Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

Resumo

A cultura ex vivo de explantas ósseas pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia óssea e a avaliação potencial de medicamentos na remodelagem óssea e doenças ósseas. O protocolo apresentado descreve a preparação e a cultura de calvarias isoladas de crânios de camundongos recém-nascidos, bem como suas aplicações.

Resumo

Osso é um tecido conjuntivo constituído de osteoblastos, osteócitos e osteoclastos e uma matriz extracelular mineralizada, o que lhe dá sua força e flexibilidade e permite que ele cumpra suas funções. O osso é continuamente exposto a uma variedade de estímulos, que em condições patológicas podem desregulamentar a remodelagem óssea. Para estudar biologia óssea e doenças e avaliar potenciais agentes terapêuticos, é necessário desenvolver modelos in vitro e in vivo.

Este manuscrito descreve o processo de dissecção e as condições de cultura das calvarias isoladas dos camundongos neonatais para estudar a formação óssea e o microambiente do tumor ósseo. Em contraste com os modelos in vitro e in vivo, este modelo ex vivo permite a preservação do ambiente tridimensional do tecido, bem como a diversidade celular do osso enquanto cultura condições definidas para simular o microambiente desejado. Assim, é possível investigar a remodelagem óssea e seus mecanismos, bem como as interações com outros tipos de células, como as interações entre células cancerígenas e osso.

Os ensaios aqui relatados usam calvarias de ratos BALB/C de 5 a 7 dias de idade. As hemi-calvarias obtidas são cultivadas na presença de insulina, células cancerígenas de mama (MDA-MB-231), ou meio condicionado a partir de culturas de células cancerígenas de mama. Após análise, foi estabelecido que a insulina induziu nova formação óssea, enquanto as células cancerosas e sua reabsorção óssea média condicionada. O modelo calvarial tem sido usado com sucesso em pesquisas básicas e aplicadas para estudar o desenvolvimento ósseo e doenças ósseas induzidas pelo câncer. No geral, é uma excelente opção para um ensaio fácil, informativo e de baixo custo.

Introdução

O osso é um tecido conjuntivo dinâmico que possui várias funções, incluindo apoiar os músculos, proteger os órgãos internos e a medula óssea, e armazenar e liberar fatores de cálcio e crescimento^1,2. Para manter sua integridade e função adequada, o tecido ósseo está continuamente o processo de remodelação. Em termos gerais, um ciclo de remodelagem óssea pode ser dividido em reabsorção óssea e formação óssea¹. Um desequilíbrio entre essas duas fases de remodelagem óssea pode levar ao desenvolvimento de patologias ósseas. Além disso, doenças como o câncer de mama geralmente afetam a integridade óssea; aproximadamente mais de 70% dos pacientes em estágio avançado têm ou terão metástases ósseas. Quando as células cancerígenas de mama entram nos ossos, elas afetam o metabolismo ósseo, resultando em reabsorção excessiva (lesões osteoclásticas) e/ou formação (lesões osteoblásticas)³.

Para entender a biologia das doenças ósseas e desenvolver novos tratamentos, é necessário compreender os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea. Na pesquisa do câncer, é essencial investigar o processo de metástase óssea e sua relação com o microambiente metastático. Em 1889, Stephen Paget supôs que as metástases ocorrem quando há compatibilidade entre as células tumorais e o tecido alvo, e sugeriu que o local metastático depende da afinidade do tumor para o microambiente⁴. Em 1997, Mundy e Guise introduziram o conceito de "ciclo vicioso de metástases ósseas" para explicar como as células tumorais modificam o microambiente ósseo para alcançar sua sobrevivência e crescimento, e como o microambiente ósseo promove seu crescimento fornecendo cálcio e fatores de crescimento^5,6,7.

Para caracterizar os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea e na metástase óssea e avaliar moléculas com potencial terapêutico possível, é necessário desenvolver modelos in vitro e in vivo. No entanto, esses modelos apresentam atualmente muitas limitações, como a representação simplificada do microambiente ósseo, e seu custo^8,9. A cultura das explantas ósseas ex vivo tem a vantagem de manter a organização tridimensional, bem como a diversidade de células ósseas. Além disso, as condições experimentais podem ser controladas. Os modelos de explante incluem a cultura de ossos metatarsos, cabeças femorais, calvarias e núcleos mandibulares ou trabeculares¹⁰. As vantagens dos modelos ex vivo têm sido demonstradas em diversos estudos. Em 2009, Nordstrand e colaboradores relataram o estabelecimento de um modelo de cocultura baseado nas interações entre células cancerígenas ósseas e de próstata¹¹. Além disso, em 2012, Curtin e colaboradores relataram o desenvolvimento de um modelo tridimensional utilizando coculturas ex vivo ¹². O objetivo desses modelos ex vivo é recriar as condições do microambiente ósseo com a maior precisão possível para poder caracterizar os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea normal ou patológica e avaliar a eficácia de novos agentes terapêuticos.

O presente protocolo baseia-se nos procedimentos publicados por Garrett¹³ e Mohammad et al.¹⁴. Culturas de calvaria neonatal do rato têm sido utilizadas como modelo experimental, pois mantêm a arquitetura tridimensional do osso em desenvolvimento e células ósseas, incluindo células em todos os estágios de diferenciação (ou seja, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, osteócitos, células estrômicas) que levam a osteoclastos maduros e osteoblastos, bem como a matriz mineralizada¹⁴. O modelo ex vivo não representa totalmente o processo patológico das doenças ósseas. No entanto, os efeitos na remodelagem óssea ou na osteólise óssea induzida pelo câncer podem ser medidos com precisão.

Resumidamente, este protocolo consiste nas seguintes etapas: dissecção de calvarias de camundongos de 5 a 7 dias de idade, pré-cultura calvariada, aplicações de cultura calvariada (por exemplo, cultura na presença de insulina, células cancerosas ou meio condicionado, e até mesmo agentes com potencial terapêutico, segundo o objetivo da investigação), fixação óssea e decalcificação da calvaria, processamento de tecidos, análise histológica e interpretação de resultados.

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Protocolo

Todos os camundongos utilizados nesses ensaios foram obtidos de cepas de camundongos BALB/C, utilizando camundongos machos e fêmeas indiscriminadamente. Experimentos culturais anteriores também foram realizados utilizando outras cepas, como FVB, camundongos suíços, CD-1 e csA mice^11,12,14. Todos os camundongos foram alojados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH), o apêndice Q. Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais (IACUC) do Centro de Pesquisa Científica e Ensino Superior da Ensenada (CICESE).

1. Dissecção calvarial

1. Esterilizar instrumentos de dissecção (por exemplo, 1 x 2 fórceps de tecido dentário, tesoura cirúrgica reta, tesoura dissecando, pinças de ponta fina, pinças curvas finas dissecando fórceps, cocendo fórceps, bisturi). Água destilada estéril pode ser usada para limpar as ferramentas cirúrgicas entre cada dissecção, e 1x PBS estéril pode ser usado para limpar cada hemi-calvaria.
2. Coloque os instrumentos de dissecção estéreis, água, 1x PBS, e materiais necessários para realizar o procedimento (por exemplo, micropipetas, copos precipitados, placas de Petri estéreis) em uma capa de fluxo laminar.
   NOTA: Realize todo o procedimento em condições estéreis.
3. Adicione 12 mL de 1x PBS estéril em duas placas de Petri de 10 cm.
4. Selecione os filhotes e coloque-os perto do capô.
   NOTA: Dissecar as calvarias de filhotes de 5 a 7 dias de idade.
5. Escolha e segure o mouse cuidadosamente usando fórceps de dissecar.
6. Decapite o mouse usando uma tesoura de dissecação e coloque a cabeça em uma placa de Petri com PBS.
   NOTA: A decapitação não é adequada para ratos mais velhos. Se o experimento deve ser feito com camundongos mais velhos, o método da eutanásia deve ser modificado de acordo com as regras de experimentação animal.
7. Segure a cabeça firmemente pela área do nariz com 1 x 2 fórceps de tecido dentário e remova a pele sobre o crânio até que a calvaria seja visível.
8. Identifique as suturas (ou seja, sagittal, coronal e lambdoide) do crânio na calvária exposta.
9. Penetre com a ponta da microtesoura aproximadamente 2 mm atrás da sutura lambdoide e faça um corte reto ao lado.
10. Insira a ponta da microtesoura na parte traseira do crânio. Faça um corte reto ao longo do lado distal da sutura lambdoide em direção à sutura coronal. Proceda da mesma forma com a outra sutura lambdoide.
11. Faça outro corte (em um ângulo de 45°) para conectar a extremidade do corte feito com o corte do fontanel anterior.
12. Repita as etapas 1.10 e 1.11 com a outra sutura lambdoide.
    NOTA: É importante identificar as suturas para fazer cortes adequados e ser capaz de realizar a incorporação adequada e a análise dos dados.
13. Use fórceps de ponta fina para remover a calvaria e coloque-a em uma placa de Petri. Com um bisturi, faça um corte reto do fontanel posterior ao longo da sutura sagital através da sutura coronal e terminando no fontanel anterior para obter duas hemi-calvarias.
14. Pegue cada uma das hemi-calvarias com as pinças de ponta fina e coloque-as em uma nova placa de Petri contendo PBS.

2. Cultura calvariada

1. Adicione 1 mL de médio DMEM de alta glicose suplementado com albumina de soro bovino de 0,1% (BSA) e 1% antibiótico/antimicótico (ou seja, penicilina e estreptomicina) nos poços de uma placa de 24 poços. Com fórceps finos, pegue cada hemi-calvaria e coloque-o em um poço.
   NOTA: Coloque o lado côncavo hemi-calvarias para baixo.
2. Incubar as hemi-calvarias por 24 h a 37 °C com 5% de CO₂.
3. Remova o meio de cultura de cada poço e adicione 1 mL de mídia fresca contendo o composto para testar ou condicionar a mídia de outras células.
   NOTA: Use pelo menos três hemi-calvarias para cada grupo de tratamento e use controles negativos e positivos.
4. Incubar as hemi-calvarias por 7 dias, mudando a mídia a cada 2-3 dias.

3. Cultura com células cancerígenas

1. Selecione uma placa de Petri com células cancerígenas a 80-90% de confluência e tente-as. Para trippsinizar, lave as células cancerígenas 1x usando PBS (5 mL por 75 cm² frasco) seguida de incubação em uma solução HBSS contendo 0,05% de tripsina e 0,53 mM EDTA (2 mL por 75 cm² frasco).
2. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
3. Remova e descarte o sobrenadante.
4. Resuspender a pelota em 2 mL de DMEM contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico/antimicótico. Conte células vivas.
5. Atribuir hemi-calvarias a cada grupo de estudo (ou seja, o grupo de controle negativo e cocultura para análise de RNA ou histologia).
6. Remova a mídia cultural das hemi-calvarias e adicione 1 mL de DMEM contendo 2% de FBS e 1% de antibiótico/antimicótico suplementado ou não com células cancerosas.
   NOTA: A quantidade de células a serem adicionadas pode mudar dependendo da linha celular testada. Com células cancerígenas como MDA-MB-231 ou PC-3, 500.000 células por poço funcionam adequadamente.
7. Incubar por 24 h a 37 °C com 5% de CO₂. Passe cada hemi-calvaria para um novo poço para reter apenas células cancerígenas que aderiram ao tecido ósseo.
8. Incubar por 7 dias a 37 °C com 5% de CO₂ e mudar a mídia a cada 2-3 dias.

4. Fixação

1. Corte quadrados de papel de tecido para embrulhar as hemi-calvarias.
   NOTA: Também podem ser utilizadas pastilhas de espuma de biópsia ou cápsulas de aço para pequenas biópsias.
2. Use pinças de ponta fina reta para pegar cada hemi-calvaria da sutura sagital, coloque em um papel de tecido e enrole.
3. Coloque a hemi-calvaria embrulhada dentro de um de incorporação rotulado.
4. Coloque o em um recipiente com 10% de formalina tamponada com fosfato.
5. Fixe para 24 horas a 4 °C.

5. Decalcificação

1. Retire a formalina, adicione 1x PBS e agite os tecidos por 30 min para enxaguar as hemi-calvarias.
2. Remova o PBS e adicione 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M).
   NOTA: Verifique se a solução cobre completamente os tecidos.
3. Descalcificar os tecidos por 48 h a 4 °C.
4. Descarte a solução EDTA e adicione 1x PBS para enxaguar o tecido.
5. Guarde as hemi-calvarias em 70% de etanol até o processamento da histologia.

6. Processamento de tecidos

1. Desidratar os tecidos com rodadas de 96% de etanol, 60 min (3x), seguido por 100% etanol, 60 min (3x).
2. Substitua o etanol por 100% de xileno, 60 min (3x).
3. Incubar os em cera de parafina, 60 min (2x).

7. Incorporação

1. Abra as fitas, remova cuidadosamente o papel de tecido e desembrulhe a calvaria.
2. Pegue cada calvaria cuidadosamente e empilhe todas as hemi-calvarias do mesmo grupo na mesma orientação.
3. Coloque um pouco de parafina em um molde.
4. Pegue todas as hemi-calvarias com os fórceps e coloque-os dentro do molde com a sutura sagital para baixo em direção à base do molde.
   NOTA: A orientação das hemi-calvarias no molde durante a inclusão é crucial para obter seções histológicas consistentes e resultados reprodutíveis, pois essa orientação permitirá a identificação posterior dos ossos dianteiros e parietais das calvarias e a sutura coronal facilitando a avaliação quantitativa.
5. Solte os fórceps e verifique se as hemi-calvarias permanecem no lugar.
6. Coloque o rotulado em cima do molde e encha-o com mais parafina para cobrir as hemi-calvarias.
7. Mova os moldes para a superfície fria.

8. Secção

1. Corte 500-600 μm da sutura sagital com o microtome.
2. Corte seções de 4 μm de espessura e colete as seções necessárias.
3. Apare mais 300 μm.
4. Corte e colete outras seis seções de 4 μm de espessura.
5. Corte o bloco 300 μm mais e colete mais seções.
6. Monte as seções em lâminas de microscópio de vidro.
7. Seque os slides no RT.

9. Coloração

1. Mergulhe as seções em 100% de xileno por 3 min.
2. Submergir em 100% de etanol por 1 min.
3. Mesclar 96% de etanol por 1 min.
4. Mergulhe em 80% de etanol por 1 min.
5. Submergir em 70% de etanol por 1 min.
6. Enxágüe na água por 3 min.
7. Submergir em hematoxilina por 3 min.
8. Enxágüe na água até que a seção esteja limpa.
9. Mergulhe em uma solução saturada de carbonato de lítio por 10 segundos.
10. Enxágüe na água por 3 min.
11. Submergir em 96% de etanol por 1 min.
12. Submergir em eosinpor por 3 min.
13. Imersão em 96% de etanol por 1 min.
14. Submergir em 100% de etanol por 1 min.
15. Mergulhe em 100% de xileno por 3 min.
16. Adicione um pouco por meio de montagem ao slide e proteja-o com um deslizamento de cobertura.
    NOTA: Você pode complementar a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) com coloração de fosfatase ácida resistente à tartê (TRAP) para avaliar osteoclasto e osteólise.

10. Avaliação quantitativa: definição de área para análise

1. Examine as seções baixa potência (ou seja, 4x) para identificar a orientação e as suturas.
2. Defina a sutura coronal e identifique a superfície óssea longa de um lado e a superfície curta do outro.
3. Identifique a sutura coronal ampliação de 40x e mova dois ou três campos ópticos para longe da sutura ao longo da superfície longa. Capture imagens desta área para análise.
4. Defina a área óssea antiga e a nova área óssea. O eosinY com G laranja mancha o osso mais escuro e o novo isqueiro ósseo.
5. Meça a área óssea total do osso antigo e novo com o software Image J usando a ferramenta limiar de cor. Expresse os resultados como μm².

11. Análise de dados

1. Analise os resultados usando software estatístico. Diferenças significativas entre os grupos podem ser determinadas usando testes apropriados (por exemplo, teste não paramétrico de Mann-Whitney U como é feito aqui).

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Resultados

Para avaliar a formação óssea no modelo calvarial, cultivamos as hemi-calvarias em mídia com ou sem 50 μg/mL de insulina. As seções teciduais foram preparadas e manchadas com H&E. Nessas condições, a histologia mostrou que a integridade estrutural do osso calvarial foi mantida, permitindo a identificação de seus diferentes componentes (Figura 1). As calvarias tratadas com insulina apresentaram aumento na quantidade de tecido ósseo em relação ao ...

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Discussão

Aqui, descrevemos o protocolo para um modelo calvarial ex vivo para avaliar a formação ou reabsorção óssea e estudar as interações das células cancerígenas com osso do rato calvarial. Os passos críticos dessa técnica são a dissecção, cultura, incorporação e análise histomorfométrica das calvarias. Durante a dissecção das calvarias, é crucial cortar a hemi-calvarias em um trapézio, pois facilitará fortemente a orientação durante a inclusão da parafina. Ao estudar as interações das cél...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well cell culture	Corning	CLS3524
24 well non tissue culture	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotics-Antimycotic	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifugue	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
Coverslips	Corning	2935-24X50
Cytoseal resin	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolute	JALMEK	E5325-17P
Fetal Bovine Serum	Biowest	BIO-S1650-500
Filters	Corning	CLS431229
Forceps and scissors	LANCETA HG	74165
Formalin buffered 10%	Sigma	HT501320
Glass slides 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
High profile blades	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin from bovine pancreas	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mouse food, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffin Section Flotation Bath	Electrothermal	MH8517X1
Petri dish	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wax dispenser	Electrothermal	MH8523BX1
Xylene	Golden	534056-500ML