שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

Summary

התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.

Abstract

עצם היא רקמת חיבור היוו האוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, ו osteoclasts ו מטריצה החילוץ מינרליזציה, אשר נותן לו את כוחה וגמישות ומאפשר לו להגשים את תפקידיה. עצם הוא נחשף ברציפות למגוון של גירויים, אשר בתנאים פתולוגיים יכול deregulate העצם שיפוץ. כדי ללמוד ביולוגיה של עצם ומחלות ולהעריך את הסוכנים הטיפוליים הפוטנציאליים, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo .

כתב יד זה מתאר את תהליך הניתוח ותנאי התרבות של calvarias מבודדים מעכברי המין לחקור את היווצרות העצם ואת מיקרוסביבה הגידול בעצם. בניגוד למבחנה במודלים vivo , זה לשעבר מודל vivo מאפשר שימור של הסביבה תלת ממדית של הרקמה, כמו גם את הגיוון הסלולר של העצם תוך הימנעות תחת תנאים מוגדרים כדי לדמות את מיקרוהסביבה הרצויה. לכן, ניתן לחקור את שיפוץ העצם ואת המנגנונים שלה, כמו גם את האינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון האינטראקציות בין תאים סרטניים ועצם.

הבחני דיווחו כאן להשתמש calvarias מ 5-7 ביום הישן balb/C עכברים. המי-calvarias שהתקבלו הם מתורבתים בנוכחות של אינסולין, תאי סרטן השד (מד א-MB-231), או בינוני ממוזג מתרביות תאים של סרטן השד. לאחר הניתוח, זה הוקם כי אינסולין המושרה היווצרות העצם החדשה, בעוד תאים סרטניים המדיום הממוזג שלהם המושרה ספיגת העצם. מודל כיפת בוצע בהצלחה במחקר בסיסי ויישם כדי ללמוד פיתוח עצם ומחלות העצם המושרה בסרטן. באופן כללי, זוהי אפשרות מצוינת עבור שיטת קל, אינפורמטיבי, ובעלות נמוכה.

Introduction

עצם היא רקמת חיבור דינמית שיש לה מספר פונקציות, כולל תמיכה השרירים, הגנה על האיברים הפנימיים מח עצם, ואחסון ושחרור של סידן וגורמי גדילה^1,2. כדי לשמור על שלמות ותפקוד תקין, רקמת העצם היא ברציפות תחת תהליך של שיפוץ. במונחים כלליים, מחזור של שיפוץ עצם ניתן לחלק לספיגת עצם היווצרות העצם¹. חוסר איזון בין שני שלבים אלה של שיפוץ העצם יכול להוביל להתפתחות של הפתווגיות העצם. כמו כן, מחלות כגון סרטן השד משפיעים לעתים קרובות על שלמות העצם; כ 70% של חולים בשלבים מתקדמים יש או יהיה גרורות העצם. כאשר התאים סרטן השד להזין את העצמות, הם משפיעים על מטבוליזם העצם, וכתוצאה מכך ספיגת מוגזם (נגעים אוסטקלאסטיים) ו/או היווצרות (נגעים osteoblastic)³.

כדי להבין את הביולוגיה של מחלות העצם ולפתח טיפולים חדשים, יש צורך להבין את המנגנונים המעורבים בעיצוב מחדש של העצם. במחקר הסרטן, זה חיוני לחקור את התהליך גרורות העצם הקשר שלה מיקרוסביבה גרורתית. בשנת 1889, סטיבן פאג'ט שיערו כי גרורות מתרחשות כאשר יש תאימות בין תאי הגידול לבין רקמת היעד, והציע כי האתר גרורתי תלוי בזיקה של הגידול עבור מיקרוסביבה⁴. ב 1997, מונדי וגיז הציגו את המושג "מחזור אכזרי של גרורות העצם" כדי להסביר כיצד תאים סרטניים לשנות את מיקרוסביבה העצם כדי להשיג ההישרדות שלהם צמיחה, ואיך מיקרוסביבה העצם מקדמת את הצמיחה שלהם על ידי מתן סידן וגורמי צמיחה^5,6,7.

כדי לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב העצם וגרורה, ולהעריך מולקולות בעלי פוטנציאל תרפויטי אפשרי, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo . עם זאת, מודלים אלה מציגים כיום מגבלות רבות, כגון הייצוג הפשוט של מיקרואקולוגיה העצם, והעלות שלהם^8,9. התרבות של vivo העצם explants ex יש את היתרון של שמירה על ארגון תלת מימדי, כמו גם מגוון של תאי העצם. בנוסף, ניתן לשלוט בתנאים ניסיוניים. המודלים לחקור כוללים את התרבות של עצמות המסרק, ראשי הירך, calvarias, ו הלסת התחתונה או בליבת העור¹⁰. היתרונות של מודלים vivo ex הוכחו במחקרים שונים. בשנת 2009, נורסטרנד ומשתפי-פעולה דיווחו על הקמת מודל התרבות הבין-תרבותית המבוססת על האינטראקציות בין העצמות לתאי סרטן הערמונית¹¹. גם, ב 2012, Curtin ומשתפי פעולה דיווחו על פיתוח של מודל תלת מימדי באמצעות vivo cocultures ex ¹². המטרה של מודלים vivo ex לשעבר היא לשחזר את התנאים של סביבת מיקרו העצם באופן מדויק ככל האפשר כדי להיות מסוגל לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב שיפוץ נורמלי או פתולוגי בעצם ולהעריך את היעילות של הסוכנים הטיפוליים החדשים.

הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על ההליכים שפורסמו על ידי גארט¹³ ומחמד ואח '^.14. התרבויות הcalvaria העכברים שימשו מודל ניסיוני, כפי שהם שומרים על הארכיטקטורה תלת מימדי של העצם תחת פיתוח ותאי עצם, כולל תאים בכל שלבי הבידול (כלומר, אוסטאופיות, אוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, סטרומה תאים) זה להוביל אוסטאופתיות בוגרת האוסטאופתיות, כמו גם מטריצה מינרליזציה¹⁴. המודל vivo ex אינו מייצג את התהליך הפתולוגי של מחלות העצם לחלוטין. עם זאת, השפעות על שיפוץ העצם או העצמות המושרה העצם אוסטאופוליזיס יכול להיות נמדד במדויק.

בקצרה, פרוטוקול זה כולל את השלבים הבאים: הניתוח של calvarias מ 5-7 הישן ביום עכברים, calvaria טרום תרבות, calvaria יישומי תרבות (למשל, תרבות בנוכחות של אינסולין, תאים סרטניים או בינוני ממוזג, ואפילו סוכנים עם פוטנציאל תרפויטי, על פי מטרת החקירה), קיבוע עצם וcalvaria decalcification, עיבוד רקמות, ניתוח היסטולוגית, ופרשנות התוצאה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים המשמשים באותם מאמר הושגו מזנים BALB/c עכברים, באמצעות עכברים זכר ונקבה ללא אבחנה. ניסויים בתרבות הקודמת בוצעו גם באמצעות זנים אחרים, כגון fvb, עכברים שוויצריים, CD-1, ו csa עכברים^11,12,14. כל העכברים שוכנו על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH), נספח ש. הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש (IACUC) במרכז למחקר מדעי והשכלה גבוהה ב אנסנאדה (CICESE).

1. ניתוח קלוריון

1. לחטא מכשירים לחיתוך (g., 1 x 2 מלקחיים רקמת השיניים, מספריים כירורגי ישר, לבתר מספריים, מלקחיים בסדר מחודדות, טיפ מעוקל דק לנתח מלקחיים, לבתר מלקחיים, אזמל). מים מזוקקים סטרילי ניתן להשתמש כדי לנקות את כלים כירורגי בין כל ניתוח, וסטרילי 1x PBS ניתן להשתמש עבור ניקוי כל המי-calvaria.
2. מניחים את כלי החיתוך הסטרילי, המים, הערוץ הראשון, והחומרים הדרושים לביצוע ההליך (למשל, מיקרופיפטות, משקפיים, מנות פטרי סטריליות) במכסה זרם למינארי.
   הערה: בצע את ההליך כולו בתנאים סטריליים.
3. הוסף 12 מ ל של PBS 1 x סטרילי לתוך 2 10 ס"מ מנות פטרי.
4. בחר את הגורים ומניחים אותם ליד המכסה.
   הערה: לנתח את הקלוריון מ 5-7 גורים בני יום.
5. לאסוף ולהחזיק את העכבר בזהירות באמצעות מלקחיים מבתר.
6. ערוף את ראשו של העכבר באמצעות ניתוח מספריים ומניחים את הראש בצלחת פטרי עם PBS.
   הערה: עריפת ראש אינה מתאימה לעכברים ישנים יותר. אם יש לעשות את הניסוי בעכברים מבוגרים, יש לשנות את שיטת המתת החסד בהתאם לחוקי הניסויים בבעלי החיים.
7. החזק את הראש בחוזקה על ידי אזור האף עם 1 x 2 מלקחיים רקמת השיניים ולהסיר את העור מעל הגולגולת עד calvaria גלוי.
8. זהה את התפרים (כלומר, המשונן, הקורלית והמדואיד) של הגולגולת על הcalvaria החשופה.
9. חדרו עם קצה המיקרומספריים בערך 2 מ מ"מ מאחורי התפר של המדוגת והפוך לחתך ישר לצידו.
10. הכנס את קצה המיקרו-מספריים. שבצד האחורי של הגולגולת לחתוך ישר לאורך הצד המרוחק של. התפר המקצץ כלפי תפר העור תמשיך באופן דומה עם. התפר השני של המדוגד
11. לעשות חתך נוסף (בזווית 45 °) כדי לחבר את סוף החתך עשה עם החתך של הפונפונטיין הקדמי.
12. חזור על שלבים 1.10 ו-1.11 עם התפר השני של המדואיד.
    הערה: חשוב לזהות את התפרים כדי לבצע חתכים מתאימים ולהיות מסוגל לבצע הטבעה נאותה וניתוח נתונים.
13. השתמש מלקחיים טיפ עדין כדי להסיר את הcalvaria ולמקם אותו בצלחת פטרי. עם אזמל, הפוך את החלק הישר מפונפונטיין האחורי לאורך התפר המשונן דרך תפר הקורונולי, והסתיים בפונפונטיין הקדמי כדי להשיג שתי מוצרים של חמי-קלוריאס.
14. הרימו את המי-קלוריון עם הפינצטה העדינה והניחו אותם בצלחת פטרי חדשה המכילה את ה-PBS.

2. תרבות Calvaria

1. הוסף 1 מ ל של הגלוקוז גבוהה DMEM בינונית בתוספת 0.1% בסרום שור (BSA) ו 1% אנטיביוטי/antimycotic (כלומר, פניצילין ו-סטרפטומיצין) בבארות של הצלחת 24 הבאר. עם מלקחיים טיפ דק, להרים כל המי-calvaria ולמקם אותו בבאר.
   הערה: הניחו את האלה מימין לקצה הקמור.
2. מודטה את המי-calvarias עבור 24 h ב 37 ° צ' עם 5% CO₂.
3. הסר את מדיום התרבות מכל באר והוסף 1 מ ל של מדיה חדשה המכילה את המתחם לבדיקה או מדיה ממוזגת מתאים אחרים.
   הערה: השתמש לפחות שלושה חמי-קלוריון עבור כל קבוצת טיפולים והשתמש בפקדים חיוביים ושליליים.
4. במשך 7 ימים, משנה את התקשורת. כל 2-3 ימים

3. תרבות עם תאים סרטניים

1. בחר צלחת פטרי עם תאים סרטניים ב 80-90% המפגש והטריזיזציה. כדי טריזיציזציה, לשטוף את התאים הסרטניים 1x באמצעות ה-PBS (5 מ"ל לכל 75 ס מ² בקבוקון) ואחריו דגירה בתמיסה HBSS המכילה 0.05% טריפסין ו 0.53 MM edta (2 מ"ל לכל 75 ס מ² בקבוקון).
2. להעביר את ההשעיה התא לתוך 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. הסר והשמט את הסופרנטאנט.
4. השהה מחדש את הגלולה ב-2 מ ל של DMEM המכיל 2% סרום של שור עוברי (FBS) ו 1% אנטיביוטי/antimycotic. . לספור תאים חיים
5. הקצאת חמי-calvarias לכל קבוצת לימוד (כלומר, השליטה השלילית וקבוצת התרבות של ה-RNA או ניתוח היסטולוגיה).
6. הסר את מדיית התרבות של המי-calvarias ולהוסיף 1 mL של DMEM המכיל 2% FBS ו 1% אנטיביוטי/antimycotic בתוספת או לא בתוספת עם תאים סרטניים.
   הערה: כמות התאים שיש להוסיף יכולה להשתנות בהתאם לקו התאים שנבדק. עם תאים סרטניים כמו מד א-מגה-בתים-231 או PC-3, 500,000 תאים לכל עבודה בצורה נאותה.
7. דגירה עבור 24 h ב 37 ° צ' עם 5% CO₂. להעביר כל המי-calvaria כדי באר חדשה כדי לשמור רק תאים סרטניים שדבקה לרקמת העצם.
8. דגירה של 7 ימים ב 37 ° צ' עם 5% CO₂ ולשנות את התקשורת כל 2-3 ימים.

4. קיבעון

1. חותכים את הריבועים של נייר טישו לעטוף את המי-קלוריון.
   הערה: ביופסיה רפידות קצף או כמוסות פלדה עבור ביופסיות קטנות יכול לשמש גם.
2. השתמש ישר מלקחיים עצה בסדר כדי להרים כל המי-calvaria מן התפר משונן, מקום על נייר טישו, ולעטוף.
3. הצב את המי העטוף-calvaria בתוך קלטת הטבעה בתווית.
4. הצב את הקלטת לתוך מכולה עם מאגר באגירה של 10% פוספט.
5. תיקון עבור 24 שעות ב -4 ° c.

5. דאלציפיקציה

1. להסיר את formalin, להוסיף 1x PBS, ו מתפרעים את הרקמות עבור 30 דקות כדי לשטוף את המי-calvarias.
2. הסר את ה-PBS והוסף 10% EDTA (pH = 8, 0.34 M).
   הערה: ודא שהפתרון מכסה את הרקמות לחלוטין.
3. Decalcify הרקמות עבור 48 h ב 4 ° c.
4. להיפטר פתרון EDTA ולהוסיף 1x PBS לשטוף את הרקמה.
5. לאחסן את המי-calvarias ב 70% אתנול עד עיבוד היסטולוגיה.

6. עיבוד רקמה

1. מייבשים את הרקמות עם סיבובים של 96% אתנול, 60 דקות (3x), ואחריו 100% אתנול, 60 מינימום (3x).
2. החלף את האתנול על ידי 100% xylene, 60 דקות (3x).
3. מודטה את הקלטות בשעווה פרפין, 60 דקות (2x).

7. הטבעה

1. פתחו את הקלטות, הוציאו בזהירות את נייר הטישו והסירו את העטיפה מcalvaria.
2. להרים כל calvaria בזהירות לערום את כל המי-calvarias מאותה קבוצה באותו אוריינטציה.
3. . שים פרפין בתבנית
4. לאסוף את כל המי-calvarias עם מלקחיים ולמקם אותם בתוך העובש עם תפר משונן למטה לכיוון הבסיס של העובש.
   הערה: התמצאות של המי-calvarias בתבנית במהלך ההכללה היא חיונית להשגת מקטעים היסטלוגיים עקביים ותוצאות מיושנות משום שהכוונה זו תאפשר זיהוי אחורי של העצמות הקדמיות והקודקודית מהקלווריון והתפר הקורולי מסייע להערכה הכמותית.
5. שחררו את הלקחיים וודאו שה "נשארים במקומם.
6. מניחים את הקלטת עם תווית על גבי העובש וממלאים אותו עם פרפין יותר כדי לכסות את המי-calvarias.
7. הזיזו את התבניות למשטח הקריר.

8. המשך המכירה

1. לקצץ 500-600 יקרומטר של תפר משונן עם microtome.
2. חותכים 4 יקרומטר סעיפים עבים, ולאסוף את הסעיפים הדרושים.
3. קצץ עוד 300 μm.
4. לגזור ולאסוף עוד שישה 4 יקרומטר חלקים עבים.
5. חתוך את הבלוק 300 יקרומטר עוד ולאסוף סעיפים נוספים.
6. הר את הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
7. יבש את השקופיות ב-RT.

9. צביעת מיכל

1. לטבול את הסעיפים ב 100% קסילין עבור 3 דקות.
2. לטבול 100% אתנול עבור 1 דקות.
3. מיזוג ב-96% אתנול עבור 1 דקות.
4. לטבול ב 80% אתנול עבור 1 דקות.
5. לטבול 70% אתנול עבור 1 דקות.
6. שטפו במים במשך 3 דקות.
7. לטבול במטאוקסילין במשך 3 דקות
8. שטפו במים עד שהחלק ברור.
9. לטבול פתרון ליתיום פחמתי רווי עבור 10 שניות.
10. שטפו במים במשך 3 דקות.
11. לטבול 96% אתנול עבור 1 דקות.
12. לטבול באאוזין עבור 3 דקות.
13. לטבול ב 96% אתנול עבור 1 דקות.
14. לטבול 100% אתנול עבור 1 דקות.
15. לטבול 100% קסילן עבור 3 דקות.
16. הוסף מספר בינוני להרכבה על ההרכבה לשקופית והגן עליו באמצעות שמיכות.
    הערה: אתה יכול להשלים את המטאוקסיקו ואת אאוזין (H & E) הצביעת עם החומצה העמידים tartrate חומצות (מלכודת) מכתים להעריך אוסטאוקלסט ו אוסטאופוליזיס.

10. הערכה כמותית: הגדרת שטח לניתוח

1. בדוק את הסעיפים תחת צריכת חשמל נמוכה (כלומר 4x) כדי לזהות את הכיוון ואת התפרים.
2. הגדירו את התפר הפנימי ולזהות את משטח העצם הארוך בצד אחד ואת המשטח הקצר בצד השני.
3. זהה את התפר הפנימי מתחת להגדלה של 40x, והעבר שניים או שלושה שדות אופטיים הרחק מהתפר לאורך המשטח הארוך. לכידת תמונות של אזור זה לצורך ניתוח.
4. הגדירו את אזור העצם הישן. ואת אזור העצמות החדש אאוזין Y עם כתום G כתמי את העצם הישן כהה יותר מצית העצם החדש.
5. מדוד את אזור העצם הכולל של העצם הישן והחדש עם תוכנת תמונה J באמצעות הכלי סף צבע. בטא את התוצאות כ-יקרומטר².

11. ניתוח מידע

1. נתח את התוצאות באמצעות תוכנה סטטיסטית. הבדלים משמעותיים בין קבוצות ניתן לקבוע באמצעות בדיקות המתאימות (למשל, מבחן לא פרמטרית מאן-וויטני U כפי שהוא עשה herel).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להעריך את היווצרות העצם במודל כיפת, טיפצנו את המי-קלווריון במדיה עם או בלי 50 μg/mL של אינסולין. מקטעי רקמות היו מוכנים מוכתם עם H & E. בתנאים אלה, היסטולוגיה הראו כי השלמות המבנית של עצם הקאלוריון נשמרה ומאפשרת זיהוי של מרכיביה השונים (איור 1). הקלווריון שטו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור מודל vivo לשעבר כיפת להערכת היווצרות העצם או ספיגת וללמוד את האינטראקציות של תאים סרטניים עם עצם העכבר כיפת. הצעדים הקריטיים של טכניקה זו הם הניתוח, התרבות, ההטבעה, ו היפוסטומיטריקל אנליזה של calvarias. במהלך הניתוח של calvarias, זה חיוני לחתוך את המי-calvarias לתוך ט?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well cell culture	Corning	CLS3524
24 well non tissue culture	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotics-Antimycotic	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifugue	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
Coverslips	Corning	2935-24X50
Cytoseal resin	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolute	JALMEK	E5325-17P
Fetal Bovine Serum	Biowest	BIO-S1650-500
Filters	Corning	CLS431229
Forceps and scissors	LANCETA HG	74165
Formalin buffered 10%	Sigma	HT501320
Glass slides 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
High profile blades	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin from bovine pancreas	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mouse food, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffin Section Flotation Bath	Electrothermal	MH8517X1
Petri dish	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wax dispenser	Electrothermal	MH8523BX1
Xylene	Golden	534056-500ML