Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Özet

Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.

Özet

Kemik osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar oluşan bir bağ dokusu ve onun güç ve esneklik verir ve işlevlerini yerine getirmek için izin veren bir mineralize ekstrasellüler matris vardır. Kemik sürekli olarak çeşitli uyaranlara maruz kalır ve patolojik koşullarda kemik remodelingini bozabilir. Kemik biyolojisi ve hastalıkları nın incelenmesi ve potansiyel terapötik ajanların değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir.

Bu makale, kemik oluşumu nu ve kemik tümörü mikroçevresini incelemek için neonatal farelerden izole edilen kalvariaların diseksiyon sürecini ve kültür koşullarını açıklamaktadır. In vitro ve in vivo modellerin aksine, bu ex vivo modeli istenilen mikroortamı simüle etmek için tanımlanmış koşullar altında kültürleme sırasında dokununma sırasında dokunun üç boyutlu ortamının yanı sıra kemik hücresel çeşitliliğin korunmasına olanak sağlar. Bu nedenle, kemik remodeling ve mekanizmaları, yanı sıra diğer hücre tipleri ile etkileşimleri araştırmak mümkündür, kanser hücreleri ve kemik arasındaki etkileşimler gibi.

Burada bildirilen tahliller 5-7 günlük BALB/C farelerden calvarias kullanır. Elde edilen hemi-kalvarias insülin varlığında kültürlü, meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231), ya da meme kanseri hücre kültürlerinden klimalı orta. Analizden sonra insülinin yeni kemik oluşumuna neden olduğu, kanser hücreleri ve bunların şartlı orta indüklenen kemik rezorpsiyonu olduğu saptandı. Kalvarial model, kemik gelişimi ve kansere bağlı kemik hastalıklarının araştırılmasında temel ve uygulamalı araştırmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, kolay, bilgilendirici ve düşük maliyetli bir teşp için mükemmel bir seçenektir.

Giriş

Kemik, kasların desteklenmesi, iç organların ve kemik iliğinin korunması, kalsiyum ve büyüme^{faktörlerinin,}depolanması ve serbest bırakılması dahil olmak üzere çeşitli işlevleri olan dinamik bir bağ dokusudur.² Bütünlüğünü ve uygun işlevini korumak için, kemik dokusu sürekli remodeling süreci altındadır. Genel anlamda, kemik remodeling döngüsü kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu¹ayrılabilir. Kemik remodeling bu iki aşamaları arasında bir dengesizlik kemik patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, meme kanseri gibi hastalıklar genellikle kemik bütünlüğünü etkiler; ileri evrelerde hastaların yaklaşık %70'inde kemik metastazı vardır veya olacaktır. Meme kanseri hücreleri kemiklere girdiğinde, kemik metabolizmasını etkiler, aşırı rezorpsiyon (osteoklastik lezyonlar) ve /veya oluşum (osteoblastik^lezyonlar)ile sonuçlanır 3 .

Kemik hastalıklarının biyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için kemik remodeling ile ilgili mekanizmaları anlamak gerekir. Kanser araştırmalarında kemik metastazı prosesi ve metastatik mikroçevre ile ilişkisi nin araştırılması esastır. 1889 yılında, Stephen Paget metastaztümör hücreleri ve hedef doku arasında uyumluluk olduğunda meydana geldiğini hipotez, ve metastatik site mikroçevre için tümörün yakınlık bağlıdır önerdi⁴. 1997 yılında, Mundy ve Guise tümör hücrelerinin hayatta kalma ve büyüme elde etmek için kemik mikroçevre değiştirmek nasıl açıklamak için "kemik metastazlarının kısır döngüsü" kavramını tanıttı, ve nasıl kemik mikroçevre kalsiyum ve büyüme^faktörlerisağlayarak büyümesini teşvik 5^,6,7.

Kemik remodeling ve kemik metastazı ile ilgili mekanizmaları karakterize etmek ve olası terapötik potansiyele sahip molekülleri değerlendirmek için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir. Ancak, bu modeller şu anda kemik mikroortamının basitleştirilmiş temsili gibi birçok sınırlamalar mevcut, ve maliyet^8,9. Kemik eksektis ex vivo kültürü, kemik hücrelerinin çeşitliliğinin yanı sıra üç boyutlu organizasyonu koruma avantajına sahiptir. Buna ek olarak, deneysel koşullar kontrol edilebilir. Eksplant modelleri metatarsal kemikler, femoral kafaları, calvarias ve mandibular veya trabeküler çekirdek¹⁰kültürünü içerir. Ex vivo modellerinin avantajları çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. 2009 yılında, Nordstrand ve işbirlikçileri kemik ve prostat kanseri hücreleri arasındaki etkileşimleri dayalı bir coculture modelinin kurulması bildirdi¹¹. Ayrıca, 2012 yılında, Curtin ve işbirlikçileri ex vivo cocultures¹²kullanarak üç boyutlu bir modelin geliştirilmesi rapor . Bu tür ex vivo modellerinin amacı, normal veya patolojik kemik remodeling inde yer alan mekanizmaları karakterize edebilmek ve yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kemik mikroortamının koşullarını mümkün olduğunca doğru bir şekilde yeniden oluşturmaktır.

Bu protokol Garrett¹³ ve Mohammad ve ark.¹⁴tarafından yayınlanan prosedürlere dayanmaktadır. Yenidoğan fare kalvari kültürleri deneysel bir model olarak kullanılmıştır, onlar geliştirme ve kemik hücreleri altında kemik üç boyutlu mimarisi korumak gibi, farklılaşma tüm aşamalarında hücreleri de dahil olmak üzere (yani, osteoblastlar, osteositler, stromal hücreler) olgun osteoklastlar ve osteoblastlar yol, yanı sıra mineralize matris¹⁴. Ex vivo modeli kemik hastalıklarının patolojik sürecini tam olarak temsil etmez. Ancak, kemik remodeling veya kansere bağlı kemik osteoliz üzerindeki etkileri doğru ölçülebilir.

Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: 5-7 günlük fareler, calvaria preculture, calvaria kültür uygulamaları (örneğin, insülin varlığında kültür, kanser hücreleri veya şartlı orta ve hatta ajanlar gelen kalvarias diseksiyon terapötik potansiyel, araştırma amacına göre), kemik fiksasyonu ve kalsifikasyon, doku işleme, histolojik analiz ve sonuç yorumu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu tahlillerde kullanılan tüm fareler BALB/c fare suşlarından elde edilip, erkek ve dişi farelerin gelişigüzel kullanılmasına neden oldu. Önceki kültür deneyleri de FVB, İsviçre fareler, CD-1 ve CsA fareler^11,,12,14gibi diğer suşları kullanılarak yapılmıştır. Tüm fareler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre barındırıldı, Ek S. Hayvan denekleri içeren prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından Ensenada Bilimsel Araştırma ve Yüksek Öğretim Merkezi (CICESE) tarafından onaylanmıştır.

1. Kalvariyal diseksiyon

1. Diseksiyon aletlerini (örn. 1 x 2 diş doku kasları, düz cerrahi makas, diseksiyon makasları, ince uçlu cımbızlar, ince kavisli uçlu kesme terpler, diseksiyon perçeleri, neşter) sterilize edin. Steril distile su her diseksiyon arasındaki cerrahi araçları temizlemek için kullanılabilir ve steril 1x PBS her hemi-calvaria temizlik için kullanılabilir.
2. Steril diseksiyon aletleri, su, 1x PBS ve prosedürü gerçekleştirmek için gerekli malzemeleri (örn. mikro pipetler, çökelti gözlükleri, steril Petri kaportaları) laminar akış kaputuna yerleştirin.
   NOT: Tüm prosedürü steril koşullarda gerçekleştirin.
3. İki 10 cm Petri kabına 12 mL steril 1x PBS ekleyin.
4. Yavruları seçin ve kaputun yakınına yerleştirin.
   NOT: 5-7 günlük yavrulardan kalvariaları inceleyin.
5. Kesme forceps kullanarak fareyi dikkatlice seçin ve tutun.
6. Kesme makası kullanarak farenin kafasını koparın ve başı PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Decapitation yaşlı fareler için uygun değildir. Deney daha yaşlı farelerle yapılacaksa, ötanazi yöntemi hayvan deney kurallarına göre değiştirilmelidir.
7. 1 x 2 diş dokusu forceps ile burun bölgesi tarafından sıkıca baş tutun ve calvaria görünür olana kadar kafatası üzerinde deri çıkarın.
8. Maruz kalan kalvariüzerinde kafatasının dikişlerini (yani sagittal, koronal ve lambdoid) tanımlayın.
9. Lambdoid sütür arkasında yaklaşık 2 mm mikrosksorucu ucu ile nüfuz ve yanında düz bir kesim yapmak.
10. Kafatasının arka tarafına mikrosksorsucu ucu nu yerleştirin. Koronal sütür doğru lambdoid sütür distal tarafı boyunca düz bir kesim olun. Diğer lambdoid dikiş ile benzer devam edin.
11. Ön fontanel kesim ile yapılan kesim sonunda bağlamak için başka bir kesim (45 ° açıyla) olun.
12. Diğer lambdoid sütür ile 1.10 ve 1.11 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Uygun kesimler yapmak ve yeterli katıştırma ve veri analizi yapabilmek için dikişleri belirlemek önemlidir.
13. Calvaria kaldırmak ve bir Petri kabına yerleştirmek için ince uçlu forceps kullanın. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak ve iki hemi-calvarias elde etmek için ön fontanel biten.
14. İnce uçlu cımbızile hemi-calvarias her almak ve PBS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.

2. Calvaria kültürü

1. 24 kuyunun kuyularına %0.1 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ve %1 antibiyotik/antimikotik (yani penisilin ve streptomisin) ile takviye edilmiş 1 mL yüksek glukozlu DMEM ortamı ekleyin. İnce uçlu forceps ile, her hemi-calvaria almak ve bir kuyuya yerleştirin.
   NOT: Hemi-calvarias içbükey tarafını aşağı koyun.
2. Hemi-kalvarileri %5 CO₂ile 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
3. Kültür ortamını her kuyudan çıkarın ve diğer hücrelerden test etmek veya koşullandırılmış ortam için bileşiği içeren 1 mL taze ortam ekleyin.
   NOT: Her tedavi grubu için en az üç hemi-kalvarikullanın ve negatif ve pozitif kontroller kullanın.
4. Hemi-kalvarileri 7 gün kuluçkaya yatırın, 2-3 günde bir ortam değiştirin.

3. Kanser hücreleri ile Kültür

1. %80-90 oranında kanser hücrelerinin birleştiği bir Petri kabı seçin ve onları deneyin. Tripsin için kanser hücrelerini 1 x PBS (75 cm^başına 5 mL 2 şişe) kullanarak yıkayın ve ardından %0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA (75 cm² şişede 2 mL) içeren HBSS çözeltisinde kuluçka yada kuluçka yada sın.
2. Hücre süspansiyonuna 15 mL konik tüp ve 800 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika (RT) aktarın.
3. Supernatant'ı çıkarın ve atın.
4. %2 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik içeren 2 mL DMEM'deki peleti yeniden askıya alın. Canlı hücreleri say.
5. Her çalışma grubuna hemi-kalvarias atayın (yani RNA veya histoloji analizi için negatif kontrol ve kokültür grubu).
6. Kültür ortamını hemi-kalvarilerden çıkarın ve %2 FBS ve %1 antibiyotik/antimikotik içeren 1 mL DMEM ekleyin veya kanser hücreleriyle desteklenmez.
   NOT: Eklenecek hücre miktarı, test edilen hücre satırına bağlı olarak değişebilir. MDA-MB-231 veya PC-3 gibi kanser hücreleri ile, iyi başına 500.000 hücreleri uygun çalışır.
7. 37 °C'de %5 CO₂ile 24 saat kuluçka . Kemik dokusuna yapışan sadece kanser hücrelerini korumak için yeni bir kuyuya her hemi-calvaria geçirin.
8. %5 CO₂ ile 37 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın ve 2-3 günde bir ortamı değiştirin.

4. Fiksasyon

1. Hemi-calvarias sarmak için kağıt mendil kareler kesin.
   NOT: Küçük biyopsiler için biyopsi köpük pedleri veya çelik kapsüller de kullanılabilir.
2. Sagittal sütür her hemi-calvaria almak için düz ince uçlu forceps kullanın, bir doku kağıt üzerine yerleştirin, ve sarın.
3. Sarılmış hemi-calvaria etiketli bir gömme kaset içine yerleştirin.
4. Kaseti %10 fosfat tamponlu formalin içeren bir kaba yerleştirin.
5. 4 °C'de 24 saat için düzeltin.

5. Kireçlenme

1. Formalin çıkarın, 1x PBS ekleyin ve hemi-calvarias durulamak için 30 dakika boyunca dokuları ajite.
2. PBS'yi çıkarın ve %10 EDTA ekleyin (pH = 8, 0,34 M).
   NOT: Çözümün dokuları tamamen kapsadığını doğrulayın.
3. 4 °C'de 48 saat dokuları dekalsite edin.
4. EDTA çözeltisini atın ve doymak için 1x PBS ekleyin.
5. Histoloji işlemine kadar hemi-kalvarileri %70 etanolde saklayın.

6. Doku işleme

1. % 96 etanol, 60 dakika (3x), % 100 etanol, 60 dakika (3x) tur ile dokuları dehydrate.
2. Etanol% 100 ksilen, 60 dakika (3x) ile değiştirin.
3. Parafin balmumu, 60 dk (2x) kasetler kuluçka.

7. Gömme

1. Kasetleri açın, kağıt mendilini dikkatlice çıkarın ve calvaria'yı açın.
2. Her calvaria dikkatle almak ve aynı oryantasyon da aynı gruptan tüm hemi-calvarias yığını.
3. Kalıba biraz parafin koy.
4. Tüm hemi-calvarias'ları çifenler ile toplayın ve kalıbın tabanına doğru sagittal sütür ile kalıbın içine yerleştirin.
   NOT: Dahil sırasında kalıptaki hemi-kalvarilerin oryantasyonu tutarlı histolojik kesitler ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir, çünkü bu oryantasyon kalvarilerden ön ve parietal kemiklerin posterior olarak tanımlanmasına olanak sağlar. ve koronal sütür kantitatif değerlendirmeyi kolaylaştırır.
5. Forceps bırakın ve hemi-calvarias yerinde kalmak doğrulayın.
6. Etiketli kaseti kalıbın üzerine yerleştirin ve hemi-calvarias'ı kapsayacak şekilde daha fazla parafinle doldurun.
7. Kalıpları soğuk yüzeye taşıyın.

8. Kesitleme

1. Mikrotom ile sagittal sütür 500-600 μm trim.
2. 4 μm kalınlığında kesin ve gerekli bölümleri toplayın.
3. 300 μm daha kırpın.
4. Kesip altı 4 μm kalınlığında kesin.
5. Bloğu 300 μm daha fazla kırpın ve daha fazla kesit toplayın.
6. Bölümleri cam mikroskop slaytlarına monte edin.
7. Slaytları RT'de kurutun.

9. Boyama

1. 3 dakika için% 100 xylene bölümleri batırın.
2. 1 dakika boyunca % 100 etanol batırın.
3. 1 dakika için% 96 etanol birleştirin.
4. 1 dakika boyunca % 80 etanol batırın.
5. 1 dakika boyunca % 70 etanol batırın.
6. 3 dakika suda durulayın.
7. 3 dakika hematoksilin batırın.
8. Bölüm temizlenene kadar suda durulayın.
9. 10 sn için doymuş lityum karbonat çözeltisine batırın.
10. 3 dakika suda durulayın.
11. 1 dakika boyunca % 96 etanol batırın.
12. 3 dakika boyunca eozin batırın.
13. 1 dakika boyunca %96 etanol batırın.
14. 1 dakika boyunca % 100 etanol batırın.
15. 3 dk için% 100 xylene batırın.
16. Slayta montaj ortamı başına biraz ekleyin ve bir kapak kayma ile koruyun.
    NOT: Osteoklast ve osteolizi değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (H&E) lekesini tartaratdirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ile tamamlayabilirsiniz.

10. Nicel değerlendirme: analiz alanının tanımlanması

1. Oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için düşük güç altındaki bölümleri (yani 4x) inceleyin.
2. Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi ve diğer kısa yüzeyi tanımlayın.
3. 40x büyütme altında koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntülerini yakalayın.
4. Eski kemik bölgesini ve yeni kemik bölgesini tanımlayın. Turuncu G lekeleri ile eozin Y eski kemik koyu ve yeni kemik çakmak lekeleri.
5. Renk eşik aracını kullanarak Image J yazılımı ile eski ve yeni kemiğin toplam kemik alanını ölçün. Sonuçları μm²olarak ifade edin.

11. Veri analizi

1. Sonuçları istatistiksel yazılımkullanarak analiz edin. Gruplar arasındaki önemli farklar uygun testler kullanılarak belirlenebilir (örn. herel yapıldığı gibi parametrik olmayan Mann-Whitney U testi).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kalvarial modelde kemik oluşumunu değerlendirmek için hemi-kalvariaları 50 g/mL insüliniçeren veya olmayan ortamda yetiştirdik. Doku bölümleri hazırlandı ve H&E ile boyandı. Bu koşullarda histoloji, kalvariyal kemiğin yapısal bütünlüğünün korunarak farklı bileşenlerinin tanımlanmasına olanak sağladığını göstermiştir(Şekil 1). İnsülin ile tedavi edilen kalvariler kontrole göre kemik dokusu miktarında artış gösterdiler (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, kemik oluşumunu veya rezorpsiyonlarını değerlendirmek ve kanser hücrelerinin kalvarial fare kemiği ile etkileşimlerini incelemek için kalvarial ex vivo modelinin protokolünü açıklıyoruz. Bu tekniğin kritik adımları kalvariaların diseksiyon, kültür, katıştırma ve histomorfometrik analizidir. Calvarias diseksiyon sırasında, bir yamuk içine hemi-kalvarias kesmek için çok önemlidir, bu kuvvetle parafin dahil sırasında yönünü kolaylaştıracak gibi. Calvarias ile kanser hücre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well cell culture	Corning	CLS3524
24 well non tissue culture	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotics-Antimycotic	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifugue	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
Coverslips	Corning	2935-24X50
Cytoseal resin	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolute	JALMEK	E5325-17P
Fetal Bovine Serum	Biowest	BIO-S1650-500
Filters	Corning	CLS431229
Forceps and scissors	LANCETA HG	74165
Formalin buffered 10%	Sigma	HT501320
Glass slides 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
High profile blades	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin from bovine pancreas	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mouse food, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffin Section Flotation Bath	Electrothermal	MH8517X1
Petri dish	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wax dispenser	Electrothermal	MH8523BX1
Xylene	Golden	534056-500ML