Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Résumé

Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.

Résumé

Cancer cellule mobilité est cruciale pour l’ouverture de la métastase. Enquête du mouvement cellulaire et la capacité invasive est donc d’une grande importance. Les essais de migration donnent une idée de base du mouvement cellulaire au niveau 2D, tandis que les analyses d’invasion sont plus physiologiquement pertinents, imitant le détachement cellulaire in vivo cancer du site original et envahir par l’intermédiaire de la matrice extracellulaire. Le protocole actuel prévoit un seul flux de travail pour les essais de migration et invasion. Avec la caméra intégrée de microscopique automatisée pour les images HD en temps réel et le module d’analyse intégré, il donne des chercheurs un temps-efficace, simple et reproductible option expérimentale. Ce protocole comprend également des substitutions pour les consommables et les méthodes d’analyse des choix pour les utilisateurs à choisir.

Introduction

La migration cellulaire et l’invasion sont des processus biologiques importants qui permettent les fonctions normales du corps humain, comme la fermeture de la plaie, invasion du placenta dans l’utérus et glandes mammaires morphogenèse^1,2,3. Le corps humain a un contrôle rigoureux et précis de ces événements biologiques ; Cependant, il y a quelques exceptions près. Les tumeurs malignes, par exemple, sont en mesure d’échapper à cette sauvegarde, pièce prolifération anormale et envahir dans les tissus voisins, qu’on appelle des métastases. Métastase est la principale cause de mortalité liée au cancer⁴.

Le cancer du sein est le plus couramment diagnostiqué le cancer chez les femmes et est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmes dans les pays développés dans le monde entier⁵. Le cancer provient de conduits ou lobules qui consistent en une ou plusieurs couches de cellules épithéliales. Dans le sein normal, les cellules épithéliales sont rattachés les uns et à la membrane de sous-sol par l’intermédiaire de protéines membranaires telles que E-cadhérine et les intégrines⁶. Cependant, les cellules du cancer du sein invasif ont perdu leur polarité et l’adhérence de cellules et classiquement subissent une transition mésenchymateuse épithéliale (EMT) et acquièrent la capacité de se déplacer. Après extravasation, ces cellules se déplacent sur la matrice extracellulaire (ECM) et entrer dans le vaisseau sanguin ou le système lymphatique, suivie ensuite d’intravasation et croissance métastatique⁷. La compréhension des mécanismes par lesquels ceci se produit est d’une grande importance, puisque les métastases est la cause la plus fréquente de mortalité liée au cancer et est étroitement lié au cancer cell migration/invasion. Afin de visualiser le mouvement des cellules cancéreuses, les essais de migration et invasion sont les modèles idéales pour étudier le mouvement cellulaire 2D et 3D, respectivement. Migration évalue directement le mouvement des cellules tandis qu’invasion implique une interaction avec le microenvironnement et la capacité à dégrader les barrières biologiques. Les deux processus ne sont pas totalement indépendants d’un de l’autre, que la migration est une exigence d’invasion.

Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier les migrations et l’invasion. Tel que revu par Kramer et al., des tests de migration comme la cicatrisation, clôture et analyses micro-transporteur génèrent une zone acellulaire pour permettre les cellules habitable, à évaluer le changement de zone ; considérant que, essais transwell et capillaire sont basés sur le nombre de cellules qui se déplacent vers un attractant⁸. Pour les analyses d’invasion, un environnement ECM doit être mis en place avec du gel de l’ECM ou collagène par exemple, et le mouvement 3D peut être évaluée en surveillant les comtes invasion de zone, de distance et de cellule (p. ex. transwell dosage, dosage de l’ornithorynque)⁸. Un autre type de test de l’invasion est de combiner les cellules invasives avec les cellules non invasif et évaluer le comportement des cellules envahissantes (p. ex. sphéroïde dosages). Les méthodes ci-dessus ont leurs avantages et inconvénients et une manière facile d’approche, facile à répéter et à combiner le test de migration et invasion dans un flux de travail similaire est préférentiel dans une conception expérimentale.

Ce protocole décrit la mesure de la migration cellulaire et l’invasion à l’aide d’un imageur de cellules vivantes. C’est une cellule en temps réel système installé dans un incubateur de culture cellulaire standard de surveillance. Il prend des images haute définition avec le jeu de numérisation des intervalles et des mesures en appliquant des masques appropriés pour les cellules ou les cibles fluorescents. Le module de test de migration/invasion inclut à l’aide d’un outil de grattage 96 broches, qui est adapté pour la fabrication des plaies gratter homogènes sur une monocouche de cellules dans une plaque à 96 puits. Le mécanisme est basé sur une plaie in vitro tests de guérison, de surveillance des mouvements de cellules 2D sur un plastique ou revêtement. Invasion ou mouvement 3D à travers un ECM supplémentaire dans le scratch enroulé également peut être évaluée. Un flux de travail bref est illustrée à la Figure 1.

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Protocole

Remarque : Deux lignées de cellules doivent être traitées séparément. Les procédures suivantes devraient être appliquées à une ligne de cellules du même si n’est pas spécifiées.

1. optimiser la densité cellulaire avant blessant

1. La culture des cellules adhérentes dans des flacons de culture de tissus² T75 cm à environ 80 % confluent dans de Dulbecco gratuit-rouge de phénol modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 200 mM de L-glutamine et 2 µg/mL d’insuline à 37 ° C, avec 5 % CO₂ ( conditions d’incubation standard pour la plupart lignées de cellules cancéreuses, les formulations de culture sont cellule dépendante de ligne).
2. Retirez le support de culture en pipettant également éteint dans un conteneur à déchets. Pipette de 2 mL de préchauffé 0,1 % trypsine-EDTA brièvement rince les monocouches de cellules et la pipette. Ajouter un autre 2 mL de 0,1 % trypsine-EDTA et placer le ballon dans des conditions standard d’incubation à 37 ° C pendant 5 min.
3. Tapotez doucement le flacon pour s’assurer que le détachement des cellules, puis ajouter 10 mL de milieux de culture pré chauffé pour arrêter la réaction protéolytique.
4. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et la centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Retirer le surnageant sans agiter le culot cellulaire soigneusement et remettre en suspension avec un autre média de culture pré chauffé 10 mL.

2. compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (ou des méthodes de comptage)

1. Dilué à 200 µL de la suspension cellulaire remises en suspension avec 800 µL de 1 x Phosphate de Dulbecco buffered Saline (SPD) dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
2. Attacher un capteur de comptage de cellule 60 µm pour le compteur de cellules, maintenez la bascule et fusionner la pointe de la suspension cellulaire. Relâcher lentement la bascule jusqu'à ce que la suspension cellulaire est aspirée avec succès par le capteur. La concentration cellulaire est affichée dans les cellules/mL.
3. Calculer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire de 10 mL.

3. cellule électrodéposition

1. Cellules de la plaque à une gamme de densité des cellules (40 000-90 000 cellules/puits) en trois exemplaires, une plaque à 96 puits.
2. Placer la plaque dans l’imagerie de cellules vivantes et planifier l’analyse toutes les 2 h pendant 24 h.
   1. Dans le logiciel, cliquez sur calendrier scanne de la liste des tâches. Dans le volet de configuration de tiroir, déterminer la position de la plaque, cliquez sur Add bateau et choisissez le type de plaque. Dans le volet de Configuration Scan , choisir ou modifier la méthode de balayage selon le paramétrage de la plaque expérimentale et définissez Type de Scan en tant que norme.
   2. Faites un clic droit sur la chronologie , puis sélectionnez Définir des intervalles. Valeur Ajouter scanne chaque 2 h à un horaire de 24 h. Cliquez sur appliquer.

4. déterminer la cellule optimale l’ensemencement de densité pour l’analyse de la Migration

1. Stop balayage après 24 h, appliquer la confluence traitement outil d’analyse pour les images de contraste de phase HD automatiquement collectés et générer une courbe de prolifération cellulaire contre le temps.
   1. Déterminer les images représentatives de 3-6 et les placer dans une nouvelle Collection d’images.
   2. Déterminer un masque approprié comme Définition de la transformation.
   3. Lancer une tâche d’analyse.
   4. Déterminer la densité cellulaire optimisée selon confluence contre le temps (environ 100 % confluent dans 6-18 h selon où commence le test de migration).
      Remarque : La quantité de temps qu’il faut augmenter les cellules à confluence varie en fonction de la dilution de semis.

5. les jours 1 et 2 : préparation à la Migration et les analyses d’Invasion

1. Le jour 1, enduire la plaque pour l’analyse de l’invasion.
   Remarque : gel ECM doit toujours être manipulé sur la glace et des conseils qui ont été placés dans le réfrigérateur pendant la nuit.
   1. Diluer le gel de l’ECM avec des milieux de culture glacée à 100 µg/mL et ajouter 50 µL de gel dilué ECM et des médias dans les puits désignés.
   2. Place la plaque à conditions standard d’incubation pour la nuit.
2. Jour 2, aspirez doucement les médias excédentaires. Plaque de cellules avec des densités de cellule optimisée en 2 plaques de 96 puits, désignés pour le test de migration (non enrobé) et le dosage d’invasion (enduites) dans réanalysés après les chapitres 1 à 3 en fin d’après-midi (dans le protocole actuel, les densités de semis optimisés pour ZR75-1 et MDA-MB-231 ont été 90 000/puits et 50 000/puits, respectivement).
3. Placer les plaques à conditions standard d’incubation du jour au lendemain.

6. jour 3 : Blessure Scratch

1. Vaporiser et essuyer l’outil de grattage et 2 bateaux avec l’éthanol à 70 % à laver avant de les placer dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Remplir le bateau de lavage 1 et 2 avec exactement 45 mL de stérile (autoclave) éthanol distillé eau et 70 % respectivement.
2. Pour la stérilisation, placez le bloc outil de grattage de la tige (en haut) sur LAVAGE bateau 1 et 2 de 5 min chacun.
3. Commencez par la plaque de test de migration.
   1. Déplacez le plateau contenant des cellules de l’incubateur et assurez-vous qu’aucun puits n’est sec pour éviter tout endommagement de l’outil de grattage. Enlevez la plaque et insérer dans le support de plaque de base de l’outil de grattage et placer soigneusement la partie supérieure sur la pièce de base en guidant les chevilles. Maintenez la manette noire et pendant ce temps, soulevez le bloc de la tige. Lacunes dans chaque puits sont généralement visibles à le œil nu et au microscope.
   2. Tremper rapidement les tiges dans l’eau ; Cela suffit nettoyer l’outil gratter avant de rayer la plaque de test invasion si l’installation de la plaque est identique. Sinon, répétez les étapes de stérilisation avec l’eau distillée stérile, puis de l’éthanol à 70 % de 5 min chacun.
4. Lavage des temps de plaque 1 ou 2 avec les milieux de culture pré chauffé afin d’éviter des cellules individuelles ou cellule feuilles de reconnexion dans le puits.
5. Ajouter 100 µL de médias chauds frais dans les puits désignés avec ou sans traitements.
6. Étapes supplémentaires pour l’analyse de l’invasion.
   1. Placer la plaque de test invasion à 4 ° C pendant 5 min à équilibrer, aspirer soigneusement les médias froids.
   2. Diluer le gel de l’ECM avec des milieux de culture glacée à 5 mg/mL, ajouter 50 µL de gel d’ECM dilué dans les puits désignés et placer sous standard d’incubation pendant 30 min.
   3. Ajouter 100 µL de médias réchauffé avec ou sans test composés.
7. Placer la plaque dans l’imagerie de cellules vivantes et laisser équilibrer pendant 5 min. choisissez Type de navire comme plaque d’imagelock. Définissez Type de Scan comme Scratch enroulés, choisir ou modifier le Modèle de numérisation selon le paramétrage de la plaque expérimentale (1 image/puits et mode "wide") et planifier 24 h répétition analyse toutes les 1-2 h pendant 72 h jusqu'à ce que les plaies sont cicatrisées.
8. Pour nettoyer l’outil de grattage, mettre le bloc haut pin dans chacune des solutions suivantes (45 mL de lavage des bateaux) pour 5 min : 0,5 % de détergent 1 détergent de 1 % (voir Table des matières), 2 (voir la Table des matières), stérile distillée eau et 70 % d’éthanol. Placez l’outil de grattage sur son socle et le magasin dans un environnement sans poussière.

7. analyse de données

1. Arrêter le balayage de la plaque désignée après que toutes les blessures ont guéri en choisissant la plaque expérimentale sur le Tiroir d’installation en cliquant sur Supprimer navire.
2. Recueillir les images représentatives 3-6, qui couvrent un éventail de pourcentages sonores, y compris le droit d’images après que la blessure a été faite, fermeture de plaie par 10 % et 50 %.
3. Pour déterminer une définition d’un traitement convenable, utilisez Le réglage de Segmentation, nettoyage et filtres à appliquer appropriée Scratch enroulés et Confluence photomasque. Aperçu courant/all permet d’afficher la précision des masques.
4. Lancer la tâche d’analyse.
5. Données peuvent être analysées dans le logiciel ou exportées pour une analyse ultérieure. Trois paramètres fournis par le logiciel peuvent être utilisés pour évaluer les images HD-phase : la confluence (%) de la largeur (µm), blessure et densité plaie relative (%). Comparaisons nous le verrons dans la section suivante.

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Résultats

Ce test de migration/invasion repose sur le dosage de guérison de blessure, qui évalue le taux des cellules se déplaçant dans une zone acellulaire, créée par l’outil de grattage 96 broches. La différence entre les essais de migration et invasion sont que migration des analyses des cellules de mesure se déplaçant sur les culture de tissus traitée en plastique surface invasion mesures des cellules et se déplaçant à travers le gel de l’ECM.

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Discussion

Migration et invasion sont des paramètres importants pour évaluer la mobilité des cellules cancéreuses. En utilisant l’outil de grattage 96 broches, il est possible de procéder à la guérison des dosages en 2D et 3D en même temps. En dehors de faciliter la numérisation automatique, offrant un milieu de culture des variétés de cellule stables avec le minimum de perturbations, la gratter essai effectué à l’aide de l’outil de grattage 96 broches fournit des plaies gratter cohérentes, permettant des expér...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom	Essen	4379
EVE Counting slides	BioTools	EVS-50
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories	Essen	4444	Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit	Essen	4493	Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live cell analysis system
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175