Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Resumo

O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.

Resumo

Mobilidade de células de câncer é crucial para a iniciação de metástase. Portanto, a investigação do movimento da célula e capacidade invasiva é de grande importância. Ensaios de migração fornecem uma visão básica do movimento de célula a um nível 2D, Considerando que os ensaios de invasão são fisiologicamente mais relevantes, imitando a expulsão de célula de câncer em vivo do site original e invadindo através da matriz extracelular. O protocolo atual fornece um único fluxo de trabalho para os ensaios de migração e invasão. Juntamente com a automatizado microscópica câmera integrada para imagens HD em tempo real e análise de built-in módulo, dá pesquisadores um tempo-eficiente, simples e reprodutível opção experimental. Este protocolo inclui também substituições para os consumíveis e métodos de análise alternativos para os usuários a escolher de.

Introdução

Migração celular e invasão são importantes processos biológicos que permitem que as funções normais do corpo humano, tais como fechamento de ferida, invasão da placenta no útero e glândula mamária morfogênese^1,2,3. O corpo humano tem controle preciso e rigoroso destes eventos biológicos; no entanto, existem algumas exceções. Tumores malignos, por exemplo, são capazes de escapar esta salvaguarda, apresentam proliferação anormal e invadir no tecido vizinho, que é chamado de metástase. Metástase é a principal causa de mortalidade relacionadas ao câncer⁴.

Câncer de mama é o mais comumente diagnosticado câncer em mulheres e é a segunda maior causa de morte por câncer entre as mulheres em países desenvolvidos no mundo⁵. Câncer de mama origina-se ductos ou lóbulos que consistem em uma ou mais camadas de células epiteliais. Na mama normal, as células epiteliais aderem um ao outro e a membrana basal através de proteínas de membrana, tais como E-caderina e integrinas⁶. No entanto, as células de câncer de mama invasivo perderam sua polaridade e adesão célula-célula e classicamente submetido a transição mesenquimal epitelial (EMT) e ganham a habilidade de mover-se. Após o extravasamento, estas células se movem a matriz extracelular (ECM) e insira o vaso sanguíneo ou o sistema linfático, seguido depois por intravasation e crescimento metastático⁷. Compreender os mecanismos pelos quais isso ocorre é de grande importância, desde que a metástase é a causa mais comum de mortalidades relacionadas ao câncer e está intimamente relacionado ao câncer celular migração/invasão. Para visualizar o movimento de células cancerosas, os ensaios de migração e invasão são modelos ideais para estudar o movimento de célula 2D e 3D, respectivamente. Migração avalia diretamente o movimento das células Considerando que invasão envolve a interação com o microambiente e a capacidade de degradar as barreiras biológicas. Os dois processos não são totalmente independentes um do outro, como a migração é uma exigência da invasão.

Vários métodos foram desenvolvidos para estudar a migração e invasão. Como comentado por Kramer et al., ensaios de migração, tais como a cicatrização de feridas, vedação e ensaios de microtransportadora geram uma área livre de célula para permitir que as células a habitar, avaliando a mudança de área; Considerando que, em ensaios transwell e capilar baseiam-se no número de células que se movem em direção a um atrator⁸. Para ensaios de invasão, um ambiente de ECM deve ser instituído com gel de ECM ou colágeno por exemplo, e movimento 3D pode ser avaliado, monitorando as contagens de área, distância e célula de invasão (por exemplo, transwell ensaio, ensaio de ornitorrinco)⁸. Um outro tipo de ensaio de invasão é combinar as células invasoras com células não-invasiva e avaliar o comportamento das células invasoras (por exemplo, ensaios de esferoide). Os métodos acima tem seus prós e contras e uma maneira fácil de abordagem, fácil de repetir e combinar o ensaio de migração e invasão de ensaio em um fluxo de trabalho semelhante é preferencial em delineamento experimental.

Este protocolo descreve a medição da migração celular e invasão usando um gerador de imagens de viver-pilha. É uma célula em tempo real, monitoramento de sistema instalado em uma incubadora de cultura de célula padrão. É preciso de imagens de alta definição, de acordo com o conjunto de varredura intervalos e medições, aplicando máscaras adequadas para as células ou alvos fluorescentes. O módulo de ensaio de migração/invasão inclui o uso de uma ferramenta para raspar 96 pinos, que é apropriada para fazer feridas zero homogêneas em uma monocamada de células em uma placa de 96 poços. O mecanismo baseia-se em vitro ferida cura ensaios, monitorar a movimentação de pilha 2D em um plástico ou superfície revestida. Invasão ou movimento 3D através de um ECM adicional dentro do zero ferido também pode ser avaliado. Um fluxo de trabalho breve é ilustrado na Figura 1.

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Protocolo

Nota: Duas linhas de célula devem ser tratadas separadamente. Os procedimentos a seguir devem ser aplicados a uma linha única célula se não especificados.

1. otimizar a densidade celular antes ferindo

1. Cultura de células aderentes em frascos de cultura de tecidos de² T75 cm a cerca de 80% confluência no de vermelho de fenol livre Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 200 mM L-glutamina e 2 insulina µ g/mL a 37 ° C com 5% CO₂ ( condições de incubação padrão para a maioria das linhas de células de câncer, formulações de cultura são células dependentes de linha).
2. Remova a mídia de cultura pipetando fora em um recipiente de resíduos. Pipetar 2 mL de pré-aquecido 0,1% do trypsin-EDTA para brevemente enxaguar a monocamada de células e a pipeta. Adicionar outro 2 mL de 0,1% do trypsin-EDTA e colocá-lo sob condições padrão de incubação a 37 ° C por 5 min.
3. Bata levemente o frasco para assegurar o desprendimento das células e em seguida, adicionar 10 mL de meios de cultura previamente aquecido para parar a reação proteolítica.
4. Transferi a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL e spin-down a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Cuidadosamente, remover o sobrenadante sem agitar o centrifugado e ressuspender com outro 10 mL meio de cultura previamente aquecido.

2. contar o número de célula, usando um contador automatizado de células (ou quaisquer métodos de contagem)

1. Diluir 200 µ l de suspensão de células ressuspensão com 800 µ l de 1 x fosfato de Dulbecco tamponado salina (DPBS) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
2. Anexar um sensor de contagem de células de 60 µm para o contador de célula, mantenha pressionado o toggle e mesclar a ponta a suspensão de eritrócitos. Libere lentamente a alavanca até que a suspensão de células com êxito é arrastada para o sensor. Concentração de célula é exibida em células/mL.
3. Calcule o número de células na suspensão de célula de 10 mL.

3. célula chapeamento

1. Células de placa a uma variedade de densidades de célula (40.000-90.000 células/poço) em triplicado em uma placa de 96 poços.
2. Colocar a placa para o tonalizador de viver-pilha e agendar a varredura a cada 2 h por 24h.
   1. No software, clique em agenda varreduras da lista de tarefas. No painel de configuração da gaveta, determinar a posição da placa, clique em Adicionar navio e escolher o tipo de placa. No painel de Configuração de digitalização , escolha ou editar o padrão de varredura de acordo com a instalação de placa experimental e definir o Tipo de varredura como padrão.
   2. Clique com o botão direito sobre a linha do tempo e selecione Definir intervalos. Como Adicionar examina cada 2 h, a uma programação de 24 horas. Clique em aplicar.

4. determine a célula ideal de densidade de semeadura para o ensaio de migração

1. Stop digitalização após 24 h, aplicam-se a confluência de ferramenta de análise para as imagens de contraste de HD-fase automaticamente coletadas de processamento e gerar uma curva de proliferação celular contra o tempo.
   1. Determinar imagens representativas de 3-6 e colocá-los em uma nova Coleção de imagens.
   2. Determine uma máscara adequada como Definição de processamento.
   3. Lançar um trabalho de análise.
   4. Determinar a densidade celular otimizada de acordo com a confluência contra o tempo (aproximadamente 100% confluência dentro de 6-18 h dependendo quando começa o ensaio de migração).
      Nota: A quantidade de tempo que leva para crescer as células a confluência varia de acordo com a diluição de semeadura.

5. dias 1 e 2: preparação para migração e invasão

1. No dia 1, revesti a placa para o ensaio da invasão.
   Nota: gel de ECM deve sempre ser tratada no gelo e com dicas que foram colocadas na geladeira durante a noite.
   1. Diluir o gel de ECM com meios de cultura gelado a 100 µ g/mL e adicionar 50 µ l de diluídos ECM/meio gelatino em poços designados.
   2. Lugar a placa em condições de incubação padrão durante a noite.
2. No dia 2, aspire suavemente os meios de comunicação em excesso. As células da placa com densidades de célula otimizado em 2 placas de 96 poços, designadas para o ensaio de migração (sem revestimento) e o teste de invasão (revestido) na triplica a seguir seções 1-3 no final da tarde (no actual protocolo, densidades de semeadura otimizados para ZR75-1 e MDA-MB-231 foram 90.000/poço e 50.000/poço, respectivamente).
3. Coloque as placas em condições de incubação padrão durante a noite.

6. dia 3: Ferida zero

1. Pulverizar e limpe a ferramenta para raspar e 2 barcos com etanol a 70% de lavagem antes de colocá-los na biossegurança do armário. Encha o barco de lavagem 1 e 2 com exatamente 45 mL de estéril (autoclavado) destilada água e 70% etanol, respectivamente.
2. Para a esterilização, coloque o bloco de pin de ferramenta para raspar (top) na lavagem do barco 1 e 2 por 5 min cada.
3. Comece com a placa de ensaio de migração.
   1. Mova a placa que contém células de incubadora e certifique-se de que nenhum poço está seco para evitar danos da ferramenta zero. Remova a tampa da placa e inserir no suporte da placa de base da ferramenta zero e coloque cuidadosamente a parte superior para a parte de base, orientando os passadores. Pressione e segure a alavanca preta e enquanto isso, Retire cuidadosamente o bloco de pin. As lacunas em cada poço são normalmente visíveis a olho nu e ao microscópio.
   2. Mergulhe rapidamente os pinos na água; Isto é suficiente para limpar a ferramenta para raspar antes de riscar a placa de ensaio de invasão se a configuração da placa é idêntica. Caso contrário, repita as etapas de esterilização com água destilada estéril e, em seguida, etanol a 70% por 5 min cada.
4. Lavar as vezes de prato 1 ou 2 com meio de cultura previamente aquecido para evitar desanexadas células ou célula folhas recolocar ao poço.
5. Adicione 100 µ l de mídia quente fresca em poços designados com ou sem tratamentos.
6. Etapas adicionais para o ensaio da invasão.
   1. Coloque a placa de ensaio de invasão a 4 ° C por 5 min equilibrar e Aspire cuidadosamente os criogênicos.
   2. Diluir o gel de ECM com meios de cultura gelado a 5 mg/mL, adicionar 50 µ l de gel de ECM diluído em poços designados e coloque sob o padrão incubação durante 30 min.
   3. Adicione 100 µ l de mídia aqueceu com ou sem testar compostos.
7. Coloque a placa em viver-pilha imager e deixá-lo a equilibrar-se 5 min., escolher Tipo de navio , como a placa de imagelock. Definir o Tipo de varredura como Coçar ferida, escolher ou editar Padrão de varredura de acordo com a instalação de placa experimental (1 imagem/bem e modo amplo) e programar 24-h repetição digitalização cada 1-2 h para 72 h até que as feridas são curadas.
8. Para limpar a ferramenta para raspar, colocar o bloco de pin superior em cada uma das seguintes soluções (45 mL em barcos de lavagem) para 5 min: 0,5% de detergente 1 detergente de 1% (ver Tabela de materiais), 2 (ver Tabela de materiais), etanol água e 70% de água destilada estéril. Coloque a ferramenta zero volta para sua placa de base e a loja em um ambiente livre de poeira.

7. análise de dados

1. Pare a varredura da placa designada depois que todas as feridas sararam escolhendo a placa experimental sobre a Configuração de gaveta e clicando em Remover o vaso.
2. Recolha imagens representativas 3-6, abrangendo uma gama de percentagens de som, incluindo o direito de imagens após o ferimento foi feito, fechamento de ferida em 10% e 50%.
3. Para determinar uma definição de processamento adequado, use Segmentação ajuste, limpeza e filtros para aplicar adequado Coçar ferida máscara e Máscara de confluência. Use Visualização corrente/tudo para exibir a precisão das máscaras.
4. Inicie o trabalho de análise.
5. Dados podem ser analisados dentro do software ou exportados para posterior análise. Três métricas fornecidas pelo software podem ser usadas para avaliar as imagens HD-fase: ferida confluência de largura (µm), ferida (%) e a densidade relativa da ferida (%). As comparações serão discutidas na seção a seguir.

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Resultados

Este ensaio de migração/invasão baseia-se o ensaio de cura da ferida, que avalia a taxa das células entrando uma área livre de celular criada pela ferramenta zero 96 pinos. A diferença entre os ensaios de migração e invasão são que ensaios de migração células medida movendo-se sobre os tecido-cultura tratada plástico superfície e invasão medidas células movendo gel de ECM.

A ferramenta para raspar é projetada p...

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Discussão

Migração e invasão são parâmetros importantes para avaliar a mobilidade das células cancerosas. Usando a ferramenta para raspar 96-pin, é possível realizar a ferida cura ensaios em 2D e 3D simultaneamente. Além de facilitar a varredura automática, proporcionando um ambiente de cultura celular estável com o mínimo de interrupção, o zero ensaio realizado com o uso da ferramenta para raspar 96 pinos fornece consistentes feridas zero, permitindo que as experiências que são mais robustas e pode ser reproduzido...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom	Essen	4379
EVE Counting slides	BioTools	EVS-50
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories	Essen	4444	Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit	Essen	4493	Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live cell analysis system
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175