Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

Özet

Burada sunulan yöntemin amacı, mikroortam mikrodiziler (Mema) nasıl imal edilebilir ve kültürlü hücrelerin fenotürü üzerinde basit Kombinatoryal mikroortamlar binlerce etkisini sorgulamak için kullanılan göstermek için.

Özet

Mikroortamın hücrelerin phenoype üzerindeki etkisini anlamak, hem çözünür büyüme faktörleri hem de mikro ortamda matris ilişkili proteinlerin kompleks karışımı nedeniyle zor bir sorundur. Ayrıca, mikroortamlar içinde vitro modelleme için kolayca kullanılabilir reaktifler genellikle tamamen tanımlanmış ve toplu değişkenlik için toplu muzdarip proteinlerin karmaşık karışımları kullanın. Mikro Mikroarray (Mema) platformu tek bir tahlil içinde hücresel fenotipleri üzerindeki etkileri için mikro çevre proteinleri binlerce basit kombinasyonları değerlendirilmesi için izin verir. Memalar, bireysel liglerin dizilmiş ekstrenüler matris (ECM) proteinlerini içeren ayrı kuyulara eklenmesini sağlayan iyi plakalar halinde hazırlanmaktadır. Her basılı ECM ile çözünür ligand kombinasyonu benzersiz bir kombinasyon oluşturur. Tipik bir Mema tahlil hücre tek bir tahlil maruz kalan 2.500 benzersiz Kombinatoryal mikroortamlar büyük içerir. Bir test durumu olarak, meme kanseri hücre hattı MCF7 MEMA platformunda kaplama oldu. Bu tahlil Analizi hem geliştirmek ve bu hücrelerin büyümesi ve proliferasyonu inhibe faktörler tespit. MEMA platformu son derece esnektir ve kanser araştırmalarının ötesinde diğer biyolojik sorularla kullanılmak üzere uzatılabilir.

Giriş

İki boyutlu (2D) monolayers plastik üzerinde kanser hücre hatları kültür kanser araştırmacıları için büyük workhorses vardır biri kalır. Ancak, mikroortam giderek hücresel fenotürleri etkisi yeteneği için tanınıyor. Kanserde, tümör mikroçevre, büyüme, hayatta kalma, invazyon ve tedaviye yanıt dahil olmak üzere birden fazla hücresel davranışları etkileyen bilinmektedir^1,2. Geleneksel Tek tabakalı hücre kültürler genellikle mikroçevre etkileri eksikliği, hangi daha karmaşık üç boyutlu gelişimine yol açmıştır (3D) hücreleri büyümek için tespit, ticari olarak kullanılabilir arıtılmış Bodrum membran özler de dahil olmak üzere. Ancak, bu saflaştırılmış matrisler genellikle kullanmak ve toplu değişkenlik³ ve karmaşık kompozisyonlar³gibi teknik sorunlardan muzdarip karmaşıklaşır. Sonuç olarak, hücresel fenotürleri etkileyen olabilir belirli proteinler için fonksiyon atamak zor olabilir³.

Bu sınırlamaları gidermek için, mikroortam Mikroarray (Mema) teknolojisini geliştirdik, bu da mikro 'ı basit bileşimsiz matris (ECM) ve çözünebilir büyüme faktörü proteinlerinin kolay kombinasyonuna düşüren^4,5 . MEMA platformu, hücrelerin davranışını etkileyen baskın mikroçevresel faktörlerin tanımlanması sağlar. Bir dizi biçimi kullanarak, mikro ortam faktörlerinin kombinasyonları binlerce tek bir denemede farklı teknik kullanılarak olabilir. MEMA burada açıklanan interrogates ~ 2.500 farklı benzersiz mikroçevre koşulları. İyi plakalara yazdırılan ECM proteinleri, hücrelerin kültürlü olması üzerine büyüme pedleri oluşturur. Çözünür ligler bireysel kuyulara eklenir, hücrelerin maruz kaldığı her farklı noktada benzersiz Kombinatoryal mikroortamlar (ECM + ligand) oluşturma. Hücreler birkaç gün boyunca kültürlü, sonra sabit, lekeli, ve bu özel mikroçevre kombinasyonları maruz kalma sonucu hücresel fenotipleri değerlendirmek için görüntülenmiştir. Mikroortamlar basit kombinasyonları olduğundan, hücrelerde büyük fenotipi değişiklikler yapan proteinlerin tanımlanması basittir. Memalar, hücre kaderi kararları ve terapi^4,5,6,7tepki sürücü olanlar da dahil olmak üzere, birden fazla hücresel fenotürleri etkileyen faktörleri belirlemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu tepkiler basit 2D deneylerde doğrulanabilir ve daha sonra tümör mikroortamının karmaşıklığını daha tam olarak tekrar eden koşullar altında değerlendirilebilir. MEMA platformu, iyi fenotip biyomarkerlerin mevcut olması koşuluyla, çeşitli hücre türleri ve uç noktalarıyla oldukça uyarlanabilir.

Protokol

Not: Tahmini saat de dahil olmak üzere tüm MEMA işleminin genel bakışı Şekil 1' de gösterilen akış diyagramında özetlenmiştir. Bu protokol 8-kuyu plakaları içinde MEMAs imalatı ayrıntıları. Protokol diğer plakalar veya slaytlar için uyarlanabilir.

1. protein, Seyreltilme ve boyama tamponları hazırlanması

1. ECMs, ligler ve sitokinlerin oda sıcaklığına (RT) ve kısaca santrifüjlerin dengelenme şişeleri. Uygun RT arabelleğinin uygun hacmini ürün veri sayfasında belirtildiği şekilde ekleyin. Stok konsantrasyonları için üreticinin tavsiyesini takip edin.
   Not: Tablo 1 ve Tablo 2' de hisse senetleri ve nihai konsantrasyonları Ile ligler ve ECMS tam listesi sağlanmıştır. Her iki ligler ve ECMs genellikle standart 2 günlük kültür assays bir biyolojik etkisi ortaya çıkarır üretici tarafından önerilen aralığın en yüksek konsantrasyonda kullanılır. Kontaminasyonu önlemek için laminar akımı altında yavaşça ve biyogüvenlik dolapları proteinleri ele.
2. 1 h için RT 'de hafif sallanan şişeleri kulkaylar. Bu onları denature neden olabilir gibi protein Vortex etmeyin.
3. Uzun süreli depolama için aliquot proteinleri böylece tüm plakaya sadece tekrarlanan dondurma/çözme döngüleri ile bozulma önlemek için tek kullanımlık. Likofilize proteinlerin-80 °C ' de (aksi belirtilmediği sürece) gerekli olana kadar saklayın. : (İ) protein adı, (ii) hazırlanan Tarih, (iii) lot/toplu iş numarası, (iv) Tedarikçi, (v) katalog numarası, (vi) konsantrasyon, (vii) hacim ve (VIII) preparer gibi gelecekteki referanslar için tüm meta verileri toplamak için özen yapın.
4. % 20 (v/v) gliserol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 ve filtre sterilizasyonu içeren seyreltilici tampon hazırlayın. Bu tamponu steril tutun ve RT 'de saklayın.
5. % 2 (w/v) BSA, 1 mM MgCl₂ve 0,02% Nan₃ ' ü fosfat-TAMPONLU tuz (PBS) içeren boyama tamponunu hazırlayın. 4 °C ' de filtreleyin ve saklayın.

2. ECM kaynak plakasının hazırlanması

1. ECM proteinleri, yazılı ve buzda çözülecek olan seyreltilmemeli stokları çıkarın. Meta veri izleme için tüm lot numaralarını kaydedin.
2. Çözülür proteinleri yavaşça doğru Resuspension sağlamak ve bir santrifüjte aşağı döndürmek için fiske tüpler.
3. ECM baskı karışımları (EPMs) ve randomize 384-Well kaynak plakaları yaratacak bir sıvı taşıma robotu tarafından kullanılacak bir floresan fiducial olun.
   Not: 384-Well kaynak plakaları, 8 kuyu plakalarına yazdırılan dizileri oluşturmak için bir dokunma pin dizisi yazıcısı tarafından kullanılacaktır.
   1. Etiket 1,5 her EPM ve fiducial için mL mikrosantrifüjler tüpleri.
   2. Her bir EPM 'ye, 125 μL seyreltilme tamponunu birleştirerek (bkz. Adım 1,4) ECM stokunun uygun hacmine göre hazırlayın ve karışımı PBS ile toplam 250 μL hacmine getirin. Her EPM tüpünün son konsantrasyonları 1x ECM protein, 5 mM EDTA,% 10 gliserol ve 100 mM Tris olacaktır.
   3. Üretici tarafından belirtilen uygun tamponda çözülerek floresan fiducial hazırlayın ve 250 μL 'yi etiketli bir fiducial tüpe aktarın.

3. sıvı Işleyici kullanarak kaynak plakasının oluşturulması

1. ECMs konumlarını randomizes ve kullanılan dizi yazıcı pin kafası için optimize edilmiş bir 384-kuyu plaka düzeni tasarlayın. Dizi oryantasyonunda yardımcı olmak için her iyi satır 1, sütun 1 pozisyon yazdırılır böylece fiducial yerleşimi tasarlayın.
   Not: Her ECM 'nin toplam 14 − 15 çoğaltır güçlü veri sağlamak için kullanılır. Bağlayıcı tekdüzelik değerlendirmesi için sağlam bir ek veren kollajen veya başka bir ECM ek çoğaltır dahil. Düzen ilgi ECMs sayısına bağlı olarak birden fazla 384-kuyu plakaları kullanmak gerekebilir.
2. EPM tüpleri soğutulmuş bir tüp raf ile veya soğuk bir odada bulunan bir sıvı taşıma robotu kullanarak, 4 °C ' de tüpler tutarak, bir sıvı işleyici aktarın.
3. Sıvı iþleyicinin yazılımını kullanarak, her EPM 'nin 15 μL 'i ve 384-Well kaynak plaka (lar) içinde önceden belirlenmiş kuyulara fiducial aktarmak için bir program çalıştırın.
4. Pipet, baskı işlemi sırasında nem ve kurutmaya karşı koruma artırmak için kullanılmayan kuyuların içine PBS.
   Not: 4 x 7 pin kafası için optimize edilmiş ve ı bloğu ve PBS kollajen içeren bir 384-iyi kaynak plaka seti örneği için Şekil 2 bakın.
5. Plakayı (s) mühürleyin ve yazdırmaya hazır olana kadar 4 °C ' de tutun.

4. bir dizi baskı robotu kullanarak MEMAs yazdırma

Not: Protokolün aşağıdaki bölümü, MCF7 hücrelerinin büyümesi ve proliferasyonu üzerinde farklı mikroçevre proteinlerinin etkisini araştırmak için MEMA 'nın hazırlanması ve kullanımını özellikle açıklar. Ancak, protokol kolayca farklı ligler, ECMs ve hücre diğer hücre hatları ve ilgi uç noktalarını incelemek için kullanılmak üzere adapte edilebilir.

1. Bir dokunmatik PIN yazıcısı kullanarak, EPMs ve fiducial lekeler 8 kuyu plakaları içine yazdırın. Tekrarlanabilirlik sağlamak için her ECM koşulunun birden çok çoğaltır yazdırın.
   Not: diğer plaka formatları veya slaytlar yazdırmak için kullanılabilir, ancak optimum spot oluşumu elde etmek için tampon optimizasyonu gerekebilir.
   1. 4 x 7 baskı kafası konfigürasyonda düzenlenmiş 350 μm çap pimleri kullanarak MEMA için ECMs 'i yazdırın. 8-Well plakalardaki dizileri, toplam ~ 700 Spotlar için 35 satır olarak 20 sütun olarak yazdırın. Bu plaklarda daha büyük diziler mümkündür ancak hem hücre bağlaması hem de boyama sırasında artan kenar efektlerinin takas edilmesi ile birlikte gelir.
2. Yazdırdıktan sonra, kullanım öncesinde en az 3 gün boyunca bir kurutucu içinde depo plakaları.

5. ligand tedavi plakalarının oluşturulması

1. İlgi liglerini de içeren bir 96-Well plaka düzeni Tasarla. Aynı anda birçok MEMA plakasının tedavisinde kolaylaştırmak için, 8-Well MEMAs ve 96-Well plaka kuyuları arasında sıvı aktarmak için 4 aralıklı ipuçları ile çok kanallı pipet kullanımı için izin aralığı ile bu plaka tasarımı.
   Not: Bu protokolde, Tablo 2 ' de listelenen ligin tam kümesi kullanılır.
2. Buz üzerinde ligin çözülmesi. Kısaca Flick ve her tüp aşağı spin.
3. Üreticinin önerilen arabelleğini (genellikle PBS) kullanarak 200x çalışma stokunda seyreltmeli ligeler.
4. Her 200x ligand stoktaki pipet 10 μL, 96-kuyu plakasının içinde karşılık gelen kuyu içine girer.
5. -20 °C ' de mühür ve saklama plakaları.
   Not: Akış Analizi için tüm meta verileri yakalama, gruplar halinde ligand tedavi plakaları olun.

6. MEMAs üzerindeki hücreler kültür

1. Çift distile su (ddH₂O) içinde 1% kirlenme engelleme maddesi (malzeme tablosu) içeren, kirlenme yapmayan engelleme tamponunun başına 2 ml Ile 20 dakika boyunca Memas engelleyin.
2. Aspirate engelleme tampon ve üçlü durulama kuyuları PBS ile. Kurutma önlemek için, hücre kaplama için hazır olana kadar kuyularda PBS son hacmi bırakın.
   Not: MEMAs üzerinde hücre kültürü adımları için iki tezgah çalışanı olması son derece yararlıdır. Bir tezgah çalışanı aspirasyon adımlarını gerçekleştirebilir, ikincisi ise ek adımlar gerçekleştirir. 1 mL çok kanallı pipet ile pipetleme için 8-kuyu plakasını ve iki Pasteur pipeti ile Y-Splitter ile aynı anda birden fazla kuyu aspirine uyacak şekilde aralıklı ipuçları kullanmak önerilir.
3. Tohum 2 x 10⁵ MCF7 hücrelerde her Iyi 2 ml Dulbecco 'Nun modifiye kartal Orta (dmem) orta içeren 10% fetal sığır serumu (FBS).
   Not: Tam MEMA deneyinden önce, MEMA noktalarının yüksek hücre numaralarıyla (ancak confluent olmayan) istenen deneysel sürenin sonunda hücre numaralarını en iyi duruma getirmek için bir hücre titrasyon deneyi gerçekleştirin.
4. 2 − 18 h yapışma, aspirat orta ve 2 mL azaltılmış büyüme orta (DMEM ile 0,1% FBS) ile değiştirin.
   Not: Azaltılmış serum (örn.% 0,1 FBS) veya büyüme faktörü-tükenmiş koşullar Şu anda belirli liglerin uyarıcı etkisini izole etmek için kullanılabilir.
5. Buz üzerinde bir ligand tedavi plakasını çözün. Santrifüjlü çözünen plaka 200 x g 'de 1 dk.
6. Transfer 200 μL, kültür plakasının her bir kuyunda, tedavi plakasında uygun bir şekilde orta olan. Pipet yukarı ve aşağı orta ile ligand hacmi karıştırın ve MEMA plaka uygun iyi geri bu karışımı aktarmak için.
7. Elle hafifçe kaya ve MEMA plakaları inküyaya dönün. 37 °C ve 5% CO₂' de ligand/ECM kombinasyonunun varlığını deneme süresi için kültür.
   Not: Tipik bir MEMA deneyi 72 h için çalışır; uzun süreli deneyler orta ve yeniden tedavi ligand ile değiştirilmesi gerekebilir.
8. 71 h 'de nabız MEMA kuyuları 10 μM son konsantrasyon için 100x 5-etynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ile. EdU ile deneysel koşullarda, 37 °C ' de 1 h ve% 5 CO₂' de inkük edilir.
   Not: Diğer canlı hücre uygulamaları da şu anda kullanılabilir.

7. sabitleme ve boyama MEMAs

1. Sonra 72 h ve herhangi bir canlı hücre tedavileri, Aspire kuyuları. Min 'de 15 dakika boyunca 2% civarında formaldehite (PFA) başına 2 ml 'de Memas 'ı düzeltin.
2. Aspirate PFA. 15 dk için 0,1% noniyonik yüzey başına 2 mL ile geçirgen.
3. Noniyonik yüzey kaynağı aspirate ve PBS iyi başına 2 mL ile yıkayın. Aspirate PBS. 0,05% polisorbat 20 (PBS-T) ile 2 ml PBS ile yıkayın.
   Not: MEMA yüzeyi hidrofobiktir ve leke ve antikor inkübasyon öncesinde PBS-T ile yıkanmaması, kuluçk basamakları sırasında kuyularda boşlukların oluşması ve boyama yapılarına yol açacaktır.
4. Aspirate PBS-T. EdU algılama reaksiyon reaktifleri ekleyin. RT 'de 1 saat boyunca kulbirer yapın, sallanan ve ışıkta korunur. 1 h inkübasyon sonra, sağlanan ticari gidermek tampon ile reaksiyonu azaltma.
   Not: EdU algılama ve boyama/antikor basamakları maliyeti azaltmak için iyi başına 1,5 mL 'de gerçekleştirilebilir.
5. Su giderici tamponu aspirate ve lekeleri veya antikorlar ile inküp önce PBS-T ile yıkayın.
6. MEMA kuyularını% 2 (w/v) Sığır serum albümin (BSA), 1 mM MgCl₂ ve 0,02% Nan₃ gece 4 °c ' de içeren boyama tamponunda histon H3K9me3 (1:1000) ve fibrillarin (1:400) karşı antikorlar ile kulbin.
   Not: Tam MEMA kümesinde kullanmadan önce optimum konsantrasyonları belirlemek için antikor titrasyonları gerçekleştirin.
7. Primer antikor veya leke İnkübasyon sonrasında, 2x PBS ile ve bir kez PBS-T ile yıkayın kuyuları.
8. İkincil antikorlar ekleyin (eşek Anti-fare IgG ve eşek Anti-tavşan IgG, hem 1:300) ve 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Karanlıkta RT 'de 1 saat boyunca inküye yapın.
9. 2 mL 'Lik PBS 'ye kadar, iki adet x, 2 ml ile yıkayın.
10. Işıktan korunan 4 °C ' de PBS 'de daha sonra görüntüleme için görüntülenmiş MEMAs 'a devam edin.

8. MEMAs 'ın görüntülenmesi

1. Uygun floresan algılama kanalları ile otomatik görüntüleme sistemi üzerinde görüntü MEMA.
2. Bir görüntü yönetim sistemine elde edilen görüntü verilerini çıktı. Hücreleri segment ve Cell Profiler⁸kullanarak yoğunluk düzeylerini hesaplayın.

9. veri analizi

Not: Veri Analizi normalleştirme, varyasyon düzeltme ve ham CellProfiler türetilmiş veri özetleme oluşur. Bu örnekte, özel kod ile R-ortamı tüm adımları gerçekleştirmek için kullanılır. Ancak, herhangi bir istatistiksel ortam veya yazılım programı eşdeğer eylemleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Çözümleme için R ortamı için açık kaynak özel kod örneği kullanılabilir: https://www.SYNAPSE.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. Bölümlenmiş görüntü verilerini preprocess ve Normalleştir.
2. DAPı lekeli çekirdekleri kullanarak spot hücre sayısını belirleyin.
3. Hücreleri EdU⁺olarak etiketlemek için edu yoğunluğu otomatik kapı. Her noktada EdU⁺ hücre oranını kullanarak proliferasyonu ölçün.
4. Sitoplazmik lekeleri ve nükleer morfoloji ölçümlerini spot düzeyde özetlemektedir.
5. Veri kalitesini artırmak için veriler üzerinde istenmeyen varyasyon (RUV) normalleştirme kaldırılması gerçekleştirin⁹.
   Not: Bu yaklaşım, her yoğunluğa ve morfoloji sinyaline, daha önce⁹olarak açıklandığı gibi satırlar ve lekeler kullanarak diziler içeren bir matris olarak bağımsız olarak uygulanır.
6. Uzamsal veya yoğunlukla ilgili efektler için düzeltmek için bağımsız değişkenler olarak dizi satırını ve dizi sütununu kullanarak ruv normalleştirilmiş kalıntılar için iki değişkenli Loess normalleştirme uygulayın.
7. Normalleştirme tamamlandıktan sonra medyan, raporlama ve daha fazla çözümleme için her mikro ortam koşulu için çoğaltır özetler.

Sonuçlar

Hücre büyümesi ve proliferasyonu üzerinde mikroçevresel etkileri kolaylaştırmak ve hücre büyümesini ve proliferasyonu teşvik eden veya engellenmiş olan koşulları belirlemek için, meme kanseri hücre hattı MCF7 protokolde açıklandığı gibi sekiz 8-iyi Memas bir dizi üzerinde seribaşı oldu. Bu tahlil 48 farklı ECMs ve 57 farklı ligler, toplam 2736 Kombinatoryal mikroçevre koşulları için hücreleri maruz. Kültüre 71 h sonra, hücreler EdU ile darbeli, sabit, geçirgen, ve DAPı ile lekelenmiş...

Tartışmalar

"Dimensionality" ve içeriğin önemi, mikroçevre¹¹ile etkileşimi ile kanser hücrelerinin karakterizasyonu araçları olarak in vitro kültür sistemlerinin geliştirilmesi konusunda motive edici bir faktör olmuştur ve in vitro yeteneği Kültür sistemleri in vivo çevre taklit etmek için bu kültür sistemleri geliştirmek için arayışı arkasında bir itici kuvvettir. In vitro sistemlerde, ancak, oldukça basitleştirilmiş bir model¹²aşağı kompleks in vivo du...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand