Verwendung von Mikroarrays zur Vernehmung von Mikroumweltauswirkungen auf zelluläre Phänotypen bei Krebs

Zusammenfassung

Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist es, zu zeigen, wie Mikroumgebungsmikroarrays (MEMA) hergestellt und verwendet werden können, um die Auswirkungen von Tausenden von einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen auf den Phänotyp kultivierter Zellen abzufragen.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Auswirkungen der Mikroumgebung auf den Phänotyp von Zellen ist aufgrund der komplexen Mischung sowohl aus löslichen Wachstumsfaktoren als auch matrixassoziierten Proteinen in der Mikroumgebung in vivo ein schwieriges Problem. Darüber hinaus verwenden leicht verfügbare Reagenzien für die Modellierung von Mikroumgebungen in vitro in der Regel komplexe Mischungen von Proteinen, die unvollständig definiert sind und unter der Variabilität von Charge zu Charge leiden. Die Microenvironment Microarray (MEMA)-Plattform ermöglicht die Bewertung tausender einfacher Kombinationen von Mikroumweltproteinen für ihre Auswirkungen auf zelluläre Phänotypen in einem einzigen Test. Die MEMAs werden in Brunnenplatten hergestellt, was die Zugabe einzelner Liganden ermöglicht, um Brunnen zu trennen, die arrayierte extrazelluläre Matrixproteine (ECM) enthalten. Die Kombination des löslichen Liganden mit jedem gedruckten ECM bildet eine einzigartige Kombination. Ein typischer MEMA-Assay enthält mehr als 2.500 einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen, denen Zellen in einem einzigen Assay ausgesetzt sind. Als Testfall wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf der MEMA-Plattform plattiert. Die Analyse dieses Assays identifizierte Faktoren, die das Wachstum und die Proliferation dieser Zellen sowohl verbessern als auch hemmen. Die MEMA-Plattform ist hochflexibel und kann für den Einsatz mit anderen biologischen Fragen über die Krebsforschung hinaus erweitert werden.

Einleitung

Die Kultivierung von Krebszelllinien auf Kunststoff in zweidimensionalen (2D) Monolayern bleibt eines der Wichtigsten Arbeitspferde für Krebsforscher. Jedoch, die Mikroumgebung wird zunehmend für seine Fähigkeit, zelluläre Phänotypen zu beeinflussen erkannt. Bei Krebs, die Tumor-Mikroumgebung ist bekannt, mehrere zelluläre Verhaltensweisen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Überleben, Invasion, und Reaktion auf Therapie^1,2. Herkömmliche monolayer Zellkulturen haben in der Regel keine Mikroumgebungseinflüsse, was zur Entwicklung komplexerer dreidimensionaler (3D) Assays zum Wachsen von Zellen geführt hat, einschließlich kommerziell erhältlicher gereinigter Kellermembranextrakte. Diese gereinigten Matrizen sind jedoch in der Regel kompliziert zu verwenden und leiden unter technischen Problemen wie Chargenvariabilität³ und komplexen Zusammensetzungen³. Infolgedessen kann es schwierig sein, bestimmten Proteinen, die sich aufzelluläre Phänotypen auswirken können, eine Funktion zuzuweisen 3 .

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir die Microenvironment Microarray (MEMA) Technologie entwickelt, die die Mikroumgebung auf einfache Kombinationen von extrazellulärer Matrix (ECM) und löslichen Wachstumsfaktorproteinen^{reduziert 4,5} . Die MEMA-Plattform ermöglicht die Identifizierung dominanter Mikroumweltfaktoren, die das Verhalten von Zellen beeinflussen. Mithilfe eines Arrayformats können Tausende von Kombinationen von Mikroumgebungsfaktoren in einem einzigen Experiment ermittelt werden. Das hier beschriebene MEMA hinterfragt 2.500 verschiedene einzigartige Mikroumgebungsbedingungen. ECM-Proteine, die in Brunnenplatten gedruckt werden, bilden Wachstumspads, auf denen Zellen kultiviert werden können. Lösliche Liganden werden einzelnen Brunnen zugesetzt, wodurch an jedem einzelnen Ort, dem die Zellen ausgesetzt sind, einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen (ECM + Ligand) entstehen. Zellen werden für mehrere Tage kultiviert, dann fixiert, gefärbt und abgebildet, um zelluläre Phänotypen als Ergebnis der Exposition gegenüber diesen spezifischen Mikroumgebungskombinationen zu bewerten. Da es sich bei den Mikroumgebungen um einfache Kombinationen handelt, ist es einfach, Proteine zu identifizieren, die große phänotypische Veränderungen in den Zellen antreiben. MEMAs wurden erfolgreich verwendet, um Faktoren zu identifizieren, die mehrere zelluläre Phänotypen beeinflussen, einschließlich derjenigen, die Entscheidungen über das Zellschicksal und die Reaktion auf Therapie^4,5,6,7vorantreiben. Diese Reaktionen können in einfachen 2D-Experimenten validiert und dann unter Bedingungen beurteilt werden, die die Komplexität der Tumormikroumgebung vollständiger rekapitulieren. Die MEMA-Plattform ist sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl von Zelltypen und Endpunkten, vorausgesetzt, dass gute phänotypische Biomarker verfügbar sind.

Protokoll

HINWEIS: Eine Übersicht über den gesamten MEMA-Prozess, einschließlich der geschätzten Zeit, ist im Flussdiagramm in Abbildung 1dargestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von MEMAs in 8-Well-Platten. Das Protokoll kann für andere Platten oder Dias angepasst werden.

1. Herstellung von Protein-, Verdünnungs- und Färbepuffern

1. Ausgleich durch Fläschchen von ECMs, Liganden und Zytokinen auf Raumtemperatur (RT) und kurz Zentrifuge. Fügen Sie das entsprechende Volumen des entsprechenden RT-Puffers hinzu, wie auf dem Produktdatenblatt angegeben. Folgen Sie der Empfehlung des Herstellers für Aktienkonzentrationen.
   HINWEIS: Eine vollständige Liste der Liganden und EKOM mit ihren Bestands- und Endkonzentrationen ist Tabelle 1 und Tabelle 2enthalten. Sowohl Liganden als auch ECMs werden in der Regel in der höchsten Konzentration des vom Hersteller empfohlenen Bereichs verwendet, der eine biologische Wirkung in Standard-2-Tages-Kultur-Assays hervorruft. Behandeln Sie Proteine schonend und in Biosicherheitsschränken unter laminarem Fluss, um Kontaminationen zu vermeiden.
2. Inkubieren Fläschchen mit sanftem Schaukeln bei RT für 1 h. Wirbelproteine nicht, da dies dazu führen kann, dass sie denaturieren.
3. Aliquot-Proteine für die Langfristige Lagerung, so dass alle Aliquots nur zur Vermeidung von Abbau mit wiederholten Frost-/Tauzyklen verwendet werden. Lyophilisierte Proteine bei -80 °C (sofern nicht anders angegeben) lagern, bis dies erforderlich ist. Achten Sie darauf, alle Metadaten für zukünftige Referenzen zu sammeln, wie z. B.: (i) Proteinname, (ii) vorbereitetes Datum, (iii) Chargen-/Chargennummer, (iv) Lieferant, (v) Katalognummer, (vi) Konzentration, (vii) Volumen und (viii) Vorbereiter.
4. Bereiten Sie Verdünnungspuffer mit 20% (v/v) Glycerin, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2 und Filter sterilisieren. Bewahren Sie diesen Puffer steril auf und lagern Sie ihn bei RT.
5. Bereiten Sie einen Färbepuffer vor, der 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl₂und 0,02% NaN₃ in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) enthält. Filtern und lagern bei 4 °C.

2. Vorbereitung einer ECM-Quellenplatte

1. Entfernen Sie aliquoted Bestände an ECM-Proteinen, die gedruckt werden sollen, und tauen Sie auf Eis. Zeichnen Sie alle Chargennummern für die Metadatenverfolgung auf.
2. Flick Tuben von aufgetauten Proteinen sanft, um eine ordnungsgemäße Resuspension zu gewährleisten und in einer Zentrifuge nach unten zu drehen.
3. Machen Sie ECM-Druckmischungen (EPMs) und einen fluoreszierenden Fiducial, der von einem Flüssigkeitshandhabungsroboter verwendet werden kann, der die randomisierten 384-Well-Quellenplatten erstellt.
   HINWEIS: Die 384-Well-Quellplatten werden von einem Touch-Pin-Array-Drucker verwendet, um die gedruckten Arrays in 8 Well-Platten zu erstellen.
   1. Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre für jedes EPM und das Treuhandland.
   2. Bereiten Sie jedes EPM vor, indem Sie 125 L Verdünnungspuffer (siehe Schritt 1.4) mit dem entsprechenden Volumen des ECM-Bestands kombinieren und das Gemisch mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 250 l bringen. Die Endkonzentrationen in jedem EPM-Röhrchen sind 1x ECM-Protein, 5 mM EDTA, 10% Glycerin und 100 mM Tris.
   3. Bereiten Sie ein fluoreszierendes Fiducial vor, indem Sie es in dem vom Hersteller angegebenen Puffer auflösen und 250 l in ein gekennzeichnetes Fiducial-Rohr übertragen.

3. Erstellung der Quellplatte mit einem Flüssigkeitshandler

1. Entwerfen Sie ein 384-Well-Plattenlayout, das die Positionen der ECMs randomisiert und für den verwendeten Arraydrucker-Pinkopf optimiert ist. Entwerfen Sie die Platzierung des Treuhandsplatzes so, dass er in der Zeile 1, Spalte 1 Position jedes Brunnens gedruckt wird, um die Arrayausrichtung zu unterstützen.
   HINWEIS: Zur Sicherstellung robuster Daten werden insgesamt 14 bis 15 Replikationen jedes ECM verwendet. Fügen Sie zusätzliche Replikationen von Kollagen oder einem anderen ECM ein, das eine robuste Befestigung für die Beurteilung der Homogenität der Bindung liefert. Das Layout muss je nach Anzahl der ecMs möglicherweise mehrere 384-Well-Platten verwenden.
2. Übertragen Sie EPM-Rohre auf einen Flüssigkeitshandler und halten Sie Rohre bei 4 °C, entweder mit einem gekühlten Rohrträger oder mit einem Flüssigkeitshandhabungsroboter in einem Kühlraum.
3. Führen Sie mithilfe der Software des Flüssigkeitshandlers ein Programm aus, um 15 L jedes EPM und das Treuhandsystem in die vordefinierten Brunnen innerhalb der 384-Well-Quellplatte(n) zu übertragen.
4. Pipetten PBS in alle ungenutzten Brunnen, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen und vor Austrocknung während des Druckprozesses zu schützen.
   HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für ein Beispiel für ein 384-Well-Quellplattenset, das für einen 4 x 7-poligen Kopf optimiert ist und einen Kollagen-I-Block und PBS enthält.
5. Platten versiegeln und bei 4 °C halten, bis sie druckfertig sind.

4. Drucken von MEMAs mit einem Array-Druckroboter

HINWEIS: Im folgenden Teil des Protokolls wird speziell die Herstellung und Verwendung von MEMA beschrieben, um die Auswirkungen verschiedener Mikroumweltproteine auf das Wachstum und die Proliferation von MCF7-Zellen zu untersuchen. Das Protokoll kann jedoch leicht angepasst werden, um verschiedene Liganden, ECMs und Zellen zu verwenden, um andere Zelllinien und Endpunkte von Interesse zu untersuchen.

1. Drucken Sie mit einem Touch-Pin-Drucker EPMs und Fiducial-Spots in 8 Brunnenplatten. Drucken Sie mehrere Replikationen jeder ECM-Bedingung, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
   HINWEIS: Andere Plattenformate oder Dias können für den Druck verwendet werden, aber Pufferoptimierung kann erforderlich sein, um eine optimale Punktbildung zu erreichen.
   1. Drucken Sie die ECMs für den MEMA mit Pins mit einem Durchmesser von 350 m, die in einer 4 x 7 Druckkopfkonfiguration angeordnet sind. Drucken Sie die Arrays in den 8-Well-Platten als 20 Spalten in 35 Zeilen, für insgesamt 700 Punkte. Größere Arrays sind in diesen Platten möglich, haben aber einen Kompromiss von erhöhten Kanteneffekten sowohl in der Zellbindung als auch bei der Färbung.
2. Nach dem Drucken platten mindestens 3 Tage vor gebrauchen in einem Trockenschrank lagern.

5. Erstellung von Ligand-Behandlungsplatten

1. Entwerfen Sie ein 96-Well-Platten-Layout mit Liganden von Interesse. Um die Behandlung vieler MEMA-Platten auf einmal zu erleichtern, entwerfen Sie diese Platte mit einem Abstand, der die Verwendung einer Mehrkanalpipette mit 4 Abstandsspitzen ermöglicht, um Flüssigkeiten zwischen den Brunnen von 8-Well-MEMAs und einer 96-Well-Platte zu übertragen.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird der vollständige Satz von Liganden verwendet, die in Tabelle 2 aufgeführt sind.
2. Liganden auf Eis auftauen. Kurz streichen und drehen Sie jede Röhre nach unten.
3. Verdünnen Sie Liganden mit dem vom Hersteller empfohlenen Puffer (in der Regel PBS) auf einen 200-fachen Arbeitsbestand.
4. Pipetten Sie 10 l von jedem 200x Ligand-Lager in den entsprechenden Brunnen innerhalb der 96-Well-Platte.
5. Dichtungs- und Lagerplatten bei -20 °C.
   HINWEIS: Erstellen Sie Liganden-Behandlungsplatten in Chargen und erfassen Sie alle Metadaten für die nachgelagerte Analyse.

6. Culturing Cells auf MEMAs

1. Block MEMAs für 20 min mit 2 ml pro Brunnen des nicht-fouling Blockierpuffers mit 1% nicht-fouling Blockierungsmittel (Tabelle der Materialien) in doppeldestilliertem Wasser (ddH₂O).
2. Aspirieren Sie Blockierpuffer und dreifache Spülbrunnen mit PBS. Um die Austrocknung zu verhindern, lassen Sie das endgültige Volumen der PBS in Brunnen, bis sie für die Zellbeschichtung bereit sind.
   HINWEIS: Es ist äußerst hilfreich, zwei Bankarbeiter für Zellkulturschritte auf MEMAs zu haben. Ein Bankarbeiter kann Aspirationsschritte ausführen, während der zweite Additionsschritte durchführt. Es wird empfohlen, eine 1 ml Mehrkanalpipette mit Spitzen zu verwenden, die der 8-Well-Platte für das Pipettieren entsprechen, und einen Y-Splitter mit zwei Pasteur Pipetten, um mehrere Brunnen gleichzeitig zu aspirieren.
3. Samen 2 x 10⁵ MCF7-Zellen pro Brunnen in 2 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält.
   HINWEIS: Führen Sie vor einem vollständigen MEMA-Experiment ein Zelltitrationsexperiment durch, um die Zellzahlen so zu optimieren, dass MEMA-Spots am Ende der gewünschten experimentellen Dauer hohe Zellzahlen (aber nicht konfluent) haben.
4. Nach 2-18 h Haftung, Aspiratmedium und ersetzen durch 2 ml wachstumsreduziertes Medium (DMEM mit 0,1% FBS).
   HINWEIS: Reduziertes Serum (z. B. 0,1% FBS) oder wachstumsfaktorreduzierte Bedingungen können zu diesem Zeitpunkt verwendet werden, um die stimulierende Wirkung bestimmter Liganden zu isolieren.
5. Eine Ligandenbehandlungsplatte auf Eis auftauen. Zentrifuge aufgetautPlatte bei 200 x g für 1 min.
6. 200 L Medium von jedem Brunnen in der Kulturplatte auf den entsprechenden Brunnen in der Behandlungsplatte übertragen. Nach oben und unten, um Ligandenvolumen mit Medium zu mischen und diese Mischung wieder auf den entsprechenden Brunnen in der MEMA-Platte zu übertragen.
7. Leicht von Hand schaukeln und MEMA-Platten zum Inkubator zurückgeben. Kultur für die Dauer des Experiments in Gegenwart der Liganden/ECM-Kombinationbei 37 °C und 5% CO2 .
   HINWEIS: Ein typisches MEMA-Experiment läuft 72 h; längerfristige Experimente können den Austausch von Medium und eine erneute Behandlung mit Ligand erfordern.
8. Pulsieren Sie MEMA-Bohrungen bei 71 h mit 100x 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) für eine Endkonzentration von 10 m. Inkubieren unter experimentellen Bedingungen mit EdU für 1 h bei 37 °C und 5%_CO2.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können auch andere Live-Zell-Behandlungen angewendet werden.

7. Fixierung und Färbung von MEMAs

1. Nach 72 h und alle Live-Zell-Behandlungen, Aspirieren Brunnen. Fix MEMAs in 2 ml pro Bohrung von 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei RT.
2. Aspirieren PFA. Permeabilisieren Sie mit 2 ml pro Brunnen von 0,1% nichtionischem Tensid für 15 min.
3. Das nichtionische Tensid ansaugen und mit 2 ml pro PBS-Brunnen waschen. Aspirieren PBS. Mit 2 ml PBS mit 0,05% Polysorbat 20 (PBS-T) waschen.
   HINWEIS: Die MEMA-Oberfläche ist hydrophob, und das Nichtwaschen mit PBS-T vor der Flecken- und Antikörperinkubation führt zur Bildung von Hohlräumen in Brunnen während der Inkubationsschritte und führt zu Färbungsartefakten.
4. Aspirate PBS-T. Fügen Sie EdU-Erkennungsreaktionsreagenzien hinzu. Inkubieren für 1 h bei RT, schaukeln und vor Licht geschützt. Nach 1 h Inkubation, Löschreaktion mit dem mitgelieferten kommerziellen Quench-Puffer.
   HINWEIS: EdU-Erkennungs- und Färbe-/Antikörperschritte können in 1,5 ml pro Brunnen durchgeführt werden, um die Kosten zu senken.
5. Den Abschreckpuffer ansaugen und vor der Inkubation mit Flecken oder Antikörpern mit PBS-T waschen.
6. MEMA-Brunnen mit Antikörpern gegen Histon H3K9me3 (1:1.000) und Fibrillarin (1:400) im Färbepuffer mit 2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM MgCl₂ und 0,02% NaN₃ über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Führen Sie Antikörpertitrationen durch, um optimale Konzentrationen zu bestimmen, bevor Sie sie auf einem vollständigen MEMA-Set verwenden.
7. Nach Primärantikörper oder Fleckeninkubation, waschen Sie Brunnen 2x mit PBS und einmal mit PBS-T.
8. Sekundäre Antikörper (Esel-Anti-Maus-IgG und Esel-Anti-Kaninchen-IgG, beide 1:300) und 0,5 g/ml 4 x 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzufügen. 1 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
9. Waschen Sie Brunnen 2x mit 2 ml pro Brunnen von PBS, so dass sie in den letzten 2 ml PBS.
10. Gehen Sie zur Abbildung oder Lagerung von gebeizten MEMAs für die spätere Bildgebung in PBS bei 4 °C, die vor Licht geschützt sind.

8. Bildgebung von MEMAs

1. Bild MEMA auf einem automatisierten Bildgebungssystem mit geeigneten Fluoreszenzdetektionskanälen.
2. Ausgabe resultierender Bilddaten an ein Bildverwaltungssystem. Segmentieren von Zellen und berechnen Sie Intensitätsstufen mit CellProfiler⁸.

9. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse besteht aus Normalisierung, Variationskorrektur und Zusammenfassung der von CellProfiler abgeleiteten Rohdaten. In diesem Fall wird die R-Umgebung mit benutzerdefiniertem Code verwendet, um alle Schritte auszuführen. Jede statistische Umgebung oder jedes Softwareprogramm kann jedoch verwendet werden, um die entsprechenden Aktionen auszuführen. Ein Beispiel für den benutzerdefinierten Open-Source-Code für die R-Umgebung zur Analyse finden Sie unter: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. Vorverarbeiten und Normalisieren der segmentierten Bilddaten.
2. Bestimmen Sie die Anzahl der Punktzellen mithilfe der DAPI-gebeizten Kerne.
3. Auto-Gate EdU-Intensität, um Zellen als EdU⁺zu kennzeichnen. Messen Sie die Proliferation anhand des Anteils der EdU⁺ Zellen an jedem Punkt.
4. Median fassen zytoplasmatische Flecken und Kernmorphologiemessungen auf Spot-Ebene zusammen.
5. Entfernen der RUV-Normalisierung unerwünschter Variationen (RUV), um die Datenqualität zu verbessern⁹.
   HINWEIS: Dieser Ansatz wird unabhängig voneinander auf jedes Intensitäts- und Morphologiesignal angewendet, als Matrix mit Arrays, die die Zeilen und Flecken als Spalten verwenden, wie zuvor^{beschrieben 9}.
6. Wenden Sie die bivariate Lössnormalisierung auf die normalisierten RUV-Residuen an, indem Sie die Arrayzeile und die Arrayspalte als unabhängige Variablen verwenden, um räumliche oder intensitätsbezogene Effekte zu korrigieren.
7. Nach Abschluss der Normalisierung fassen Die Medianreplikationen für jede Mikroumgebungsbedingung für die Berichterstattung und weitere Analysen zusammen.

Ergebnisse

Um die Auswirkungen der Mikroumwelt auf das Zellwachstum und die Zellproliferation zu vereinfachen und Bedingungen zu identifizieren, die das Zellwachstum und die Zellproliferation förderten oder hemmten, wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf einer Reihe von acht 8-Well-MEMAs gesät, wie im Protokoll beschrieben. Dieser Assay setzte die Zellen 48 verschiedenen EKMs und 57 verschiedenen Liganden für insgesamt 2736 kombinatorische mikroökologische Bedingungen aus. Nach 71 h in der Kultur wurden Zellen mit EdU gepulst, ...

Diskussion

Die Bedeutung von "Dimensionalität" und Kontext war ein motivierender Faktor bei der Entwicklung von In-vitro-Kultursystemen als Werkzeuge für die Charakterisierung von Krebszellen durch ihre Interaktion mit der Mikroumgebung¹¹und die Fähigkeit von In-vitro-Kultursystemen Kultursysteme, um die in vivo-Umgebung nachzuahmen, sind eine treibende Kraft hinter dem Streben, diese Kultursysteme zu verbessern. In-vitro-Systeme bleiben jedoch wichtige Instrumente der Krebsforschung gerade wegen ihrer F?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand