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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo dettaglia i passaggi, i costi e attrezzature necessarie per generare e. coli-base di estratti cellulari e implementare in vitro reazioni di sintesi di proteine entro 4 giorni o meno. Per sfruttare la natura flessibile di questa piattaforma per vaste applicazioni, discutiamo le condizioni di reazione che possono essere adattate e ottimizzate.

Abstract

Negli ultimi 50 anni, sintesi di proteina Cell-Free (CFPS) è emerso come una potente tecnologia per sfruttare la capacità trascrizionale e traslazionale delle cellule all'interno di una provetta. Eliminando la necessità di mantenere la vitalità della cellula ed eliminando la barriera cellulare, CFPS è stato fondamentale per le applicazioni emergenti in bioproduzione di proteine tradizionalmente difficili, nonché applicazioni nella prototipazione rapida per Ingegneria metabolica e genomica funzionale. I nostri metodi per l'implementazione di un e. coli-piattaforma basato su CFPS ai nuovi utenti di accedere a molte di queste applicazioni. Qui, descriviamo i metodi per preparare l'estratto attraverso l'uso di media arricchita, boccette sconcertati e un metodo riproducibile di lisi cellulare basato su sonicazione sintonizzabile. Questo estratto quindi può essere utilizzato per l'espressione della proteina in grado di produrre 900 µ g/mL o più di proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP) in appena 5 ore dalla messa a punto sperimentale all'analisi dei dati, dato che le scorte di reattivo appropriato sono state preparate in anticipo. Il costo stimato avvio di ottenere reagenti è $4.500 che sosterrà migliaia di reazioni ad un costo stimato di $0,021 per µ g di proteina prodotta o $0,019 per µ l di reazione. Inoltre, i metodi di espressione della proteina specchio la facilità dell'installazione reazione visto nei sistemi disponibili in commercio a causa dell'ottimizzazione di reagente premiscelati, ad una frazione del costo. Al fine di consentire all'utente di sfruttare la natura flessibile della piattaforma CFPS per vaste applicazioni, abbiamo identificato una varietà di aspetti della piattaforma che possono essere ottimizzate e ottimizzato a seconda delle risorse disponibili e gli esiti di espressione della proteina desiderato.

Introduzione

Sintesi di proteine senza cellula (CFPS) è emerso come una tecnologia che ha sbloccato una serie di nuove opportunità per la produzione di proteine, genomica funzionale, ingegneria metabolica e più entro gli ultimi 50 anni1,2. Rispetto alla standard in vivo piattaforme di espressione di proteine, CFPS offre tre vantaggi principali: 1) la natura senza cellula della piattaforma consente la produzione di proteine che sarebbe potenzialmente tossici o stranieri per la cella3,4 ,5,6; 2) inattivazione di DNA genomic e l'introduzione di un modello di DNA codificante il gene di interesse canale tutta l'energia sistemica all'interno della reazione per la produzione della proteina di interesse; e 3) la natura aperta della piattaforma consente all'utente di modificare e monitorare le condizioni di reazione e la composizione in tempo reale7,8. Questo accesso diretto alla reazione supporta l'incremento dei sistemi biologici con composizioni chimiche espanse e condizioni redox per la produzione di nuove proteine e la messa a punto di processi metabolici2,9, 10. diretto accesso consente inoltre all'utente di combinare la reazione CFPS con analisi di attività in un sistema singolo-pot per cicli di test per la compilazione di una progettazione più rapida11. La capacità di eseguire la reazione CFPS nelle goccioline di piccolo volume o su dispositivi basati su carta maggiori azioni di alto-rendimento individuazione di supporti e prototipazione rapida12,13,14,15 ,16. A seguito di questi vantaggi e la natura di plug and play del sistema, CFPS ha permesso in modo univoco una varietà di applicazioni della biotecnologia come la produzione di proteine che sono difficilmente solubile veloce in vivo17, 18,19,20, rilevamento di22,21,malattia23, sulla domanda bioproduzione18,24 ,25,26,27e formazione28,29, i quali mostrano la flessibilità e l'utilità della piattaforma senza cellula.

Sistemi di CFPS possono essere generati da una varietà di greggio lisati da entrambe le linee cellulari procarioti ed eucarioti. Questo permette diverse opzioni nel sistema di scelta, ciascuno dei quali hanno vantaggi e svantaggi a seconda dell'applicazione di interesse. CFPS sistemi variano anche notevolmente in produttività, costi e tempi di preparazione. La maggior parte utilizzati comunemente cella estratti sono prodotti da germe di grano, dei reticolociti di coniglio, cellule di insetto e cellule di Escherichia coli , con quest'ultimo è il più redditizio per data, producendo il massimo rendimento volumetrico della proteina30 . Mentre altri sistemi CFPS possono essere vantaggiosi per le loro macchine di modificazione post-traduzionale innata, emergendo applicazioni utilizzando il e. coli-base macchine sono in grado di colmare il divario generando site-specifically fosforilato e proteine glicosilate su domanda31,32,33,34,35.

Le reazioni CFPS possono essere eseguite in entrambi batch, scambio continuo senza cellula (CECF) o flusso continuo senza cellula (CFCF) formati. Il formato di batch è un sistema chiuso in cui durata di reazione è limitata a causa della diminuzione quantità di reagenti e l'accumulazione dei sottoprodotti inibitori della reazione. Metodi CECF e CFCF aumentano la durata della reazione e quindi causare rendimenti volumetrici aumentata della proteina rispetto alla reazione batch. Questa operazione viene eseguita consentendo i sottoprodotti della sintesi proteica per essere rimosso dal recipiente di reazione, mentre nuovi reagenti sono forniti nel corso della reazione2. Nel caso di CFCF, la proteina di interesse può essere rimosso anche dalla camera di reazione, mentre in CECF, la proteina di interesse rimane nella camera di reazione, costituito da una membrana semi-permeabile36,37. Questi metodi sono particolarmente preziosi nel superare la scarsa resa volumetrica di difficile--express proteine di interesse38,39,40,41,42, 43. Le sfide nell'attuazione degli approcci CECF e CFCF sono che 1) mentre risultano in un uso più efficiente dell'apparato bio responsabile della trascrizione e traduzione, richiedono in particolare più grandi quantità di reagenti che aumenta il costo complessivo e 2) Essi richiedono configurazioni più complesse di reazione e attrezzature specializzate rispetto al lotto formato44. Al fine di garantire l'accessibilità per i nuovi utenti, i protocolli descritti qui messa a fuoco sul formato batch a volumi di reazione di 15 µ l con raccomandazioni specifiche per aumentare il volume di reazione per la scala di millilitro.

I metodi presentati qui abilitare non esperti con competenze di base di laboratorio (ad esempio studenti universitari) per implementare la crescita delle cellule, estrarre preparazione e installazione di reazione formato in batch per un e. coli-CFPS sistema basato. Questo approccio è conveniente rispetto ai kit disponibili in commercio senza sacrificare la facilità di installazione basato su kit di reazione. Inoltre, questo approccio consente alle applicazioni in laboratorio e in campo. Quando si decide di implementare CFPS, nuovi utenti dovrebbero valutare attentamente l'efficacia di sistemi di espressione di proteine convenzionali per investimento per l'avvio, come CFPS non può essere superiore in ogni caso. I metodi CFPS qui descritti consentono all'utente di implementare direttamente una varietà di applicazioni, tra cui la genomica funzionale, test, la produzione di proteine che sono insolubili per espressione in vivo , come pure il campo ad alta velocità applicazioni tra cui biosensori e kit didattici per biologia sintetica. Le applicazioni aggiuntive come ingegneria metabolica, ottimizzazione delle condizioni di espressione della proteina, individuazione della malattia e scalabilità utilizzando metodi CECF o CFCF sono ancora possibili ma possono richiedere l'esperienza con la piattaforma CFPS per ulteriori modifiche della reazione condizioni. I nostri metodi di combinano una crescita in media arricchita e boccette sconcertati, con metodi relativamente rapidi e riproducibili di lisi cellulare mediante sonicazione, seguita da un'installazione di reazione CFPS semplificata che utilizza ottimizzato premiscele45. Mentre i metodi di crescita cellulare sono diventati un po' standardizzati all'interno di questo campo, metodi per lisi cellulare variano ampiamente. Oltre a sonicazione, metodi di lisi comuni includono l'utilizzo di una pressa francese, un omogeneizzatore, battitori della perla, o lisozima e altri disagi fisici e biochimici metodi46,47,48, 49. usando i nostri metodi, circa 2 mL di estratto grezzo delle cellule sono ottenute per 1 L di cellule. Questa quantità di Estratto di cellule in grado di supportare quattro cento 15 µ l CFPS reazioni, ogni produzione ~ 900 µ g/mL di proteina sfGFP reporter dal plasmide modello pJL1-sfGFP. Questo metodo costa $0,021 / µ g di prodotto sfGFP ($.019/microlitro di reazione), escluso il costo della manodopera e le attrezzature (Supplemental figura 1). A partire da zero, questo metodo può essere implementato in 4 giorni da una sola persona e ripetere le reazioni CFPS possono essere completate entro le ore (Figura 1). Inoltre, il protocollo può essere scalato in volume per grandi lotti di preparazione dei reagenti in base alle esigenze dell'utente. D'importanza, il protocollo qui presentato può essere implementato da laboratorio addestrato non-esperti quali studenti universitari, come richiede solo la capacità di laboratorio di base. Le procedure descritte di seguito e il video di accompagnamento sono stati specificamente sviluppati per migliorare l'accessibilità della piattaforma CFPS Escherichia coli per l'ampio utilizzo.

Protocollo

1. Media preparazione e crescita cellulare

  1. 1 ° giorno
    1. Le cellule di e. coli BL21*(DE3) striscia da un glicerolo stock su una piastra di agar LB e incubare per almeno 18 ore a 37 ° C.
    2. Preparare 50 mL di LB media e autoclave la soluzione su un ciclo liquido per 30 min a 121 ° C. Conservare a temperatura ambiente.
  2. 2 ° giorno
    1. Preparare 750 mL di 2 x YTP media e 250 mL di soluzione di 0,4 M D-glucosio come descritto nelle informazioni supplementari.
    2. Versare 2 media x YTP in una boccetta di sconcertato 2,5 L sterilizzato nell'autoclave e la soluzione di D-glucosio in una bottiglia di vetro sterilizzati nell'autoclave 500 mL. Autoclave entrambe le soluzioni su un ciclo liquido per 30 min a 121 ° C.
    3. Verificare che entrambe le soluzioni sterili sono memorizzate a 37 ° C se la crescita cellulare viene eseguita il giorno successivo, per elevare i tassi di crescita al momento dell'inoculazione. Non combinare soluzioni fino a inoculazione.
      Nota: Soluzioni possono essere memorizzati a 4 ° C per 1-2 d se necessario, anche se i media x YTP 2 è molto incline alla contaminazione.
    4. Avviare una coltura durante la notte di BL21 (DE3) inoculando 50 mL di LB media con una singola colonia di BL21 (DE3) utilizzando un ciclo sterilizzato e una tecnica sterile per evitare la contaminazione.
    5. Inserire i 50 mL di LB BL21*(DE3) cultura a 37 ° C 250 giri/min agitazione incubatrice e crescere durante la notte per 15-18 h.
    6. Preparare e sterilizzare tutti i materiali necessari per i giorni 3 e 4, tra cui: due bottiglie di centrifuga 1 L, 4 x freddo 50 mL provette coniche (pesare e masse record di tre) e molti tubi del microfuge 1,5 mL.
  3. 3 ° giorno
    1. Rimuovere la cultura notte 50 mL di BL21*(DE3) in LB dall'incubatrice agitazione e misurare il OD600 su uno spettrofotometro utilizzando un 01:10 diluizione con LB media. Calcolare il volume di notte cultura necessario aggiungere 1 L di media per una partenza OD600 di 0,1 (ad esempio, se un OD600 di un 01:10 diluizione viene letto come 0.4, inoculare 25 mL della non diluito OD600 = 4,0 cultura durante la notte in 1 L di 2 x YTP G).
    2. Togliere l'incubatore 37 ° C con 50 mL di LB cultura riscaldato 2 x YTP media e soluzioni di D-glucosio. Utilizzando una tecnica sterile, attentamente versare la soluzione di D-glucosio in 2 media x YTP (evitando i lati del matraccio sconcertato).
      Nota: Aggiunta di D-glucosio completa la ricetta per 1 L di 2 x YTPG.
    3. Mantenere una tecnica sterile, inoculare il 1 L di 2 x YTPG soluzione con la quantità appropriata della cultura 50ml per iniziare la coltura di 1L a un 0,1 OD600. Posizionare immediatamente la cultura 1L inoculato in un 37 ° C in agitazione incubatore a 200 giri/min.
    4. Prendere il primo OD600 lettura dopo la prima ora di crescita (fase di ritardo tipico dura 1h). Non diluire la cultura. Continuare a prendere misure600 OD approssimativamente ogni 20-30 min fino a OD600 raggiunge 0,6.
    5. Dopo aver raggiunto OD600 = 0.6, aggiungere 1 mL di 1 M IPTG (concentrazione finale nella cultura 1 L = 1 mM) alla cultura x YTPG 2.
      Nota: Induzione ideale OD600 è 0,6; Tuttavia, una gamma di 0.6-0.8 è accettabile. Induzione di IPTG è per la produzione endogena di T7 RNA polimerasi (T7RNAP).
    6. Dopo l'induzione, misurare il OD600 circa ogni 20-30 min fino a 3.0.
      Nota: Raffreddare la centrifuga a 4 ° C durante questo tempo. Preparare il freddo S30 buffer come dettagliato nelle informazioni supplementari. Se il buffer di S30 è preparato in anticipo, è necessario garantire che il DTT non viene aggiunto fino al giorno di utilizzo.
    7. Una volta che il OD600 raggiunge 3.0 (Figura 2A), versare la cultura in una bottiglia fredda di centrifuga 1 L in un bagno di acqua e ghiaccio. Preparare una bottiglia piena d'acqua centrifuga di 1L di uguale peso per essere utilizzato come un equilibrio nella centrifuga.
      Nota: I valori di assorbanza variano da strumento a strumento. Mentre il OD600 del raccolto di BL21 (DE3) non è una variabile sensibile, è consigliabile che l'utente valutare e ottimizzare questa variabile come una misura di risoluzione dei problemi. Gli spettrofotometri più grandi possono causare letture di600 OD relativamente più basse rispetto al più piccoli basati su cuvetta spettrofotometri.
    8. Centrifugare le bottiglie di 1 L per 10 min a 5.000 x g e 10 ° C per agglomerare le cellule.
    9. Versare lentamente il surnatante e smaltirla secondo le procedure dei rifiuti biologici dell'istituzione. Mettere la pallina sul ghiaccio.
    10. Usando una spatola sterile, raschiare il pellet cellulare dalla bottiglia centrifuga e trasferirlo in una provetta conica da freddo 50 mL.
    11. Aggiungere 30 mL di tampone di S30 refrigerato a tubo conico e risospendere il pellet cellulare nel Vortex con raffiche brevi (20-30 s) e periodi di riposo (1 min) su ghiaccio fino a quando completamente risospese con senza blocchi.
    12. Una volta che il pellet è risospeso completamente, utilizzare un'altra provetta conica da 50 mL con acqua come un equilibrio e centrifugare per 10 min a 5000 x g e 10 ° C (pre-raffreddata a 4 ° C).
      Nota: Questo completa il 1st di 3 lavaggi necessari durante la raccolta delle cellule.
    13. Riversare il surnatante e smaltirla secondo le procedure dei rifiuti biologici dell'istituzione. Risospendere il pellet con 20-25 mL di freddo S30 tampone e centrifugare per 10 min a 5000 x g e 10 ° C (pre-raffreddata a 4 ° C).
      Nota: Questo completa la 2nd di 3 lavaggi.
    14. Ancora una volta, di riversare il surnatante e smaltirla secondo le procedure dei rifiuti biologici dell'istituzione. Aggiungere esattamente 30 mL di tampone di S30 e vortice nuovamente per risospendere il pellet.
    15. Utilizzando le 3 provette coniche da 50 mL pre-pesati, freddo e un riempitore di pipette sierologiche con una pipetta sterile, aliquota 10 mL di miscela di sedimento pellet/S30 buffer in ciascuna delle 3 provette coniche.
      Nota: Dividere le celle in 3 tubi non è necessaria, ma questo passaggio si traduce in piccole palline delle cellule (~ 1 g) per una maggiore comodità alle fasi successive.
    16. Tutte le provette da centrifuga, utilizzando appropriati Saldi come necessario, per 10 min a 5000 x g e 10 ° C (pre-raffreddata a 4 ° C).
      Nota: Questo completa la fase di lavaggio finale.
    17. Riversare il surnatante e smaltirla secondo le procedure dei rifiuti biologici dell'istituzione. Rimuovere il tampone in eccesso S30 pulendo accuratamente la parte interna del tubo conico e coperchio con un panno pulito; evitare di toccare il pellet.
    18. Ripesare i tubi su una bilancia analitica e registrare il peso finale della pallina su ogni tubo.
      Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto. Il pellet può essere flash congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C per fino a un anno fino a quando necessario per la preparazione di estratto.

2. greggio Cell Extract preparazione - giorno 4

  1. Per la preparazione di estratto, mantenere le cellule fredda su ghiaccio durante ogni passaggio. Aggiungere 1 mL di tampone di S30 refrigerato per 1 g di massa cellulare del pellet. Garantire che ditiotreitolo (DTT) è stato completato il buffer S30 per una concentrazione finale di 2 mM.
    Nota: Raffreddare il microcentrifuge a 4 ° C durante questo tempo.
  2. Risospendere il pellet cellulare nel Vortex con raffiche brevi (20-30 s) e periodi di riposo (1 min) su ghiaccio fino a quando completamente in sospensione. Se risospensione è difficile, è possibile lasciare il pellet in ghiaccio per 30 minuti scongelare.
  3. Trasferimento 1,4 mL di sedimento centrifuga cellule in una provetta da 1,5 mL microfuge.
  4. Collocare una provetta da 1,5 mL contenente 1,4 mL di sedimento centrifuga cellule in un bagno di ghiaccio d'acqua in un becher. Sonicare per 45 s su seguita da 59 s fuori per 3 cicli totali, con ampiezza fissato al 50%. Chiudere e invertire i tubi a mescolare delicatamente i periodi di fermo. In totale, è necessario consegnare 800-900 J di energia in ogni provetta di microfuge 1,5 mL contenente 1,4 mL di sedimento centrifuga cellule (Figura 3A e 3B).
    Nota: Questo passaggio è sensibile al tipo sonicatore e modello utilizzato e deve essere ottimizzato se l'apparecchiatura è diverso da quelli elencati per questa procedura. Due approcci complementari possono essere utilizzati per la quantità di estratto preparato durante questo passaggio la scalabilità: 1) più provette da 1,5 mL microfuge possono essere sonicate in parallelo, e/o 2) più grandi volumi possono essere sonicati in provette coniche (fino a 15 mL di risospensione delle cellule per tubo) , la quantità di energia fornita di scala come descritto in precedenza 29,45.
  5. Subito dopo sonicazione è completa, aggiungere 4,5 µ l di 1 M DTT (completando un'ulteriore 2 mM DTT) nell'1,4 mL di lisato e mescolare capovolgendo. Posizionare il tubo sul ghiaccio. Ripetere i passaggi da 2.4 e 2.5 per qualsiasi altre provette di sedimento cellule prima di procedere alla centrifugazione.
  6. Microcentrifuga campioni a 18.000 x g e a 4 ° C per 10 min (Figura 3).
  7. Dispensare il surnatante in una nuova provetta microfuge da 1,5 mL. Non disturbare il pellet; si consiglia di lasciare alcuni surnatante per mantenere la purezza di to perturbare il pellet negli sforzi per massimizzare il rendimento.
  8. Incubare il surnatante dal passaggio precedente a 250 giri/min e 37 ° C per 60 min registrando i tubi per la piattaforma d'agitazione dell'incubatore (questa è la reazione di deflusso).
  9. Microcentrifuga campioni a 10.000 x g e a 4 ° C per 10 min.
  10. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet e trasferirlo in un nuovo tubo. Creare molti aliquote di 100 µ l di estratto per deposito.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e l'estratto può essere flash congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C per fino a un anno fino a quando necessario per CFPS reazioni. Almeno 5 cicli di gelo-disgelo possono essere subiti senza detrimento per estrarre la produttività (Figura 4).

3. cell-Free proteina sintesi Batch formato reazioni

  1. Disgelo soluzioni un e B, DNA modello, BL21 (DE3) Estratto (se congelati), T7RNAP e un'aliquota di acqua di grado molecolare.
    Nota: Modello di reazione CFPS può essere trovato nelle Informazioni supplementari. Ricette di soluzioni A e B sono fornite le Informazioni supplementari e corrispondono a concentrazioni specifiche per numerosi reagenti sostenere il sistema di energia PANOx-SP basata per CFPS. Il ruolo di ciascun reagente e variazione accettabile in queste concentrazioni di reagente che può supportare CFPS sono stati determinati50. Un protocollo di purificazione di T7RNAP si trovano le informazioni supplementari51. T7RNAP supplementare può aumentare i rendimenti volumetrici ma non è necessario se T7RNAP è indotta durante la crescita delle cellule. Modello di DNA del plasmide (pJL1-sfGFP) può essere preparato utilizzando un kit di maxiprep con due lavaggi usando il tampone di lavaggio in kit, seguito da una post-elaborazione del DNA-pulitura utilizzando un kit di purificazione di PCR (Figura 2B). Modelli di DNA lineare utilizzabile anche nelle reazioni CFPS.
  2. Etichettare la quantità necessaria di microfuge tubi necessario per CFPS reazioni.
    Nota: Reazioni possono essere eseguite in vari formati di nave, ma una nave più piccola può ridurre i rendimenti volumetrici della proteina (Figura 2). La scalabilità di una reazione nella stessa nave di dimensioni può anche ridurre rendimenti volumetrici, in funzione della diminuzione lo scambio di ossigeno, a causa di una diminuzione della superficie in rapporto al volume. Quando si aumenta il volume di reazione sopra 100 μL, si consiglia di utilizzare il fondo piatto piatti ben 31,37,52.
  3. µ L di soluzione A 2,2, 2,1 µ l di soluzione B, 5 µ l di BL21*(DE3) Estratto, 0,24 μg di T7RNAP (16 concentrazione finale μg/mL), 0,24 ng della mascherina del DNA (concentrazione finale di 16 ng/mL) e acqua per portare il volume finale a 15 µ l.
    Nota: Vortex soluzioni A e B frequentemente durante l'installazione di reazione per evitare la sedimentazione dei componenti e garantire che ogni reazione riceve un'aliquota omogenea di ogni soluzione. Evitare nel Vortex l'estratto, invece capovolgere la provetta per mescolare.
  4. Dopo che tutti i reagenti sono stati aggiunti alla reazione, mescolare ogni tubo pipettando su e giù o delicatamente nel Vortex, garantendo nel contempo che la miscela di reazione finale è combinata in una singola perlina 15 µ l nella parte inferiore del tubo microfuge 1,5 mL.
  5. Posizionare ogni reazione in incubatore 37 ° C senza agitare per 4 h, o a 30 ° C durante la notte.
    Nota: Reazioni di successo possono essere qualitativamente valutate visivamente basata sul colore verde del prodotto sfGFP all'interno della miscela di reazione CFPS (Figura 3D). Espressione della proteina di interesse può essere confermata anche da SDS-PAGE (Supplemental figura 2).

4. quantificazione della proteina Reporter, [sfGFP]

  1. Caricare 48 µ l di 0,05 M HEPES, pH 8, in ogni bene necessario per la quantificazione (di solito eseguita in triplice copia per ogni provetta di reazione).
  2. Rimuovere le reazioni dall'incubatore. Pipettare su e giù per mescolare ogni reazione, quindi trasferire 2 µ l di reazione nel 48 µ l di 0,05 M HEPES, pH 8. Pipetta su e giù di nuovo nel pozzo per mescolare.
  3. Una volta che tutte le reazioni sono caricate e mescolate, inserire la piastra ben 96 il fluorimetro e misurare la fluorescenza di endpoint sfGFP.
    Nota: Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione per la quantificazione di fluorescenza di sfGFP sono 485 nm e 510 nm, rispettivamente.
  4. Utilizzando una curva standard generata in precedenza, determinare il [sfGFP] dalle letture fluorescenza ottenuti.
    Nota: Vengono fornite istruzioni per la generazione di una curva standard di concentrazione sfGFP contro l'intensità di fluorescenza in informazioni supplementari (complementare figura 3). Gli utenti dovranno stabilire una curva standard per il loro strumento, poiché possono variare la sensibilità dello strumento.

Risultati

Abbiamo presentato una base di sonicazione Escherichia coli Estratto protocollo di preparazione che può essere completato in un arco di quattro giorni, con Figura 1 dimostrando la ripartizione procedurale sopra ogni giorno. C'è malleabilità ai passaggi che possono essere completati in ogni giorno con vari punti di sospensione dell'esecuzione, ma abbiamo trovato questo flusso di lavoro per essere il più efficace eseguire. Inoltre, sia il pellet ce...

Discussione

Sintesi proteica senza cellula è emerso come una tecnologia potente e abilitazione per una varietà di applicazioni che vanno dalla bioproduzione di prototipazione rapida di sistemi biochimici. L'ampiezza delle applicazioni è supportato dalla capacità di monitorare, modificare e aumentare il macchinario cellulare in tempo reale. Nonostante l'impatto di espansione di questa tecnologia di piattaforma, è rimasto ampio adattamento lento a causa di sfumature tecniche nell'implementazione dei metodi. Grazie a questo sforzo...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di avere nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori si desidera ringraziare Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher e Tony Turretto per il supporto tecnico, Wesley Kao, Layne Williams e Christopher Hight per utili discussioni. Autori riconoscono anche finanziamento da Bill e Linda Frost Fund, centro per le applicazioni in Chevron biotecnologia applicata ricerca Endowment Grant di biotecnologia, Cal Poly ricerca, da studioso e Creative attività Grant Program (RSCA 2017), e la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL riconosce la California State University Graduate Grant. MCJ riconosce l'esercito ricerca ufficio W911NF-16-1-0372, National Science Foundation concede MCB-1413563 e MCB-1716766, l'Air Force Research laboratorio centro di eccellenza Grant FA8650-15-2-5518, la concessione di agenzia di difesa minaccia riduzione HDTRA1-15-10052/P00001, il David e Lucile Packard Foundation, il programma di Camille Dreyfus Teacher-Scholar, il dipartimento di energia BER Grant DE-SC0018249, il programma di scienza umana frontiere (RGP0015/2017), la concessione ETOP DOE Joint Genome Institute, e il Consorzio biomedica di Chicago con il sostegno dei fondi di Searle presso la comunità di Chicago Trust per il supporto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

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