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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Zusammenfassung

In den letzten 50 Jahren entstanden zellfreien Protein Synthese (GFP) als eine leistungsstarke Technologie, die transkriptionelle und translationale Kapazität von Zellen in einem Reagenzglas nutzbar zu machen. Durch die Notwendigkeit, die Lebensfähigkeit der Zelle vermieden und durch den Wegfall der zellulären Barriere wurde GFP grundlegend für neue Anwendungen in Biomanufacturing traditionell anspruchsvolle Proteine sowie Anwendungen im rapid Prototyping für Metabolic Engineering und funktionelle Genomik. Unsere Methoden für die Umsetzung einer E. Coli-basierten GFP-Plattform ermöglichen neue viele dieser Anwendungen Zugriff auf. Hier beschreiben wir Methoden um Extrakt durch angereicherte Medien, verblüfft Fläschchen und eine reproduzierbare Methode der einstellbaren Ultraschall-basierte Zelle Lysis vorzubereiten. Dieser Extrakt kann dann für Protein-Expression in der Lage 900 µg/mL oder mehr super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP) in nur 5 h vom Versuchsaufbau zur Datenanalyse, verwendet werden, angesichts der Tatsache, dass entsprechende Reagenz Bestände im Voraus vorbereitet worden sind. Voraussichtliche Inbetriebnahme kostet Reagenzien zu erhalten $4.500, die Tausende von Reaktionen mit geschätzten Kosten von $0,021 pro µg Protein produziert oder $0,019 pro Mikroliter Reaktion aufrechterhalten wird. Darüber hinaus spiegeln die Protein-Ausdruck-Methoden die Leichtigkeit der Reaktion Installation in marktübliche Systeme durch Optimierung des Reagenz Vormischungen, zu einem Bruchteil der Kosten gesehen. Damit den Benutzer die flexible Art der GFP-Plattform für breite Anwendungen nutzen kann, haben wir eine Vielzahl von Aspekten der Plattform identifiziert, die abgestimmt und je nach den verfügbaren Ressourcen und die Protein Ausdruck Ergebnisse optimiert werden können auf Wunsch.

Einleitung

Zellfreien Protein Synthese (GFP) hat eine Technologie entwickelt, die eine Reihe von neuen Möglichkeiten für die Proteinproduktion, funktionelle Genomik, metabolische Technik und mehr innerhalb der letzten 50 Jahre1,2freigeschaltet hat. Im Vergleich zu standard in Vivo Protein Ausdruck Plattformen, GFP bietet drei entscheidende Vorteile: 1) die zellfreie Natur der Plattform ermöglicht die Produktion von Proteinen, die potenziell toxischen oder die Zelle3,4 fremd wäre ,5,6; (2) Inaktivierung von genomischer DNA und die Einführung einer Vorlage DNA Kodierung der DNA des Interesses Kanal aller die systemische Energie in die Reaktion auf die Produktion von der Aktivit‰tderzur von Interesse; und 3) der offene Charakter der Plattform ermöglicht dem Benutzer, ändern und überwachen die Reaktionsbedingungen und Zusammensetzung in Echtzeit7,8. Dieser direkte Zugang zur Reaktion unterstützt die Vermehrung von biologischen Systemen mit erweiterten Chemikalien und Redox-Bedingungen für die Produktion von neuartigen Proteinen und der Abstimmung des metabolischen Prozesse2,9, 10. direkter Zugriff erlaubt auch dem Benutzer, die GFP-Reaktion mit Aktivität Assays in einem Single-Topf-System zu verbinden, für mehr Design-Build-Schnelltest11Zyklen. Die Kapazität die GFP-Reaktion in kleinen Tröpfchen oder auf Papier-basierten Geräten weiter unterstützt Hochdurchsatz-Entdeckung Bemühungen und rapid-Prototyping12,13,14,15 ,16. Durch diese Vorteile und die Plug & Play-Natur des Systems ist GFP hat eindeutig ermöglicht eine Vielzahl von Biotechnologieanwendungen wie die Produktion von Proteinen, die schwer zu Schwermetallspuren express- in Vivo17, 18,19,20, Erkennung der Krankheit21,22,23, auf Nachfrage Biomanufacturing18,24 ,25,26,27und Bildung28,29, die zeigen die Flexibilität und den Nutzen der zellfreien Plattform.

GFP-Systeme können aus einer Vielzahl von Rohöl Lysates von beiden prokaryotischen und eukaryotischen Zelle Linien erzeugt werden. Dies ermöglicht vielfältige Möglichkeiten in das System der Wahl, die jeweils vor- und Nachteile je nach Anwendung von Interesse haben. GFP-Systeme sind sehr unterschiedlich in Vorbereitungszeit, Kosten und Produktivität. Am meisten verwendet häufig Zelle, die Extrakte aus Weizenkeimen, Kaninchen Retikulozytenzahl und Insektenzellen Escherichia coli Zellen, wobei letztere die kostengünstigste bisher beim produzieren höchste volumetrische Erträge des Proteins30 hergestellt werden . Während andere GFP-Systeme für ihre angeborene Post-translationale Modifikation Maschinen vorteilhaft sein können, neue Anwendungen mithilfe der E. Coli-basierte Maschinen sind in der Lage, die Lücke durch die Generierung von ortspezifisch phosphorylierten und glykosylierten Proteinen auf Nachfrage31,32,33,34,35.

GFP-Reaktionen können in entweder Charge, kontinuierlichen Austausch zellfreie (CECF) oder kontinuierlichen Fluss zellfreie (CFCF) Formate ausgeführt werden. Das Batch-Format ist ein geschlossenes System, deren Reaktion Lebensdauer aufgrund der abnehmenden Mengen der Reaktionspartner und die Anhäufung von hemmenden Nebenprodukte der Reaktion beschränkt. CECF und CFCF Methoden erhöhen die Lebensdauer der Reaktion und damit höhere volumetrische Protein Renditen im Vergleich zu den Batch-Reaktion führen. Dies geschieht dadurch, dass die Nebenprodukte der Proteinsynthese den Reaktionsbehälter entfernt werden, während neue Reaktionspartner im Laufe der Reaktion2geliefert werden. Bei CFCF kann das Protein des Interesses auch aus der Reaktionskammer, während in CECF, das Protein des Interesses bleibt in der Reaktionskammer, bestehend aus einer halbdurchlässigen Membran36,37entfernt werden. Diese Methoden sind besonders wertvoll bei der Überwindung der schlechten volumetrische Erträge schwer Express Proteine des Interesses38,39,40,41,42, 43. Die Herausforderungen bei der Umsetzung der CECF und CFCF Ansätze sind, dass (1) während sie eine effizientere Nutzung der Bio-Maschinen verantwortlich für Transkription und Translation führen, benötigen sie vor allem größere Mengen an Reagenzien, die Gesamtkosten und 2 erhöht) Sie erfordern komplexere Reaktion Setups und spezialisierte Ausrüstung im Vergleich zu den Batch-Format-44. Um Barrierefreiheit für neue Benutzer zu gewährleisten, beschriebenen die Protokolle hier Fokus auf dem Batch-Format bei Reaktion Volumen von 15 µL mit konkreten Empfehlungen für die Erhöhung des Volumens der Reaktion auf die Milliliter-Skala.

Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen Laien mit grundlegenden Labor Fähigkeiten (z. B. Studenten) implementieren Zellwachstum, Vorbereitung zu extrahieren und batch-Format Reaktion Setup für eine E. Coli-basiertes GFP-System. Dieser Ansatz ist kostengünstig im Vergleich zu handelsüblichen Kits ohne Einbußen bei der Einfachheit der Installation Kit-basierte Reaktion. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz Anwendungen im Labor und im Feld. Bei der Entscheidung zur Umsetzung der GFP, sollten neue Benutzer die Wirksamkeit der konventionellen Protein Expressionssysteme für Start-up-Investitionen, gründlich auswerten, wie GFP möglicherweise nicht in jedem Fall überlegen. Die hier beschriebenen Methoden GFP ermöglichen dem Benutzer direkt implementieren eine Reihe von Anwendungen, einschließlich der funktionellen Genomik, Hochdurchsatz-Tests, die Produktion von Proteinen, die unlösbar für in Vivo Ausdruck sowie Feld Anwendungen, einschließlich Biosensoren und Bildungs-Kits für synthetische Biologie. Zusätzliche Anwendungen wie z. B. metabolische Technik, Abstimmung von Protein Ausdruck Bedingungen, Krankheit Erkennung, und skalieren mit CECF oder CFCF Methoden sind immer noch möglich, aber erfordern Erfahrung mit der GFP-Plattform für weitere Modifikation der Reaktion Bedingungen. Unsere Methoden kombinieren Wachstum in angereicherten Medien und ratlos Fläschchen mit relativ schnelle und reproduzierbare Methoden der Lyse der Zelle durch Beschallung, gefolgt von einem vereinfachten GFP Reaktion-Setup, das optimierte Vormischungen45nutzt. Während die Zellwachstum Methoden etwas in diesem Bereich standardisiert werden, unterschiedlich Methoden zur Lyse der Zelle. Gemeinsamen Lyse Methoden gehören neben Beschallung Auslastung der französischen Presse, ein Homogenisator, Wulst Schläger, oder Lysozym und anderen Störungen der biochemischen und physikalischen Methoden46,47,48, 49. mit unserer Methode, ca. 2 mL Rohöl Zelle Extrakt pro 1 L Zellen stammen. Diese Menge von Zelle-Extrakt unterstützen vierhundert 15 µL GFP Reaktionen, jedes produzierenden ~ 900 µg/mL Reporter SfGFP Eiweiß aus der Vorlage Plasmid pJL1-SfGFP. Diese Methode kostet $ 0,021/µg von SfGFP hergestellt ($.019/µL Reaktion), ausgenommen die Kosten für die Arbeit und Ausrüstung (ergänzende Abbildung1). Ausgehend von der Pike auf, diese Methode kann von einer einzelnen Person in 4 Tagen umgesetzt werden und wiederholen Sie GFP Reaktionen innerhalb von Stunden (Abbildung 1) abgeschlossen werden können. Darüber hinaus kann das Protokoll in Volumen für größere Chargen von Reagenz Vorbereitung entsprechend den Bedürfnissen des Benutzers skaliert. Wichtig ist, kann die hier vorgestellten Protokoll von Labor ausgebildete Laien wie Studenten, implementiert werden, wie es nur grundlegende Labor Fähigkeiten erfordert. Der nachstehend beschriebenen Verfahren und das dazugehörige Video wurden speziell entwickelt, um die Zugänglichkeit der E. Coli -GFP-Plattform für den breiten Einsatz zu verbessern.

Protokoll

(1) Media-Vorbereitung und Zellwachstum

  1. Tag1
    1. Streifen BL21*(DE3) E. Coli Zellen aus einem Glycerin auf eine LB-Agar-Platte auf Lager und mindestens 18 h bei 37 ° c inkubieren
    2. Bereiten Sie 50 mL LB Medien und Autoklaven die Lösung auf einem flüssigen Zyklus für 30 min bei 121 ° C. Bei Raumtemperatur lagern.
  2. Tag2
    1. Bereiten Sie 750 mL 2 X YTP Medien und 250 mL 0,4 M D-Glucose-Lösung, wie in die ergänzenden Informationen beschrieben.
    2. Gießen Sie 2 X YTP Medien in eine autoklaviert ratlos 2,5 L-Flasche und die D-Glucose-Lösung in einem Autoklaven 500 mL-Glasflasche. Autoklaven beide Lösungen auf einem flüssigen Zyklus für 30 min bei 121 ° C.
    3. Stellen Sie sicher, dass beide sterilen Lösungen bei 37 ° C gelagert werden, wenn am nächsten Tag, Wachstumsraten bei der Impfung zu maximieren Zellwachstum durchgeführt wird. Kombinieren Sie Lösungen nicht bis Inokulation.
      Hinweis: Lösungen können bei 4 ° C für 1-2-d bei Bedarf gespeichert werden, obwohl die 2 X YTP Medien sind sehr anfällig für Verschmutzung.
    4. Starten Sie eine Nacht Kultur des BL21(DE3) durch impfen 50 mL LB Medien mit einer einzigen Kolonie von BL21(DE3) mit einer sterilisierten Schleife und steriler Technik zur Vermeidung von Kontaminationen.
    5. Die 50 mL BL21*(DE3) LB Kultur in einem 37 ° C 250 u/min schütteln Inkubator und wachsen über Nacht für 15-18 Uhr.
    6. Vorbereiten und sterilisieren alle Tage 3 und 4, einschließlich der benötigten Materialien: zwei 1 L Zentrifuge Flaschen, 4 X kalt 50 mL konische Rohre (wiegen und Rekord Massen von drei) und viele 1,5 mL Microfuge Röhren.
  3. Tag3
    1. Entfernen Sie die 50 mL über Nacht Kultur der BL21*(DE3) in LB aus dem Schütteln Inkubator und messen die OD600 auf einem Spektrophotometer mit einer 01:10 Verdünnung mit LB Medien. Berechnen Sie das Volumen der Nacht Kultur notwendig, 1 L von Medien für einen Start OD600 von 0,1 hinzuzufügen (z. B. wenn ein OD600 eine 01:10 Verdünnung als 0,4 gelesen wird, impfen 25 mL der unverdünnten OD600 = 4.0 über Nacht Kultur in 1 L 2 X YTP (G).
    2. Entfernen Sie die erwärmten 2 X YTP Medien und D-Glucose-Lösungen aus dem Inkubator 37 ° C zusammen mit den 50 mL LB-Kultur. Gießen Sie mit steriler Technik, vorsichtig die D-Glucose-Lösung in den 2 X YTP Medien (Vermeidung von den Seiten des Kolbens ratlos).
      Hinweis: Zugabe von D-Glucose rundet das Rezept für 1 L 2 X YTPG.
    3. Beibehaltung sterilen Technik, impfen Sie die 1 L 2 X YTPG-Lösung mit der entsprechenden Menge an die 50 mL-Kultur um die 1 L-Kultur bei einer 0.1 OD600zu beginnen. Sofort setzen Sie die beimpften 1 L Kultur in einem 37 ° C Inkubator bei 200 u/min schütteln.
    4. Nehmen Sie die erste OD600 lesen nach der ersten Stunde des Wachstums (Lag-Phase typische dauert 1 h). Verdünnen Sie die Kultur nicht. Die Einnahme OD600 Messungen etwa alle 20-30 min bis OD600 0,6 erreicht.
    5. Beim erreichen von OD600 = 0,6, fügen Sie 1 mL 1 M IPTG (Endkonzentration in 1 L Kultur = 1 mM), 2 X YTPG-Kultur.
      Hinweis: Ideal Induktion OD600 ist 0,6; eine Reihe von 0,6-0,8 ist jedoch akzeptabel. Induktion mit IPTG ist für die körpereigene Produktion der T7 RNA-Polymerase (T7RNAP).
    6. Messen Sie nach Induktion die OD600 ca. alle 20-30 min bis 3.0 erreicht.
      Hinweis: Abkühlen der Zentrifuge auf 4 ° C während dieser Zeit. Bereiten Sie kalt S30 Puffer wie in den Zusatzinformationen. Wenn der S30-Puffer im Voraus vorbereitet ist, sicherzustellen Sie, dass DVB-t nicht bis zum Tag der Anwendung hinzugefügt wird.
    7. Sobald die OD600 3.0 (Abbildung 2A) erreicht, Gießen Sie die Kultur in eine kalte Flasche 1 L Zentrifuge in einer Eis-Wasserbad. Bereiten Sie eine wassergefüllte 1 L Zentrifuge Flasche gleich Gewicht als ein Gleichgewicht in der Zentrifuge verwendet werden.
      Hinweis: Absorption Werte variieren von Instrument zu Instrument. Während die OD600 der Ernte des BL21(DE3) keine sensible Variable ist, empfiehlt es sich, dass der Benutzer bewerten und optimieren diese Variable als Maßnahme zur Fehlerbehebung. Größere Spektralphotometer können in relativ niedriger OD600 Lesungen im Vergleich zu kleineren Küvette-basiertes Spektralphotometer führen.
    8. Zentrifugieren der 1 L-Flaschen für 10 min bei 5.000 x g und 10 ° C, pellet-Zellen.
    9. Gießen Sie langsam aus dem überstand und entsorgen es nach biologischen Abfällen Verfahren des Instituts. Legen Sie das Pellet auf Eis.
    10. Mit einem sterilen Spatel, kratzen Sie die Zelle Pellet aus der Zentrifuge Flasche und auf eine kalte 50 mL konische Rohr übertragen.
    11. Das konische Rohr 30 mL kalte S30 Puffer hinzu und Aufschwemmen der Zelle Pellet durch Vortexen mit kurzen Stößen (20-30 s) und Ruhezeiten (1 min) auf dem Eis bis voll mit keine Klumpen Nukleinsäuretablette.
    12. Sobald das Pellet vollständig Nukleinsäuretablette ist, verwenden Sie ein weiteres 50 mL konische Rohr mit Wasser als Ausgleich und Zentrifuge für 10 min bei 5000 x g und 10 ° C (bis 4 ° C vorgekühlt).
      Hinweis: Dies schließt die 1St 3 Waschgänge erforderlich, wenn die Zellen zu ernten.
    13. Gießen Sie den Überstand und entsorgen Sie es entsprechend der Institution biologischen Abfällen Verfahren. Aufzuwirbeln Sie das Pellet mit 20-25 mL kalte S30 Puffer und Zentrifuge für 10 min bei 5000 X g und 10 ° C (bis 4 ° C vorgekühlt).
      Hinweis: Dies schließt die 2Nd 3 Wäschen.
    14. Wieder, Gießen Sie überstand und entsorgen Sie es entsprechend der Institution biologischen Abfällen Verfahren. Hinzugeben Sie genau 30 mL S30 Puffer und Wirbel wieder an das Pellet Aufschwemmen.
    15. Mit Hilfe der 3 vorgewogene, kalten 50 mL konische Röhrchen und des Füllstoffes serologische Pipette mit einer sterilen Pipette, aliquoten 10 mL der resuspendierte Pellet/S30 Puffer Mischung in jedes der 3 konische Rohre.
      Hinweis: Die Teilung der Zellen in 3 Röhren ist nicht erforderlich, aber dieser Schritt führt zu kleineren Zelle Pellets (~ 1 g) für mehr Komfort in späteren Schritten.
    16. Zentrifugieren Sie alle Röhren, mit entsprechenden Salden Bedarf für 10 min bei 5000 x g und 10 ° C (vorgekühlt auf 4 ° C).
      Hinweis: Damit ist der letzten Waschschritt abgeschlossen.
    17. Gießen Sie den Überstand und entsorgen Sie es entsprechend der Institution biologischen Abfällen Verfahren. Entfernen Sie die überschüssige S30-Puffer durch das Innere der konische Rohr und Verschluss mit einem sauberen Tuch sorgfältig abwischen; Berühren Sie das Pellet.
    18. Die Röhren auf einer Analysenwaage Vakuumtrockenschrank und nehmen die endgültige Pellet Gewicht auf jedes Rohr.
      Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Die Pellets können Flash-werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zu einem Jahr bis für Extrakt Vorbereitung erforderlich gespeichert.

(2) grobe Zelle extrahieren Vorbereitung - Tag 4

  1. Vorbereitung der Extrakt halten Sie Zellen kalt auf dem Eis bei jedem Schritt. Fügen Sie 1 mL kalte S30 Puffer pro 1 g Zellmasse des Pelletofens. Sicherzustellen Sie, dass diese Dithiothreitol (DTT) auf den Puffer, S30, eine Endkonzentration von 2 mM ergänzt wurde.
    Hinweis: Abkühlen der Microcentrifuge bis 4 ° C während dieser Zeit.
  2. Aufschwemmen der Zelle Pellet durch Vortexen mit kurzen Stößen (20-30 s) und Ruhezeiten (1 min) auf dem Eis bis voll Nukleinsäuretablette. Wenn Wiederfreisetzung schwierig ist, lassen Sie die Pellets für 30 min zum Auftauen auf Eis.
  3. Übertragen Sie 1,4 mL der resuspendierte Zellen in einem 1,5 mL Microfuge Rohr.
  4. Legen Sie eine 1,5 mL Tube mit 1,4 mL der resuspendierte Zellen in ein Eis-Wasserbad in ein Becherglas. Beschallen für 45 s auf gefolgt von 59 s aus 3 insgesamt Zyklen mit Amplitude auf 50 % eingestellt. Schließen und die Röhrchen vorsichtig mischen aus Zeiten zu invertieren. Insgesamt liefern Sie 800-900 J Energie an jede 1,5 mL Microfuge Röhre mit 1,4 mL der resuspendierte Zellen (Abb. 3A und 3 b).
    Hinweis: Dieser Schritt ist empfindlich gegenüber der Sonikator Typ und Modell verwendet und sollten optimiert werden, wenn Geräte anders als für dieses Verfahren aufgeführt ist. Zwei sich ergänzende Ansätze können verwendet werden, um Scale-up-die Menge an Extrakt bei diesem Schritt vorbereitet: (1) mehrere 1,5 mL Microfuge Rohre parallel beschallt werden können und/oder (2) größere Mengen in konischen Rohren beschallt werden können (bis zu 15 mL Zelle Wiederfreisetzung pro Rohr) , wie oben beschrieben Skalierung der gelieferten Energiemenge, 29,45.
  5. Unmittelbar nach Beschallung abgeschlossen ist, fügen Sie 4,5 µL 1 m (zur Ergänzung einer zusätzliche 2 mM DVB-t) DVB-t in der 1,4 mL lysate und invertieren Sie mehrmals zu mischen. Platzieren Sie das Rohr auf dem Eis. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für jede zusätzliche Rohre der resuspendierte Zellen vor der Zentrifugation.
  6. Microcentrifuge Proben bei 18.000 x g und 4 ° C für 10 min (Abbildung 3).
  7. Pipette des Überstands in ein neues 1,5 mL Microfuge Rohr. Stören Sie das Pellet nicht; Es empfiehlt sich, einige überstand hinterlassen weiterhin Reinheit als zu stören das Pellet in Bemühungen um die Rendite zu maximieren.
  8. Inkubieren Sie überstand aus dem vorherigen Schritt auf 250 u/min und 37 ° C für 60 min durch Abkleben der Rohre, die schütteln Plattform des Inkubators (Dies ist der Abfluss-Reaktion).
  9. Microcentrifuge Proben bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 Minuten.
  10. Den Überstand zu entfernen, ohne zu stören das Pellet und überträgt es auf einen neuen Schlauch. Viele 100 µL-Aliquots der Extrakt für die Lagerung zu schaffen.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten kann, und des Extrakts flash, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zu einem Jahr bis zur GFP Reaktionen benötigt gespeichert. Mindestens 5 Gefrier-Tau-Zyklen können ohne Beeinträchtigung der Produktivität (Abbildung 4) extrahieren absolviert werden.

(3) zellfreien Protein Synthesereaktionen Batch-Format

  1. Tauen Sie Lösungen A und B, DNA-Vorlage BL21(DE3) Extrakt (wenn gefroren), T7RNAP und ein Aliquot der molekularen Grade Wasser auf.
    Hinweis: GFP Reaktion Vorlage finden Sie in den Zusatzinformationen. Lösungen A und B Rezepte werden in den Zusatzinformationen zur Verfügung gestellt und entsprechen bestimmten Konzentrationen für zahlreiche Reagenzien, PANOx-SP-basierte Energiesystem für GFP zu unterstützen. Die Rolle der einzelnen Reagenz und akzeptable Variation in diesen Reagenz-Konzentrationen, die GFP unterstützen kann schon bestimmt50. Ein T7RNAP-Reinigung-Protokoll finden Sie in den Zusatzinformationen51. Ergänzende T7RNAP volumetrische Erträge zu steigern, aber ist nicht erforderlich, wenn T7RNAP beim Zellwachstum induziert wird. Plasmid DNA Schablone (pJL1-SfGFP) kann mit einem Maxiprep-Kit mit zwei Wäschen mit dem Waschpuffer im Kit, gefolgt von einer Nachbearbeitung DNA-Bereinigung mit einem PCR-Reinigung-Kit (Abb. 2 b) vorbereitet werden. Lineare DNA-Vorlagen können auch im GFP Reaktionen verwendet werden.
  2. Beschriften Sie die notwendige Menge an Microfuge Rohre für GFP Reaktionen benötigt.
    Hinweis: Reaktionen in verschiedenen Schiffsgrößen durchgeführt werden können, aber ein kleineres Schiff kann volumetrische Protein Erträge (Abbildung 2) verringern. Skalierung bis eine Reaktion in der gleichen Größe Gefäß kann auch volumetrische Erträge als Funktion der Verringerung der Sauerstoffaustausch auf einen Rückgang der Fläche zum Volumenverhältnis reduzieren. Wenn über 100 μl Reaktionsvolumen zu erhöhen, empfiehlt es sich, flachen Boden well-Platten 31,37,52zu verwenden.
  3. Fügen Sie 2.2 µL der Lösung A, 2.1 µL Lösung B, 5 µL BL21*(DE3) extrahieren, 0,24 μg des T7RNAP (16 μg/mL Endkonzentration), 0,24 ng DNA Schablone (16 ng/mL Endkonzentration) und Wasser 15 µL Endvolumen bringen.
    Hinweis: Vortex Lösungen A und B häufig während des Setups Reaktion zur Sedimentation der Bauteile zu vermeiden und sicherzustellen, dass jede Reaktion eine homogene Aliquot der jeweiligen Lösung erhält. Vermeiden Sie Aufschütteln der Extrakt, stattdessen Invertieren der Röhre zu mischen.
  4. Nachdem alle Reagenzien zur Reaktion hinzugefügt wurden, mischen Sie jedes Rohr durch Pipettieren rauf und runter oder sanft aufschütteln gleichzeitig sicherzustellen, dass die endgültige Reaktionsgemisch in einen einzigen 15 µL Wulst am unteren Rand der 1,5 mL Microfuge Tube kombiniert wird.
  5. Stellen Sie jede Reaktion in den Inkubator 37 ° C, ohne Zittern für 4 h oder 30 ° C über Nacht.
    Hinweis: Erfolgreiche Reaktionen können qualitativ optisch basierend auf die grüne Farbe des SfGFP Produkts innerhalb der GFP Reaktionsgemisch (Abbildung 3D) beurteilt werden. Expression des Proteins des Interesses kann auch durch SDS-PAGE (ergänzende Abbildung2) bestätigt werden.

(4) Quantifizierung der Reporter Protein, [SfGFP]

  1. Laden Sie 48 µL von 0,05 M HEPES, pH 8, in jeder gut zur Quantifizierung (in der Regel in dreifacher Ausfertigung pro Reaktionsgefäß durchgeführt).
  2. Reaktionen aus Inkubator zu entfernen. Pipette rauf und runter um jede Reaktion zu mischen, dann 2 µL der Reaktion in den 48 µL von 0,05 M HEPES, pH 8 übertragen. Pipettieren oben und unten wieder in den Brunnen zu mischen.
  3. Sobald alle Reaktionen geladen und vermischt sind, legen Sie die 96-well-Platte in den Fluorometer und Messen Sie die SfGFP Endpunkt Fluoreszenz.
    Hinweis: Anregung und Emission Wellenlängen für SfGFP Fluoreszenz Quantifizierung sind 485 nm und 510 nm, beziehungsweise.
  4. Anhand einer zuvor generierten Standardkurve fest [SfGFP] aus den erhaltenen Fluoreszenz-Lesungen.
    Hinweis: Anweisungen zum Generieren einer Standardkurve SfGFP Konzentration im Vergleich zu Fluoreszenzintensität sind in Zusatzinformationen (ergänzende Abbildung 3) ausgestattet. Benutzer müssen eine Standardkurve für ihr Instrument zu etablieren, da Instrument Sensibilität variieren.

Ergebnisse

Wir haben ein Ultraschall-basierte E. Coli Extrakt präsentiert Vorbereitung-Protokoll, das über einen Zeitraum von vier Tagen mit Abbildung 1 zeigt die verfahrensrechtliche Aufschlüsselung über jeden Tag abgeschlossen werden kann. Gibt es Formbarkeit zu den Schritten, die jeden Tag mit verschiedenen anhalten Punkten abgeschlossen werden können, aber wir haben festgestellt, dass dieses Workflows, die effektivste ausgeführt werden. Darüber hinau...

Diskussion

Zellfreie Proteinsynthese ist eine leistungsfähige und förderlichen Technologie für eine Vielzahl von Anwendungen von Biomanufacturing bis hin zu rapid Prototyping von biochemischen Systemen entstanden. Die Bandbreite der Anwendungen stützt sich auf die Fähigkeit zu überwachen, zu manipulieren und zellulären Maschinerie in Echtzeit zu erweitern. Trotz der wachsenden Auswirkungen dieser Plattform-Technologie, breiten Anpassung blieb langsam durch technische Feinheiten bei der Umsetzung der Methoden. Durch diese Bem...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.

Danksagungen

Autoren möchten Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, und Tony Turretto für den technischen Support, Wesley Kao, Layne Williams und Christopher Hight für hilfreiche Diskussionen anerkennen. Autoren erkennen auch finanzielle Unterstützung von Bill und Linda Frost Fonds, Zentrum für Anwendungen in der Biotechnologie Chevron Biotechnologie angewendet Endowment Forschungsstipendium, Cal Poly Forschung Scholarly und kreative Aktivitäten Grant Program (RSCA 2017), und die National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkennt an der California State University Graduate Grant. MCJ der Army Research Office W911NF-16-1-0372 anerkennt, National Science Foundation gewährt, MCB 1413563 MCB-1716766 und der Luftwaffe Forschung Labor Center of Excellence Grant FA8650-15-2-5518, die Verteidigung Bedrohung Reduktion Agentur Grant HDTRA1-15-10052/P00001, der David and Lucile Packard Foundation, die Camille Dreyfus Lehrer-Scholar Program, die Abteilung von Energie BER Grant DE-SC0018249, die menschliche Frontiers Science Program (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant, und das Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust für Unterstützung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

Referenzen

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