~ 1 g) 나중 단계에서 증가 편의 위해.
    16. X g와 10 ° C (-4 ° C에 냉각) 5000에서 10 분에 대 한 필요에 따라 적절 한 균형을 사용 하 여 모든 튜브 원심
      참고:이 최종 세척 단계를 완료합니다.
    17. 상쾌한 및 기관의 생물 학적 폐기물 절차에 따라 처분 하 거 라. 신중 하 게 원뿔 튜브 및 깨끗 한 조직; 캡의 내부를 닦아 하 여 초과 S30 버퍼를 제거 펠 릿을 만지지 마십시오.
    18. 분석 균형에 튜브를 reweigh 하 고 각 관에 마지막 펠 릿 체중을 기록 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지이 시점에서. 액체 질소에서 냉동 고 최대 1 년까지 추출 준비를 위한 필요-80 ° C에서 저장 된 펠 릿 플래시 수 있습니다.

2. 원유 셀 추출 준비-주 4

  1. 추출 물 준비를 위해 계속 셀 차가운 얼음에 각 단계. 펠 릿의 세포 질량의 1 g 당 찬 S30 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 그 dithiothreitol (DTT) 2 m m의 최종 농도에 s 30 버퍼에 보완 되어 있는지 확인 합니다.
    참고:이 기간 동안 4 ° C에 microcentrifuge를 식혀.
  2. 얼음까지 완벽 하 게 resuspended에 짧은 파열 (20-30 s)와 나머지 기간 (1 분) vortexing에 의해 셀 펠 릿을 resuspend. 물의 resuspension 어려운 경우 서 리 없애다에 30 분 동안 얼음에 펠 릿을 둡니다.
  3. Resuspended 셀의 1.4 mL 1.5 mL microfuge 관으로 전송 합니다.
  4. Resuspended 셀의 1.4 mL 비 커에 얼음 물 목욕으로 포함 한 1.5 mL 튜브를 배치 합니다. 45 sonicate 59 다음에 s 3 총 주기, 진폭에 대 한에서 s 50%로 설정. 닫고 오프 기간 동안 섞어 부드럽게 튜브를 반전 합니다. 총, 포함 하는 resuspended 세포 (그림 3A & 3B)의 1.4 mL 각 1.5 mL microfuge 관에 800-900 J의 에너지를 제공 합니다.
    참고:이 단계는 sonicator 종류에 민감한 모델 사용 하 고 장비는이 절차에 나열 된 것 보다 다른 경우 최적화 되어야 합니다. 두 개의 상호 보완적인 접근을 추출이이 단계 동안 준비의 금액을 사용할 수 있습니다: 1) 여러 1.5 mL microfuge 관 병렬로 sonicated 수 / 2) 더 큰 볼륨 원뿔 튜브에서 sonicated 수 있습니다 (최대 셀 튜브 당 물의 resuspension의 15 mL) 전달 하는 에너지의 양을 확장으로 설명한 29,45.
  5. 즉시 완료 된 후 쥡니다, lysate의 1.4 mL에 1 M (보충 추가 2 mM DTT) DTT의 4.5 µ L을 추가 하 고 섞어 여러 번 반전. 얼음에 튜브를 놓습니다. 원심 분리를 진행 하기 전에 resuspended 세포의 어떤 추가 튜브에 대 한 2.4 및 2.5 단계를 반복 합니다.
  6. 18000 x g와 10 분 (그림 3C) 4 ° C에서 Microcentrifuge 샘플.
  7. 새로운 1.5 mL microfuge 관으로는 상쾌한 플라스틱. 펠 릿;를 방해 하지 마십시오 수익률을 극대화 하는 노력에 펠 릿을 방해 보다 순도 유지 하기 위해 일부 상쾌한을 남겨두고 하는 것이 바람직합니다.
  8. (이것은 결선 반응) 인큐베이터의 떨고 플랫폼에 튜브를 녹화 하 여 상쾌한 250 rpm 및 60 분 동안 37 ° C에 이전 단계에서 품 어.
  9. 10000 x g와 10 분 동안 4 ° C에서 Microcentrifuge 샘플.
  10. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 새 튜브를 전송. 스토리지에 대 한 추출의 많은 100 µ L aliquots를 만듭니다.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기에, 그리고 액체 질소에서 냉동 고 CFPS 반응에 필요한 때까지 1 년까지-80 ° C에 저장 된 추출 플래시 수 있습니다. 생산성 (그림 4)를 추출할 손해 없이 적어도 5 freeze-thaw 주기를 겪고 수 있습니다.

3. 셀 무료 단백질 합성 배치 형식 반응

  1. Thaw 솔루션 A와 B, DNA 템플릿, BL21(DE3) 추출 (냉동) 하는 경우, T7RNAP, 고 분자 학년 물 약 수.
    참고: CFPS 반응 템플릿은 추가 정보에서 찾을 수 있습니다. 솔루션 A와 B 요리법 보충 정보 에 제공 되며 CFPS 위한 PANOx SP 기반으로 에너지 시스템을 지원 하기 위해 수많은 시 약에 대 한 특정 농도에 해당. 각 시 약 및 CFPS 지원할 수 있는 이러한 시 약 농도에서 허용 가능한 변이의 역할 결정된50되었습니다. T7RNAP 정화 프로토콜 추가 정보51에서 찾을 수 있습니다. 추가 T7RNAP 체적 수율을 높일 수 있습니다 하지만 T7RNAP 동안 세포 성장을 유도 하는 경우 필요 하지 않습니다. 플라스 미드 DNA 템플렛 (pJL1-sfGFP) 두 세척 키트, 후 처리 DNA 정리 PCR 정화 키트 (그림 2B)를 사용 하 여 뒤에 워시 버퍼를 사용 하 여 maxiprep 키트를 사용 하 여 준비 될 수 있다. 선형 DNA 템플릿 CFPS 반응에도 사용할 수 있습니다.
  2. 필요한 양의 microfuge 관 CFPS 반응에 필요한 레이블을 지정 합니다.
    참고: 반응 다양 한 선박 크기에서 수행할 수 있습니다 하지만 작은 용기 체적 단백질 수율 (그림 2C)을 줄일 수 있습니다. 같은 크기 용기에 반응 확장 기능 감소 하는 산소 교환 볼륨 비 표면적의 감소 때문으로 체적 수익률 또한 줄일 수 있습니다. 100 μ 이상 반응이 볼륨 증가, 플랫 바닥 잘 플레이트 31,,3752를 사용 하는 것이 좋습니다.
  3. 추가 솔루션의 2.2 µ L, 2.1 µ L 솔루션 B, BL21*(DE3)의 5 µ L의 추출, T7RNAP의 0.24 μ g (16 μ g/mL 최종 농도) 0.24 DNA 템플렛 (16 ng/mL 최종 농도) 및 15 µ L를 최종 볼륨을가지고 물 ng.
    참고: A와 B 자주 소용돌이 솔루션 반응 설치 부품의 침전을 방지 하 고 각 반응 하는 동안 받습니다 각 솔루션의 동종 약 수 있습니다. 혼합 튜브 대신 반전, vortexing 추출 하지 마십시오.
  4. 모든 시 약 반응에 추가 되었습니다, 최종 반응 혼합물을 1.5 mL microfuge 관의 맨 아래에 단일 15 µ L 비드 결합 하면서 위아래로 pipetting 또는 부드럽게 vortexing 각 튜브를 혼합.
  5. 37 ° C 배양 기에 각 반응 없이 하룻밤 4 h 또는 30 ° C를 흔들어 놓습니다.
    참고: 성공적인 반응은 수 수 질적 평가 시각 CFPS 반응 혼합물 (그림 3D) 이내 sfGFP 제품의 녹색 색상에 따라. 관심사의 단백질의 표정 또한 SDS 페이지 (보충 그림 2)에 의해 확인할 수 있습니다.

4. 기자 단백질, [sfGFP]의 정량화

  1. 잘 정량화 (일반적으로 반응 관 당 3 중에서 수행 됨)에 필요한 각 0.05 m HEPES, pH 8, 48 µ L를 로드 합니다.
  2. 인큐베이터에서 반응을 제거 합니다. 위쪽 및 아래쪽 각 반응 혼합 플라스틱 다음 0.05 M HEPES, pH 8의 48 µ L에 반응의 2 µ L를 전송 합니다. 피펫으로 위쪽 및 아래쪽에 다시를 섞어 잘.
  3. 일단 모든 반응 로드 혼합, 96 잘 접시는 fluorometer로 놓고 sfGFP 끝점 형광을 측정 합니다.
    참고: sfGFP 형광 정량화에 대 한 여기 및 방출 파장은 485 nm와 510 nm, 각각.
  4. 이전에 생성 된 표준 곡선을 사용 하 여 얻은 형광 신호에서 [sfGFP]를 확인 합니다.
    참고: 추가 정보 (보충 그림 3)에 형광 강렬 대 sfGFP 농도의 표준 곡선을 생성 하기 위한 지침 제공 됩니다. 사용자는 악기 감도 다를 수 있습니다 이후 그들의 악기에 대 한 표준 곡선을 설정 해야 합니다.

결과

우리 쥡니다 기반 대장균 추출 제시 준비 프로토콜을 매일 절차 분석을 보여주는 그림 1 4 일 기간 동안 완료 될 수 있다. 가 단성 다양 한 일시 중지 포인트, 매일에 완료할 수 있는 단계에 있다 하지만 우리이 워크플로 실행에 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 또한, 셀 펠 릿 (단계 1.3.18)와 완벽 하 게 준비 된 추출 (단계 2.10)는 안정-80 ° C에...

토론

셀 무료 단백질 합성 응용 프로그램 biomanufacturing에서 생화학 시스템의 신속한 프로토 타입에 이르기까지 다양 한 강력 하 고 사용 기술로 떠오르고 있다. 애플 리 케이 션의 광범위 한 모니터링 하 고 조작 하 고, 실시간으로 세포질 기계 장치를 보강 하는 능력에 의해 지원 됩니다. 이 플랫폼 기술의 확대 영향에도 불구 하 고 광범위 한 적응 남아 있다 메서드의 구현에서 기술적인 뉘앙스로 인해 ?...

공개

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언 합니다.

감사의 말

저자 박사 제니퍼 VanderKelen, 안드레아 Laubscher, 및 기술 지원에 대 한 토니 Turretto, 웨슬리 Kao, Layne 윌리엄스, 그리고 유용한 토론에 대 한 크리스토퍼 Hight를 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한 자금 빌과 린다 리 펀드, 생명 공학의 쉐 브 론 생명 공학 적용 연구 기금 그랜트, 칼 폴 리 연구, Scholarly, 및 창조적인 활동 그랜트 프로그램 (RSCA 2017), 응용 프로그램에 대 한 센터에서 지원을 인정합니다 그리고 국립 과학 재단 (NSF-1708919). MZL은 캘리포니아 주립 대학 대학원 부여 인정합니다. MCJ는 육군 연구 사무실 W911NF-16-1-0372 인정, 국립 과학 재단 부여 MCB 1413563 및 MCB 1716766는 공군 연구 실험실 센터 우수 그랜트 FA8650-15-2-5518, 방위 위협 감소 기관 보조금 HDTRA1-15-10052/P00001, 데이빗과 루 패 커드 재단, 카밀 드레퓌스 교사 학자 프로그램의 에너지 BER 그랜트 드-SC0018249, 인간 프론티어 과학 프로그램 (RGP0015/2017), 미상 합동 게놈 연구소 ETOP 그랜트, 부서 및 Searle 자금 시카고 커뮤니티 트러스트 지원에 대 한 지원으로 시카고 생명 컨소시엄.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

참고문헌

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer's disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

144CFPSTX TLCFME

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유