שימוש במיקרו מערכים לחקור השפעה מיקרוסביבתית על פנוטיפים סלולריים בסרטן

Summary

מטרת השיטה המוצגת כאן היא להראות כיצד מיקרומערכים מיקרואקולוגיה (MEMA) ניתן לזייף ולהשתמש כדי לחקור את ההשפעה של אלפי קומבינטורית מיקרו סביבות פשוטות על הפנוטיפ של תאים מתורבתים.

Abstract

הבנת ההשפעה של המיקרוסביבה על הפנוטיפ של התאים היא בעיה קשה בשל התערובת המורכבת של שני גורמי גדילה מסיסים וחלבונים הקשורים מטריקס ב מיקרוסביבה ב vivo. יתר על כן, ריאגנטים זמין עבור מידול של מיקרו סביבות בתוך החוץ בדרך כלל לנצל תערובות מורכבות של חלבונים כי הם מוגדרים לחלוטין וסובלים אצווה להשתנות אצווה. פלטפורמת המיקרו-מיקרו של הסביבה (MEMA) מאפשרת הערכה של אלפי שילובים פשוטים של חלבונים מיקרוסביבתיים להשפעה שלהם על הפנוטיפים הסלולריים בתוך שיטת יחיד. MEMAs מוכנים צלחות היטב, אשר מאפשר תוספת של ליגונים בודדים להפריד בארות המכילות מטריקס מוליכי הרכב (ECM) חלבונים. השילוב של הליטרים מסיסים עם כל ECM מודפס יוצר שילוב ייחודי. שיטת MEMA טיפוסית מכילה יותר מ-2,500 מיקרוסביבות קומבינטורית ייחודיות שתאים חשופים אליהם בתוך שיטת יחיד. כמקרה מבחן, סרטן השד התאים קו MCF7 היה מצופה על פלטפורמת MEMA. ניתוח זה מזוהה גורמים שניהם לשפר ולעכב את הצמיחה והתפשטות של תאים אלה. פלטפורמת MEMA היא גמישה מאוד והוא יכול להיות מורחב לשימוש עם שאלות ביולוגיות אחרות מעבר למחקר הסרטן.

Introduction

Culturing של שורות תאים סרטניים על פלסטיק דו מימדי (2D) monolayers נשאר אחד הסוסים העיקריים עבודה עבור חוקרי סרטן. עם זאת, המיקרו-סביבה מוכרת יותר ויותר בשל יכולתה להשפיע על פנוטיפים סלולריים. בסרטן, מיקרוסביבה הגידול ידוע להשפיע על התנהגויות סלולר מרובות, כולל צמיחה, הישרדות, פלישה, ותגובה לטיפול^1,2. תרביות תאים מסורתיים בדרך כלל חוסר השפעות מיקרו הסביבה, אשר הובילה לפיתוח של מורכב יותר תלת-מימדי (3d) בחני לגדול תאים, כולל מסחרית זמין מרתף מטוהרים מתחת תמציות קרום. עם זאת, אלה מטריצות מטוהרים הם בדרך כלל מורכבים להשתמש וסובלים מבעיות טכניות כגון השתנות אצווה³ וקומפוזיציות מורכבות³. כתוצאה מכך, זה יכול להיות קשה להקצות פונקציה חלבונים ספציפיים שעשויים להשפיע על פנוטיפים סלולריים³.

כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו את הטכנולוגיה microenvironment מיקרו-הסביבה (mema), אשר מפחית את המיקרו-סביבה עד שילובים פשוטים של מטריקס מטריצה (ecm) ומסיס גורם צמיחה חלבונים^4,5 . פלטפורמת MEMA מאפשרת זיהוי של גורמים מיקרוסביבתיים דומיננטי המשפיעים על התנהגות של תאים. באמצעות תבנית מערך, ניתן לקבל בניסוי אחד אלפי שילובים של גורמי מיקרו-סביבה. MEMA תיאר כאן חוקר שערים ~ 2,500 שונים בתנאים מיקרו סביבה ייחודית. חלבונים מסוג ECM המודפסים בלוחות הגידול של הטופס שעליהם יכולים להיות מתורבתים. ליגפות מסיסים מתווספים לבארות בודדות, ויוצרות קומבינטורית מיקרו-סביבות ייחודיות (ECM + ligands) בכל נקודה שונה אליה נחשפים התאים. תאים הם מתורבתים במשך מספר ימים, לאחר מכן קבוע, מוכתם, והתמונה כדי להעריך פנוטיפים הסלולר כתוצאה של חשיפה אלה שילובים ספציפיים מיקרו הסביבה. מאז המיקרוסביבות הם שילובים פשוטים, זה פשוט לזהות חלבונים כי כונן שינויים פנוטימית עיקריים בתאים. Memas השתמשו בהצלחה כדי לזהות גורמים המשפיעים על מספר פנוטיפים סלולריים, כולל אלה כי כונן החלטות הגורל תא תגובה לטיפול^4,5,6,7. תגובות אלה ניתן לאמת בניסויים 2D פשוטים ולאחר מכן ניתן להעריך בתנאים כי יותר לכידה מלאה של המורכבות של מיקרוסביבה הגידול. פלטפורמת MEMA היא להתאים מאוד למגוון של סוגי תאים ונקודות קצה, בתנאי כי בסמנים פנוטיפים טובים זמינים.

Protocol

הערה: מבט כולל על תהליך MEMA כולו, כולל זמן משוער, מתואר בדיאגרמת הזרימה המוצגת באיור 1. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של MEMAs בצלחות בנות 8. הפרוטוקול עשוי להיות מותאם עבור לוחות אחרים או שקופיות.

1. הכנת מאגרי חלבונים, מדלל וכתמים

1. מבחנות של ECMs, ליגניות, ו ציטוקינים לטמפרטורת החדר (RT) ובקצרה צנטריפוגה. הוסף את הנפח המתאים של מאגר ה-RT המתאים כפי שמצוין בגליון הנתונים של המוצר. בצע את המלצת היצרן עבור ריכוזי מניות.
   הערה: רשימה מלאה של ליגנדס ו ECMs עם המניות שלהם וריכוזי הסופי ניתנים בטבלה 1 ושולחן 2. הן ליגנדס והן ECMs משמשות בדרך כלל בריכוז הגבוה ביותר של הטווח המומלץ על ידי היצרן, אשר מעורר את ההשפעה הביולוגית שלו בתקן 2 יום התרבות. מטפלים בחלבונים בעדינות ובארונות ביו-בטיחות בזרימה שכבתית כדי למנוע זיהום.
2. דגירה מבחנות עם נדנדה עדין ב-RT עבור 1 h. לא מערבולת חלבונים כמו זה יכול לגרום להם להספרות.
3. מחלקים חלבונים עבור אחסון לטווח ארוך כך כל aliquot הם שימוש יחיד רק כדי למנוע השפלה עם חוזר הקפאה/הפשרה מחזורי. מאחסנים חלבונים ב-80 ° צ' (אלא אם צוין אחרת) עד לצורך. דאג לאסוף את כל המטא-נתונים לעיון עתידי, כגון: (i) שם חלבון, (ii) תאריך מוכן, (iii) הרבה/אצווה מספר, (iv) הספק, (v) מספר קטלוג, (vi) ריכוז, (vii) נפח, ו (viii) הכנה.
4. הכנת מאגר דילול המכיל 20% (v/v) גליצרול, 10 מ"מ EDTA, 200 mM טריס-HCl, pH 7.2, ומסנן לעקר. שמור על מאגר זה סטרילי ואחסן ב-RT.
5. הכנת מאגר כתמים המכיל 2% (w/v) BSA, 1 מ"מ MgCl₂, ו 0.02% נאן₃ בתמיסת מלח פוספט באגירה (PBS). לסנן ולאחסן ב-4 ° c.

2. הכנת לוח מקור ECM

1. הסר מניות מצוטט של חלבונים ECM להיות מודפס ולהפשיר על הקרח. הקלט את כל המספרים הרבים עבור מעקב אחר מטא-נתונים.
2. קפיצי צינורות של חלבונים המופשטים בעדינות כדי להבטיח resuspension נכונה ספין למטה בצנטריפוגה.
3. הפוך תערובות ECM הדפסה (EPMs) ו פלורסנט fiducial לשמש על ידי רובוט טיפול נוזלי שתיצור את הצלחות אקראי 384-ובכן מקור.
   הערה: לוחות המקור של 384-והטוב ישמשו מדפסת מערך של סיכת מגע כדי ליצור את המערכים המודפסים ב-8 לוחות הבאר.
   1. תווית 1.5 mL לצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור כל EPM והfiducial.
   2. הכן כל EPM על ידי שילוב 125 μL של מאגר דילול (ראה שלב 1.4) עם הנפח המתאים של מלאי ECM ולהביא את התערובת עד נפח כולל של 250 μL עם PBS. הריכוזים הסופיים בכל צינור EPM יהיה 1 x ECM חלבון, 5 מ"מ EDTA, 10% גליצרול, ו 100 mM טריס.
   3. הכן fiducial פלורסנט על ידי המסת אותו במאגר המתאים שצוין על ידי היצרן והעבר 250 μL לשפופרת fiducial מתויג.

3. יצירת לוח המקור באמצעות מטפל נוזלי

1. עיצוב לוח 384-ובכן, המתאר את המיקומים של ה-ECMs וממוטב לשימוש בראש סיכת המדפסת המשמש כמערך. עצב את מיקום הfiducial כך שהוא יודפס בשורה 1, עמודה 1 מיקום כל טוב כדי לסייע בכיוון מערך.
   הערה: סך של 14/15 שכפול של כל ECM משמשים להבטחת נתונים חזקים. כלול משכפל נוסף של קולגן או ECM אחרת התשואות חזקה להערכת אחידות של הכריכה. ייתכן שהפריסה תצטרך לנצל מספר 384-הצלחות מרובות בהתאם למספר ה-ECMs של הריבית.
2. העבר צינורות EPM למטפל נוזלי, שמירה על צינורות ב -4 ° c או עם מתלה צינור מקורר או באמצעות רובוט טיפול נוזלי הממוקם בחדר קר.
3. באמצעות התוכנה של המטפל נוזל, להפעיל תוכנית להעביר 15 μL של כל EPM ואת fiducial לבארות מראש בתוך לוחית מקור 384-היטב (s).
4. Pipet PBS לתוך בארות לא מנוצל כדי להגביר את הלחות והשמירה מפני התייבשות במהלך תהליך ההדפסה.
   הערה: ראה איור 2 לדוגמה מערכת לוחית מקור 384-היטב הממוטב עבור 4 x 7 פינים הראש וכולל קולגן אני לחסום ו PBS.
5. לסגור את הצלחות ולשמור ב 4 ° צ' עד מוכן להדפסה.

4. הדפסת MEMAs באמצעות רובוט מערך הדפסה

הערה: החלק הבא של הפרוטוקול מתאר במפורש את ההכנה והשימוש של MEMA כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים מיקרוסביבתיים שונים על הצמיחה והתפשטות של תאים MCF7. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לשימוש בליפסים שונים, ECMs ותאים ללימוד קווי תאים אחרים ונקודות קצה של ריבית.

1. באמצעות מדפסת סיכות מגע, הדפס EPMs ו fiducial כתמים לתוך 8 צלחות היטב. הדפס שכפול מרובים של כל תנאי ECM כדי להבטיח את התוכונות.
   הערה: ניתן להשתמש בתבניות לוח או שקופיות אחרות להדפסה, אך ייתכן שיהיה צורך במיטוב מאגר כדי להשיג היווצרות ספוט אופטימלי.
   1. הדפס את ה-ecms עבור mema באמצעות פינים בקוטר 350 יקרומטר המסודרים בתצורת ראש הדפסה של 4 x 7. הדפס את המערכים בלוחות של 8-היטב כמו 20 עמודות על-ידי 35 שורות, עבור סך של ~ 700 נקודות. מערכים גדולים יותר אפשריים בצלחות אלה, אך באים עם הסחר-off של השפעות קצה מוגבר הן כריכת תאים וכתמים.
2. לאחר הדפסה, לאחסן צלחות desiccator לפחות 3 ימים לפני השימוש.

5. יצירת צלחות ליגוטיפול

1. עיצוב לוח 96-ובכן, כולל ליגניות של עניין. כדי להקל על הטיפול של צלחות MEMA רבים בבת אחת, לעצב את הצלחת הזאת עם מרווח המאפשר שימוש של מרובת ערוצים pipet עם 4 טיפים במרווחים כדי להעביר נוזלים בין הבארות של 8-טוב Mema וצלחת 96-באר.
   הערה: בפרוטוקול זה, משתמשים בערכה המלאה של ליגניות המפורטות בטבלה 2 .
2. . להפשיר ליגנדס על קרח קפיצי בקצרה וסובב כל צינור.
3. השתמש במאגר המומלץ של היצרן (בדרך כלל PBS) כדי לדלל מלאי של 200x.
4. Pipet 10 μL של כל 200x ליטר ומלאי לתוך הטוב המתאים בתוך הצלחת 96-באר.
5. הרכב לוחות החותם והחנות ב-20 ° c.
   הערה: להפוך לוחיות טיפול לחות בקבוצות, לכידת כל המטא-נתונים עבור ניתוח במורד הזרם.

6. תאים culturing על MEMAs

1. לחסום MEMAs עבור 20 דקות עם 2 מ ל לכל היותר של מאגר חסימה ללא התפסות המכיל 1% שאינם מפוסות סוכן חסימה (טבלת חומרים) במים כפולים מזוקקים (ddh₂O).
2. ומשלש בארות שוטפים. עם הערוץ הPBS כדי למנוע התייבשות, השאר את הנפח הסופי של PBS בבארות עד שמוכן לציפוי תאים.
   הערה: זה מאוד מועיל יש שני עובדי ספסל עבור שלבי תרבות התא על MEMAs. אחד מעובדי הספסל יכול לבצע שלבי השאיפה, ואילו השני מבצע צעדים בתוספת. מומלץ להשתמש 1 מ"ל pipet רב-ערוצי עם טיפים במרווחים כדי להתאים את הצלחת 8-הבאר עבור ליטוף ו-מפצל Y עם שני פיפטות פסטר לפתי בארות מרובות בבת אחת.
3. זרע 2 x 10⁵ MCF7 תאים לכל טוב ב 2 מ ל של דולבקה שונה של הנשר הבינוני (dmem דיום) בינונית המכילה 10% סרום העוברי (fbs).
   הערה: לפני ניסוי MEMA מלא, לבצע ניסוי טיטור תא כדי למטב את מספרי התאים כגון מקומות MEMA יש מספרי תאים גבוהים (אבל הם לא שוטפת) בסוף המשך הניסיוני הרצוי.
4. לאחר 2-18 שעות של הדבקה, מפחית בינונית ולהחליף עם 2 מ ל של בינונית צמיחה מופחתת (DMEM עם 0.1% FBS).
   הערה: סרום מופחת (למשל, 0.1% FBS) או גורם גדילה-תנאים מופחתים ניתן להשתמש בשלב זה כדי לבודד את ההשפעה מגירוי של ליגניות ספציפיות.
5. . להפשיר צלחת ליגוטיפול בקרח צנטריפוגה הופלה את הצלחת ב 200 x g עבור 1 דקות.
6. העברת 200 μL של בינוני מכל באר בלוח התרבות לבאר המתאים בצלחת הטיפול. Pipet למעלה ולמטה כדי לערבב נפח עם בינוני ולהעביר את התערובת בחזרה היטב המתאים בצלחת MEMA.
7. להקל על הרוק ביד ולהחזיר את לוחיות MEMA לחממה. תרבות למשך הניסוי בנוכחות שילוב ligand/ECM ב 37 ° c ו-5% CO₂.
   הערה: ניסוי MEMA טיפוסי פועל עבור 72 h; ניסויים משך זמן ארוך עשויים לדרוש החלפת בינונית וטיפול מחדש עם ligand.
8. דופק MEMA וולס ב 71 h עם 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) לריכוז הסופי של 10 μM. דגירה בתנאים ניסיוניים עם EdU עבור 1 h ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
   הערה: בשלב זה ניתן להשתמש גם בטיפולי תאים חיים אחרים.

7. תיקון וצביעת MEMAs

1. לאחר 72 h וכל טיפולי תאים חיים, מנושמים בארות. תקן MEMAs ב 2 מ ל לכל טוב של 2% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) עבור 15 דקות at RT.
2. . מתיף את הכדורגלן החדירות עם 2 מ ל לבאר של 0.1% nonionic החומרים עבור 15 דקות.
3. ולשטוף עם 2 מ ל לכל טוב של PBS. . שמתי את הערוץ לשטוף עם 2 מ ל של PBS עם 0.05% polysorbate 20 (PBS-T).
   הערה: המשטח MEMA הוא הידרופובי, וכישלון לשטוף עם PBS-T לפני דגירה הכתם נוגדן יגרום להיווצרות חללים בבארות במהלך שלבי הדגירה ולתת היווצרות חפצי הצביעת.
4. . מנושף את הPBS-טי הוסף את התגובה של EdU לגילוי ריאגנטים. הגנה מפני 1 h ב RT, נדנדה ומוגן מפני אור. אחרי 1 h הדגירה, תגובת כיבוי עם מאגר כיבוי מסחרי סיפק.
   הערה: EdU שלבים לזיהוי וכתמים/נוגדנים עשויים להתבצע ב-1.5 mL לכל טוב כדי להפחית את העלות.
5. ולשטוף עם PBS-T לפני הדגירה עם כתמים או נוגדנים.
6. מודדת mema בארות עם נוגדנים נגד היסטון H3K9me3 (1:1000) ו fibrillarin (1:400) במאגר מכתים המכיל 2% (w/v) סרום פרה אלבומין (bsa), 1 מ"מ mgcl₂ ו 0.02% נאן₃ לילה ב 4 ° c.
   הערה: ביצוע החדירות נוגדן כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים לפני השימוש בהם על ערכת MEMA מלא.
7. לאחר הנוגדן העיקרי או הדגירה כתם, לשטוף את הבארות 2x עם PBS ופעם עם PBS-T.
8. הוסף נוגדנים משניים (חמור אנטי עכבר IgG וחמור אנטי ארנב IgG, שניהם 1:300) ו 0.5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ פניינילידול (DAPI). . בסדר.
9. לשטוף את הבארות 2x עם 2 מ ל עבור כל טוב של PBS, להשאיר אותם בגמר 2 mL PBS.
10. להמשיך להדמיה או לאחסן MEMAs מוכתם להדמיה מאוחר יותר ב-PBS ב-4 ° צ' מוגן מפני אור.

8. הדמיה של MEMAs

1. תמונה MEMA במערכת הדמיה אוטומטית עם ערוצים מתאימים לזיהוי פלורסנט.
2. פלט נתוני תמונה שהתקבלו למערכת ניהול תמונות. פלח תאים וחשב רמות אינטנסיביות באמצעות CellProfiler⁸.

9. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח נתונים מורכב מנורמליזציה, תיקון וריאציה וסיכום של הנתונים הנגזרים מחברת CellProfiler הגולמית. במקרה זה, הסביבה R עם קוד מותאם אישית משמשת לביצוע כל השלבים. עם זאת, כל סביבה או תוכנית תוכנה סטטיסטית יכולים להיות מנוצלים כדי לבצע את הפעולות המקבילות. דוגמה לקוד המותאם אישית של המקור הפתוח עבור הסביבה R לניתוח זמינה ב: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. לעבד מראש ולנרמל את נתוני התמונה מקוטע.
2. קבע ספירת תאי ספוט תוך שימוש בגרעינים המוכתמים של DAPI.
3. עוצמת שער אוטומטי EdU כדי לתייג תאים כ-EdU⁺. מדידת התפשטות באמצעות הפרופורציה של EdU⁺ תאים בכל נקודה.
4. חציון מסכם כתמים cytoplasmic ומדידות המבנה הגרעיני ברמת ספוט.
5. בצע הסרה של נורמליזציה לא רצויה (RUV) בנתונים כדי לשפר את איכות הנתונים⁹.
   הערה: גישה זו מוחלת על כל עוצמה ואות מורפולוגיה באופן עצמאי כמטריצה עם מערכים תוך שימוש בשורות ובנקודות כמו העמודות כמתואר בעבר⁹.
6. החל נרמול מחלות bivariate ל-RUV מנורמלים מנורמל באמצעות שורת המערך ועמודת המערך כמשתנים עצמאיים כדי לתקן את ההשפעות הקשורות למרחב או לאינטנסיביות.
7. לאחר השלמת הנורמליזציה, החציון מסכם את המשכפלת עבור כל תנאי של סביבת מיקרו עבור דיווח וניתוח נוסף.

תוצאות

כדי לפשט השפעות מיקרוסביבתיות על צמיחת תאים והתפשטות ועל מנת לזהות תנאים שקידמו או מעכבות את צמיחת התאים וההפצה, התאים הסרטניים בסרטן השד MCF7 הופרה על סט של שמונה 8-טוב MEMAs כפי שמתואר בפרוטוקול. שיטת הפעולה חשפה את התאים ל-48 ECMs שונים ו57 ליגפות שונות, עבור סך של 2736 קומבינטורית מיקרו תנאים סביב?...

Discussion

חשיבותה של "ממדי" והקשר היה גורם מניע בפיתוח במערכות תרבות מבחנה ככלים לאפיון תאים סרטניים באמצעות האינטראקציה שלהם עם המיקרו-סביבה¹¹, והיכולת של מבחנה מערכות תרבות לחקות את הסביבה vivo הוא כוח המניע מאחורי החיפוש כדי לשפר את מערכות התרבות. אולם, במערכות חוץ גופית, נותרו כלים משמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand