Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Riepilogo

La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.

Abstract

L'osso è un tessuto connettivo costituito da osteoblasti, osteociti e osteoclasti e una matrice extracellulare mineralizzata, che gli conferisce la sua forza e flessibilità e gli permette di svolgere le sue funzioni. L'osso è continuamente esposto a una varietà di stimoli, che in condizioni patologiche possono deregolare il rimodellamento osseo. Per studiare biologia e malattie ossee e valutare potenziali agenti terapeutici, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo.

Questo manoscritto descrive il processo di dissezione e le condizioni di coltura dei calvarias isolati dai topi neonemici per studiare la formazione ossea e il microambiente tumorale osseo. A differenza dei modelli in vitro e in vivo, questo modello ex vivo consente la conservazione dell'ambiente tridimensionale del tessuto e della diversità cellulare dell'osso durante la coltura in condizioni definite per simulare il microambiente desiderato. Pertanto, è possibile studiare il rimodellamento osseo e i suoi meccanismi, nonché le interazioni con altri tipi di cellule, come le interazioni tra cellule tumorali e ossa.

I saggi qui riportati usano calvarias da topi BALB/C di 5-7 giorni. Le emi-calvarias ottenute sono coltivate in presenza di insulina, cellule del cancro al seno (MDA-MB-231), o mezzo condizionato dalle colture di cellule del cancro al seno. Dopo l'analisi, è stato stabilito che l'insulina ha indotto nuova formazione ossea, mentre le cellule tumorali e il loro rinnovano osseo medio condizionato. Il modello calvariale è stato utilizzato con successo nella ricerca di base e applicata per studiare lo sviluppo osseo e le malattie ossee indotte dal cancro. Nel complesso, è un'opzione eccellente per un saggio facile, informativo e a basso costo.

Introduzione

L'osso è un tessuto connettivo dinamico che ha diverse funzioni, tra cui sostenere i muscoli, proteggere gli organi interni e il midollo osseo, e immagazzinare e rilasciare calcio e fattori di crescita^1,2. Per mantenere la sua integrità e la corretta funzione, il tessuto osseo è continuamente sotto il processo di rimodellamento. In termini generali, un ciclo di rimodellamento osseo può essere diviso in risorsurare l'osso e la formazione ossea¹. Uno squilibrio tra queste due fasi di rimodellamento osseo può portare allo sviluppo di patologie ossee. Inoltre, malattie come il cancro al seno spesso influenzano l'integrità ossea; circa il 70% dei pazienti in stadi avanzati ha o avrà metastasi ossee. Quando le cellule del cancro al seno entrano nelle ossa, influenzano il metabolismo osseo, con conseguente eccessiva riinstallazione (lesioni osteoclastiche) e/o formazione (lesioni osteoblastiche)³.

Per comprendere la biologia delle malattie ossee e sviluppare nuovi trattamenti, è necessario comprendere i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo. Nella ricerca sul cancro, è essenziale studiare il processo di metastasi ossea e la sua relazione con il microambiente metastatico. Nel 1889, Stephen Paget ipotizzò che le metastasi si verificano quando c'è compatibilità tra le cellule tumorali e il tessuto bersaglio, e suggerì che il sito metastatico dipende dall'affinità del tumore per il microambiente⁴. Nel 1997, Mundy e Guise hanno introdotto il concetto di "circolo vizioso delle metastasi ossee" per spiegare come le cellule tumorali modificano il microambiente osseo per raggiungere la loro sopravvivenza e crescita, e come il microambiente osseo promuove la loro crescita fornendo fattori di calcio e crescita^5,6,7.

Per caratterizzare i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo e nella metastasi ossea e per valutare le molecole con un possibile potenziale terapeutico, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo. Tuttavia, questi modelli presentano attualmente molte limitazioni, come la rappresentazione semplificata del microambiente osseo, e il loro costo^8,9. La coltura degli espiatori ossei ex vivo ha il vantaggio di mantenere l'organizzazione tridimensionale e la diversità delle cellule ossee. Inoltre, le condizioni sperimentali possono essere controllate. I modelli espiantanti includono la coltura delle ossa metatarsale, teste femorali, calvarias, e nuclei mandibolari o trabecolari¹⁰. I vantaggi dei modelli ex vivo sono stati dimostrati in diversi studi. Nel 2009, Nordstrand e collaboratori hanno riferito l'istituzione di un modello di cocultura basato sulle interazioni tra le cellule tumorali ossee e prostata¹¹. Inoltre, nel 2012, Curtin e collaboratori hanno riportato lo sviluppo di un modello tridimensionale utilizzando coculture ex vivo ¹². Lo scopo di tali modelli ex vivo è quello di ricreare le condizioni del microambiente osseo nel modo più accurato possibile per poter caratterizzare i meccanismi coinvolti nel normale o patologico rimodellamento osseo e valutare l'efficacia di nuovi agenti terapeutici.

Il presente protocollo si basa sulle procedure pubblicate da Garrett¹³ e Mohammad et^al. Le colture neovari chevariate di calvaria topo sono state utilizzate come modello sperimentale, in quanto conservano l'architettura tridimensionale dell'osso in fase di sviluppo e cellule ossee, comprese le cellule in tutte le fasi di differenziazione (cioè osteoblasti, osteoclasti, osteociti, cellule stromali) che portano a osteoclasti maturi e osteoblasti, nonché alla matrice minerale^14. Il modello ex vivo non rappresenta totalmente il processo patologico delle malattie ossee. Tuttavia, gli effetti sul rimodellamento osseo o sull'osteolisi ossea indotta dal cancro possono essere misurati con precisione.

In breve, questo protocollo consiste nei seguenti passaggi: la dissezione dei calvarias da topi vecchi di 5-7 giorni, precoltura calvaria, applicazioni di coltura calvaria (ad esempio, coltura in presenza di insulina, cellule tumorali o mezzi condizionati, e persino agenti con potenziale terapeutico, secondo lo scopo dell'indagine), fissazione ossea e decalcificazione calvaria, elaborazione dei tessuti, analisi istologica e interpretazione dei risultati.

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Protocollo

Tutti i topi utilizzati in questi saggi sono stati ottenuti da ceppi di topi BALB/c, usando indiscriminatamente topi maschi e femmine. Precedenti esperimenti di coltura sono stati eseguiti anche utilizzando altri ceppi, come FVB, topi svizzeri, CD-1 e mouse CsA^11,12,14. Tutti i topi sono stati ospitati secondo le linee guida dei National Institutes of Health (NIH), le procedure dell'Appendice Q. che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) presso il Center for Scientific Research and Higher Education di Ensenada (CICESE).

1. Dissezione calvariale

1. Sterilizzare gli strumenti di dissezione (ad esempio, 1 x 2 pinze del tessuto dei denti, forbici chirurgiche dritte, forbici dissecistrici, pinzette con punta fine, pinze di dissezione con punta fine, pinze dissetiche, bisturi). L'acqua distillata sterile può essere utilizzata per pulire gli strumenti chirurgici tra ogni dissezione, e sterile 1x PBS può essere utilizzato per la pulizia di ogni emi-calvaria.
2. Posizionare gli strumenti di dissezione sterili, l'acqua, l'1x PBS e i materiali necessari per eseguire la procedura (ad esempio, micropipette, bicchieri precipitati, piatti Petri sterili) in un cappuccio a flusso laminare.
   NOTA: Eseguire l'intera procedura in condizioni sterili.
3. Aggiungere 12 mL di pbS sterile 1x in due piatti da 10 cm Petri.
4. Selezionare i cuccioli e posizionarli vicino al cofano.
   NOTA: Dissezionare i calvarias da cuccioli di 5-7 giorni.
5. Sollevare e tenere il mouse con attenzione utilizzando pinze di ssezione.
6. Decapitare il topo utilizzando forbici sezionate e mettere la testa in un piatto Petri con PBS.
   NOTA: La decapitazione non è adatta ai topi più anziani. Se l'esperimento deve essere fatto con topi più anziani, il metodo di eutanasia dovrebbe essere modificato secondo le regole della sperimentazione animale.
7. Tenere la testa saldamente per la zona del naso con 1 x 2 pinze del tessuto dei denti e rimuovere la pelle sopra il cranio fino a quando la calvaria è visibile.
8. Identificare le suture (ad esempio, sagittale, coronale e lambdoid) del cranio sulla calvaria esposta.
9. Penetrare con la punta dei microscissors circa 2 mm dietro la sutura lambdoid e fare un taglio dritto a fianco.
10. Inserire la punta dei microscissori sul lato posteriore del cranio. Fare un taglio dritto lungo il lato distale della sutura lambdoid verso la sutura coronale. Procedere in modo simile con l'altra sutura lambdoid.
11. Fare un altro taglio (con un angolo di 45 gradi) per collegare l'estremità del taglio realizzato con il taglio della fontanel anteriore.
12. Ripetere i passaggi 1.10 e 1.11 con l'altra sutura lambdoid.
    NOTA: è importante identificare le suture per effettuare tagli appropriati e per essere in grado di eseguire un'adeguata incorporazione e analisi dei dati.
13. Utilizzare pinze a punta fine per rimuovere la calvaria e metterla in un piatto Petri. Con un bisturi, fai un taglio dritto dalla fontanella posteriore lungo la sutura sagittale attraverso la sutura coronale e termina nella fontanel anteriore per ottenere due emi-calvarias.
14. Raccogliere ciascuna delle emi-calvarias con le pinzette a punta fine e metterle in una nuova teglia Petri contenente PBS.

2. Cultura calvaria

1. Aggiungere 1 mL di medio DMEM ad alto glucosio integrato con 0.1% di albumina di siero bovino (BSA) e 1% antibiotico/antimicotico (cioè, penicillina e streptomicina) nei pozzi di una piastra di 24 pozze. Con pinze a punta fine, raccogliere ogni emi-calvaria e metterlo in un pozzo.
   NOTA: Mettere il lato concavo emi-calvarias verso il basso.
2. Incubare le emi-calvarias per 24 h a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂.
3. Rimuovere il supporto di coltura da ogni pozzo e aggiungere 1 mL di supporti freschi contenenti il composto per testare o condizionato supporto da altre celle.
   NOTA: Utilizzare almeno tre emi-calvarias per ciascun gruppo di trattamento e controlli negativi e positivi.
4. Incubare le emi-calvarias per 7 giorni, cambiando i media ogni 2-3 giorni.

3. Coltura con cellule tumorali

1. Selezionare un piatto Petri con cellule tumorali a 80-90% confluenza e provare a provarli. Per provare, lavare le cellule tumorali 1x utilizzando PBS (5 mL per 75 cm² fiaschetta) seguito da incubazione in una soluzione HBSS contenente 0,05% di trypsin e 0,53 mM EDTA (2 mL per 75 cm² fiaschetta).
2. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
3. Rimuovere e scartare il super-natante.
4. Risospendere il pellet in 2 mL di DMEM contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico/antimicotico. Contare le cellule vive.
5. Assegnare emi-calvarias a ciascun gruppo di studio (cioè il gruppo di controllo e cocultura negativo per l'RNA o l'analisi istologica).
6. Rimuovere i mezzi di coltura dall'emi-calvarias e aggiungere 1 mL di DMEM contenente 2% FBS e 1% antibiotico/antimicotico integrato o non integrato con cellule tumorali.
   NOTA: la quantità di celle da aggiungere può cambiare a seconda della linea della cella testata. Con le cellule tumorali come MDA-MB-231 o PC-3, 500.000 cellule per bene funzionano in modo appropriato.
7. Incubare per 24 h a 37 gradi centigradi con 5% di CO₂. Passare ogni emi-calvaria in un nuovo pozzo per trattenere solo le cellule tumorali che hanno aderito al tessuto osseo.
8. Incubare per 7 giorni a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ e cambiare i media ogni 2-3 giorni.

4. Fissazione

1. Tagliare quadrati di carta velina per avvolgere le emi-calvarias.
   NOTA: Possono essere utilizzati anche cuscinetti in schiuma biopsia o capsule d'acciaio per piccole biopsie.
2. Utilizzare pinze dritte a punta fine per raccogliere ogni emi-calvaria dalla sutura sagittale, posizionare su una carta velina e avvolgere.
3. Posizionare l'emi-calvaria avvolto all'interno di una cassetta di incorporamento etichettata.
4. Collocare la cassetta in un contenitore con formalina tampone di fosfato al 10%.
5. Fissare per 24 h a 4 gradi centigradi.

5. Decalcificazione

1. Rimuovere la formalina, aggiungere 1x PBS e agitare i tessuti per 30 min per sciacquare le emi-calvarias.
2. Rimuovere il PBS e aggiungere 10% EDTA (pH - 8, 0,34 M).
   NOTA: verificare che la soluzione copra completamente i tessuti.
3. Decalcificare i tessuti per 48 h a 4 gradi centigradi.
4. Eliminare la soluzione EDTA e aggiungere 1x PBS per sciacquare il tessuto.
5. Conservare le emi-calvarias nel 70% di etanolo fino all'elaborazione istologica.

6. Lavorazione dei tessuti

1. Disidratare i tessuti con giri del 96% di etanolo, 60 min (3x), seguiti da 100% etanolo, 60 min (3x).
2. Sostituire l'etanolo con 100% xilene, 60 min (3x).
3. Incubare le cassette in cera di paraffina, 60 min (2x).

7. Incorporamento

1. Aprire le cassette, rimuovere con cura la carta velina e srotolare il calvaria.
2. Raccogliere ogni calvaria con attenzione e impilare tutte le emi-calvarias dello stesso gruppo nello stesso orientamento.
3. Mettere un po 'di paraffina in uno stampo.
4. Raccogliere tutte le emi-calvarias con le pinze e metterle all'interno dello stampo con la sutura sagittale verso la base dello stampo.
   NOTA: L'orientamento degli emi-calvarias nello stampo durante l'inclusione è fondamentale per ottenere sezioni istologiche coerenti e risultati riproducibili perché questo orientamento consentirà l'identificazione posteriore delle ossa anteriori e parietali dai calvarias e la sutura coronale che facilita la valutazione quantitativa.
5. Rilasciare le pinze e verificare che le emi-calvarias rimangano al loro posto.
6. Posizionare la cassetta etichettata sopra lo stampo e riempirla con più paraffina per coprire le emi-calvarias.
7. Spostare gli stampi sulla superficie fredda.

8. Sezionamento

1. Tagliare 500-600 m di sutura sagittale con il microtoma.
2. Tagliare 4 sezioni spesse 4 m e raccogliere le sezioni necessarie.
3. Tagliare altri 300 m.
4. Tagliare e raccogliere altri sei sezioni spesse 4 m.
5. Tagliare ulteriormente il blocco di 300 m e raccogliere altre sezioni.
6. Montare le sezioni su vetrini al microscopio in vetro.
7. Asciugare i vetrini a RT.

9. Colorazione

1. Immergi le sezioni in xilene al 100% per 3 min.
2. Sommergi in etanolo al 100% per 1 min.
3. Unire nel 96% etanolo per 1 min.
4. Immergere nell'80% di etanolo per 1 min.
5. Immergere nel 70% di etanolo per 1 min.
6. Risciacquare in acqua per 3 min.
7. Immergere in ematossitale per 3 min.
8. Sciacquare in acqua fino a quando la sezione è libera.
9. Sommerso in una soluzione di carbonato di litio satura per 10 sec.
10. Risciacquare in acqua per 3 min.
11. Sommergi in 96% etanolo per 1 min.
12. Sommerse in eosina per 3 min.
13. Immergere nel 96% di etanolo per 1 min.
14. Sommergi in etanolo al 100% per 1 min.
15. Sommergi lo xilene al 100% per 3 min.
16. Aggiungere un po 'per supporto di montaggio al vetrino e proteggerlo con un coperchio.
    NOTA: È possibile completare la colorazione ematossina ed eosina (H&E) con colorazione fosfosciasi acida resistente alla crostata (TRAP) per valutare l'osteoclasta e l'osteolisi.

10. Valutazione quantitativa: definizione delle aree di analisi

1. Esaminare le sezioni a bassa potenza (ad esempio, 4x) per identificare l'orientamento e le suture.
2. Definire la sutura coronale e identificare la lunga superficie ossea da un lato e la superficie corta dall'altro.
3. Identificare la sutura coronale sotto l'ingrandimento di 40x e allontanare due o tre campi ottici dalla sutura lungo la superficie lunga. Acquisire immagini di quest'area per l'analisi.
4. Definire la vecchia area ossea e la nuova area ossea. L'eosin A Y con G arancione macchia il vecchio osso più scuro e il nuovo osso più chiaro.
5. Misurare l'area totale dell'osso del vecchio e del nuovo osso con il software Image J utilizzando lo strumento di soglia del colore. Esprimi i risultati come m².

11. Analisi dei dati

1. Analizzare i risultati utilizzando un software statistico. Le differenze significative tra i gruppi possono essere determinate utilizzando test appropriati (ad esempio, test Non parametrico Mann-Whitney U come viene fatto qui).

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Risultati

Per valutare la formazione ossea nel modello calvariale, abbiamo coltivato le emi-calvarias nei media con o senza 50 g/mL di insulina. Le sezioni dei tessuti sono state preparate e macchiate di H&E. In queste condizioni, l'istologia ha dimostrato che l'integrità strutturale dell'osso calvariale è stata mantenuta, consentendo l'identificazione dei suoi diversi componenti (Figura 1). Le calvarias trattate con insulina presentavano un aumento della quantità d...

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Discussione

Qui, descriviamo il protocollo per un modello di ex vivo calvariale per valutare la formazione o il risurrezione ossea e per studiare le interazioni delle cellule tumorali con l'osso cavariale del topo. I passaggi critici di questa tecnica sono la dissezione, la cultura, l'incorporamento e l'analisi istomormetrica dei calvarias. Durante la dissezione delle calvarias, è fondamentale tagliare le emi-calvarias in un trapezio, in quanto faciliterà fortemente l'orientamento durante l'inclusione della paraffina. Qua...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well cell culture	Corning	CLS3524
24 well non tissue culture	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotics-Antimycotic	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifugue	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
Coverslips	Corning	2935-24X50
Cytoseal resin	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolute	JALMEK	E5325-17P
Fetal Bovine Serum	Biowest	BIO-S1650-500
Filters	Corning	CLS431229
Forceps and scissors	LANCETA HG	74165
Formalin buffered 10%	Sigma	HT501320
Glass slides 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
High profile blades	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin from bovine pancreas	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mouse food, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffin Section Flotation Bath	Electrothermal	MH8517X1
Petri dish	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wax dispenser	Electrothermal	MH8523BX1
Xylene	Golden	534056-500ML