זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Summary

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

Abstract

סרטן התא ניידות חיונית אתחול של גרורות. לכן, חקירה של תנועת התא, קיבולת פולשנית היא משמעות רבה. העברת מבחני לספק תובנה בסיסית של תנועת התא ברמה 2D, ואילו מבחני הפלישה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, מחקה סרטן ויוו dislodgment תא מהאתר המקורי, פולשים באמצעות מטריצות. בפרוטוקול הנוכחי מספק זרימת עבודה יחידה עבור מבחני ההעברה ואת הפלישה. יחד עם משולב אוטומטי מיקרוסקופיים המצלמה עבור ניתוח מובנה מודול ותמונות בזמן אמת HD, זה נותן חוקרים היעילה, האפשרות ניסיוני פשוטה לשחזור. פרוטוקול זה כולל גם החלפות הגיוניות מתכלים ושיטות ניתוח חלופי עבור משתמשים לבחירה.

Introduction

נדידת תאים הפלישה חשוב תהליכים ביולוגיים המאפשרים פונקציות נורמלית בגוף האדם, כגון סגירת הפצע, הפלישה של השליה לתוך הרחם ואת עטין מורפוגנזה^1,2,3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בגוף האדם יש שליטה קפדני ומדויק של אירועים אלה ביולוגי; עם זאת, ישנם כמה חריגים. גידולים ממאירים, למשל, מסוגלים לברוח הגנה זו, מוצג התפשטות חריגה, לפלוש לתוך רקמות שכנות, אשר נקרא גרורות. גרורות הוא הגורם העיקרי של תמותה מסרטן⁴.

סרטן השד הוא הכי נפוץ אובחן סרטן אצל נשים, הוא הגורם השני-הגבוה של מוות מסרטן בקרב נשים במדינות מפותחות ברחבי העולם⁵. סרטן השד מקורו של צינוריות או האוניות המורכבים של שכבה אחת או יותר של תאים אפיתל. בשד נורמלי, תאים אפיתל לדבוק אחד לשני וכדי קרום המרתף דרך הממברנה חלבונים כגון E-קדהרין אינטגרינים⁶. עם זאת, תאי סרטן שד פולשני איבדו קוטביות והצמדות התא-התא שלהם, ולא בסגנון קלאסי עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) ולהשיג את היכולת לנוע. לאחר extravasation, תאים אלה תנוע מטריצה חוץ-תאית (ECM) והזן את כלי הדם או מערכת הלימפה, ואחריו ואז intravasation וגידול גרורתי⁷. הבנת המנגנונים שבאמצעותו זו מתרחשת היא משמעות רבה, מאז גרורות הוא הגורם הנפוץ ביותר הקשורים לסרטן בהירושימה, קשורה קשר הדוק סרטן תא העברה/הפלישה. כדי להמחיש את התנועה של תאים סרטניים, מבחני ההעברה ופלישה הם מודלים אידיאלי ללמוד 2D and 3D תנועת התא, בהתאמה. העברה ישירות מעריך את התנועה של תאי ואילו הפלישה ושכוללת מגע עם microenvironment ואת היכולת לבזות את המחסומים הביולוגיים. שני התהליכים אינם עצמאית לחלוטין של זה, כמו הגירה היא דרישה של פלישה.

פותחו מספר שיטות ללמוד הגירה ו הפלישה. כפי שנבדקו על ידי קרמר ואח ', העברת מבחני כגון ריפוי הפצע, גדר, מיקרו-המוביל מבחני ליצור אזור נטול תאים כדי לאפשר תאים להעביר, הערכת השינוי של אזור; ואילו, מבחני transwell ו נימי מבוססים על מספר התאים שנעים לכיוון attractant⁸. מבחני הפלישה, סביבה ECM צריך להיות מוגדרת עם ג'ל ECM או קולגן למשל, התנועה 3D יכול להיות מוערך על ידי ניטור הפלישה פינת, מרחק, תא הסעיפים (למשל assay transwell, ברווזן assay)⁸. סוג נוסף של הפלישה assay היא לשלב את התאים פולשנית עם תאים לא פולשנית, להעריך את ההתנהגות של התאים פולשני (למשל, מבחני ספרואיד). השיטות שהוזכרו לעיל יש את היתרונות שלהם, אסירים, דרך קלה לגישה, קל לחזור על, שילוב וזמינותו ההעברה והיא הפלישה assay בזרימת עבודה דומה מועדף בעיצוב ניסיוני.

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של נדידת תאים ופלישה באמצעות imager לחיות תאים. . זה תא בזמן אמת ניטור מערכת המותקנת בתוך חממה התרבות תאים סטנדרטית. זה לוקח תמונות בחדות גבוהה לפי ערכת סריקה במרווחי זמן ומדידות על-ידי החלת מסיכות מתאימות התאים או מטרות פלורסנט. המודול של העברה/הפלישה assay כולל באמצעות כלי גירוד 96 פינים, אשר מתאים לייצור הומוגניות לגרד פצעים על טפט התא בצלחת 96-ובכן. המנגנון מבוסס על הפצע במבחנה ריפוי מבחני, ניטור תנועת התא 2D פלסטיק או משטח מצופה. הפלישה או תלת-ממד התנועה מעבר ECM נוספים בתוך השריטה פצע יכול גם להיות מוערך. זרימת עבודה קצרה מודגם באיור1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: שתי שורות תאים צריך להיות מטופל בנפרד. ההליכים הבאים צריך להיות מוחל על קו תא בודד אחד אם לא צוין.

1. למטב את צפיפות התאים לפני פציעתו

1. התרבות תאים חסיד ב T75 ס מ² תרביות רקמה מבחנות עד כ 80% למפגש ב Dulbecco חינם של פנול אדום שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 200 מ מגלוטמין ו- 2 µg/mL אינסולין ב 37 ° C עם 5% CO₂ ( הדגירה סטנדרטי עבור רוב שורות תאים סרטן, תרבות ניסוחים התנאים תא תלויי-קו).
2. להסיר את המדיה התרבות על ידי pipetting לתוך מיכל פסולת. Pipet 2 מיליליטר מראש ומחוממת 0.1% טריפסין-EDTA בקצרה לשטיפה תא טפט של pipet. להוסיף עוד 2 מ"ל של 0.1% טריפסין-EDTA ולמקם את הבקבוקון בתנאים סטנדרטיים הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
3. טפח בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח ניתוק של התאים ולאחר מכן להוסיף 10 מ של מדיה תרבות ומחוממת מראש כדי לעצור את התגובה הפרוטאוליטי.
4. העברת התליה תא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ספין למטה ב x 200 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר את תגובת שיקוע מבלי לזעזע את צניפה תא, resuspend עם עוד 10 מ"ל מראש ומחוממת תרבות המדיה.

2. לספור את מספר הטלפון הנייד באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית (או כל שיטות ספירה)

1. µL 200 שתדללו של השעיה תא resuspended עם µL 800 1 x פוספט של Dulbecco במאגר מלוחים (DPBS) שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
2. לצרף בחיישן ספירת תאים מיקרומטר 60 הדלפק תא, החזק את דו-מצבי, למזג את הטיפ התליה תא. לאט לאט לשחרר את הדו-מצבי עד התליה תא בהצלחה הוא נשאב לתוך החיישן. ריכוז התאים מוצג ב תאים למ"ל.
3. לחשב את המספר הסלולרי התליה תא 10 מ"ל.

3. תא יופיצ

1. צלחת תאים בטווח של תאים צפיפויות (40,000-90,000 תאים/טוב) שהפקידים בצלחת 96-ובכן.
2. למקם את הצלחת םלצה תא חי, לתזמן סריקה כל שעתיים במשך 24 שעות ביממה.
   1. התוכנה, לחץ על לוח הזמנים סריקות מתוך רשימת המשימות. בחלונית הגדרת מגירה, לקבוע את המיקום של הצלחת, לחץ על הוסף כלי ולבחור את סוג הצלחת. בחלונית הגדרת סריקה , לבחור או ערוך את תבנית הסריקה לפי הגדרת צלחת ניסיוני, להגדיר סוג סריקה כמו רגיל.
   2. לחץ לחיצה ימנית על הזמן, ציר הזמן , בחר להגדיר מרווחי. הגדר להוסיף כל סורק 2 h-לוח זמנים 24 שעות ביממה. לחץ על החל.

4. לקבוע את התא אופטימלית זריעה צפיפות עבור וזמינותו ההעברה

1. סנטהמבצע סריקה לאחר 24 שעות, החל המפגש עיבוד כלי ניתוח לתמונות חדות HD-פאזי שנאספו באופן אוטומטי ולהפיק עיקול התפשטות תא נגד הזמן.
   1. לקבוע 3-6 להחליפן בתמונות ומניחים בתוך אוסף תמונהחדשה.
   2. לקבוע מסכה נכונה כמו ההגדרה עיבוד.
   3. ההשקה עבודה ניתוח.
   4. לקבוע תא ממוטבת צפיפות בהתאם למפגש נגד הזמן (כ 100% זרימה בתוך 6: תרכיזי h תלוי מתי מתחילה וזמינותו ההעברה).
      הערה: משך הזמן שנדרש כדי לגדול תאי זרימה משתנה בהתאם דילול זריעה.

5. בימים 1 ו- 2: לקראת העברה, מבחני הפלישה

1. יום 1, מעיל את הצלחת על הפלישה וזמינותו.
   הערה: תמיד צריך להיות מטופל ECM ג'ל על קרח, עם טיפים הונחו במקרר למשך הלילה.
   1. לדלל ג'ל ECM עם תרבות קר כקרח, למדיה µg 100/מ"ל ולהוסיף 50 µL של ג'ל ECM מדולל/מדיה לתוך בארות המיועד.
   2. המקום לצלחת-תנאים סטנדרטיים הדגירה למשך הלילה.
2. יום 2, בעדינות תשאף התקשורת עודף. צלחת תאים עם תא ממוטבת צפיפויות לתוך שתי צלחות 96-ובכן המיועדים וזמינותו ההעברה (ללא ציפוי) ואת וזמינותו הפלישה (מצופה) ב- triplicates בעקבות סעיפים 1-3 אחר הצהריים המאוחרות (בפרוטוקול הנוכחי, צפיפויות זריעה ממוטב עבור ZR75-1 מד א-MB-231 היו 90,000/טוב ו 50,000/טוב, בהתאמה).
3. למקם צלחות תנאים סטנדרטיים הדגירה למשך הלילה.

6. יום 3: פצע שריטה

1. רסס ונגב בכלי גירוד ו- 2 שטיפה סירות עם אתנול 70% לפני הכנסתם אבטחה הקבינט. למלא את הסירה כביסה 1 ו- 2 בדיוק 45 מ ל סטרילי (בלוק) מזוקקים מים ו- 70% אתנול בהתאמה.
2. עבור עיקור, במקום לבלוק הצמד בכלי גירוד (למעלה) על שטיפת הסירה 1 ו- 2 למשך 5 דקות.
3. להתחיל עם לוחית assay ההעברה.
   1. להעביר לצלחת המכילה תאים מן החממה וודא כי לא טוב הוא יבש כדי למנוע נזק של הכלי מאפס. הסר את מכסה לוח להכניס לתוך צלחת הבסיס האוחז הכלי מאפס, בזהירות המקום החלק העליון על החלק הבסיסי על ידי המנחה דובלי. הקש להחזיק את ידית שחורה ואני בינתיים בזהירות להרים את הבלוק pin. פערים מכל קידוח הם בדרך כלל גלויים בעין בלתי מזוינת, תחת המיקרוסקופ.
   2. במהירות להשרות את הסיכות במים; . זה מספיק כדי לנקות בכלי גירוד לפני מגרד את הצלחת assay הפלישה הצלחת ההתקנה הינו זהה. אחרת, חזור על השלבים עיקור עם מים מזוקקים סטריליים ולאחר מכן 70% אתנול למשך 5 דקות.
4. לשטוף הזמנים צלחת 1 או 2 עם מדיה תרבות ומחוממת מראש כדי להימנע תאים מנותקת או תא גליונות חיבור מחדש אל הבאר.
5. להוסיף 100 µL של התקשורת חם טרי לתוך בארות ייעודית עם או בלי טיפולים.
6. פעולות נוספות עבור הפלישה וזמינותו.
   1. מקם את הצלחת assay הפלישה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות equilibrate, בזהירות תשאף התקשורת קר.
   2. לדלל ג'ל ECM עם תרבות קר כקרח, למדיה 5 מ"ג/מ"ל, להוסיף 50 µL של ג'ל ECM מדולל לתוך בארות המיועד, תחת סטנדרט הדגירה למשך 30 דקות.
   3. להוסיף 100 µL של התקשורת חימם-up עם או בלי בדיקות תרכובות.
7. למקם את הצלחת לחיות תאים imager ולתת לו equilibrate עבור 5 דק. בחר סוג אניה כמו צלחת imagelock. להגדיר סוג סריקה כמו לגרד פצע, לבחור או ערוך תבנית לסרוק בהתאם לכיוונון צלחת ניסיוני (1 תמונה/טוב, מצב רחב), לתזמן 24 שעות אני חוזר סריקת כל ה 1-2 עבור 72 h עד הפצעים הגלידו.
8. כדי לנקות הכלי מאפס, לשים את הבלוק הסיכה העליונה בכל הפתרונות הבאים (45 מ ל שטיפה סירות) עבור 5 דקות: 0.5% אבקת 1 אבקת 1% (ראה טבלה של חומרים), 2 (ראה טבלה של חומרים), סטרילי אתנול 70% ומים מזוקקים. מניחים בכלי גירוד חזרה אל צלחת הבסיס שלה, חנות בסביבה נטולת אבק.

7. ניתוח נתונים

1. הפסק סריקה המשטח המיועד לאחר כל הפצעים הגלידו על-ידי בחירת את הצלחת הניסוי על המגירה ההתקנה ולחיצה להסיר כלי.
2. לאסוף 3-6 להחליפן בתמונות המתפרסות על-פני טווח אחוזים סאונד, כולל תמונות ימין לאחר הפצע בוצע, פצע הסגר על-ידי 10% ו 50%.
3. כדי לקבוע הגדרה עיבוד מתאים, השתמש פילוח ההתאמה, ניקוי ומסננים כדי להחיל המתאים לגרד פצע את המסכה ואת מסיכת הנהרות. השתמש המקדימה הנוכחית/כל כדי להציג את הדיוק של המסכות.
4. הפעל משימת ניתוח.
5. נתונים שניתן לנתח בתוך התוכנה או מיוצא לצורך ניתוח נוסף. שלושה מדדים הניתנים על ידי התוכנה ניתן להשתמש כדי להעריך את תמונות HD-פאזי: פצע רוחב (מיקרומטר), פצע הנהרות (%) וצפיפות הפציעה היחסי (%). השוואות יידונו בסעיף הבא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Assay הגירה/הפלישה הזו מבוססת על וזמינותו ריפוי הפצע, הבודקת את הקצב של התאים נעה לתוך אזור נטול תאים שנוצרו על-ידי הכלי מאפס 96 פינים. ההבדל בין מבחני ההעברה ופלישה הם מבחני ההעברה כי תאי מידות עובר בתאי רקמת-תרבות מטופלים פלסטיק משטח ופלישה אמצעים העברת ECM ג'ל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ההעברה הפלישה פרמטרים חשובים כדי להעריך את הניידות של תאי הסרטן בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. על-ידי שימוש בכלי גירוד 96 פינים, זה אפשרי לערוך ריפוי מבחני ב 2D and 3D בו זמנית הפצע. מלבד בהנחיה בסריקה אוטומטית באמצעות סביבת התרבות התא יציב עם הפרעה מינימלית, וזמינותו מאפס נערך באמצעות הכלי מאפס ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom	Essen	4379
EVE Counting slides	BioTools	EVS-50
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories	Essen	4444	Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit	Essen	4493	Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live cell analysis system
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175