ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Summary

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

Abstract

מגבלות שונות של 2D מערכות תרבות תא יש התעניינות בתרבות תא תלת-ממד ופלטפורמות ניתוח, אשר יהיה טוב יותר לחקות את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות החיים ולחקות בפונקציות רקמה vivo. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות microfabrication הקלו את ההתפתחות של 3D בסביבות מבחנה שבהם תאים ניתן לשלב לתוך מטריצה החילוץ מוגדר היטב (ECM) וערכה מוגדרת של מסיסים או מטריצה הקשורים. עם זאת, מחסומים טכנולוגיים הוגבלה שימוש נרחב במעבדות מחקר. כאן, אנו מתארים שיטה לבנות מכשירים פשוטים לתרבות תלת-ממדית וניסויים עם תאים ואורגנואידים רב-תאיים בסביבות תלת-ממד עם מעבר צבע כימוסטנט מוגדר. אנו ממחישים את השימוש בפלטפורמה זו לניתוח התגובה של תאים אפיתל ואורגנואידים למעברי צבע של גורמי גדילה, כגון גורם גידול באפידרמיס (EGF). מעברי הצבע EGF היו יציבים במכשירים במשך מספר ימים המובילים להקמת ענף בבימוי אורגנואידים השד. ניתוח זה איפשר לנו להסיק שמעבר הצבע הקולקטיבי הרגיש לפי קבוצות תאים רגיש יותר לעומת תאים בודדים. כמו כן, אנו מתארים את שיטת הייצור, אשר אינה דורשת מתקני פוטוגרפיה ולא טכניקות ליתוגרפיה רכות מתקדמות. שיטה זו תהיה מועילה לחקר התנהגויות סלולריות תלת-ממדית בהקשר של ניתוח התפתחות ומצבים פתולוגיים, כולל סרטן.

Introduction

בסביבה הפיסיולוגית, התאים מוטבעים במטריצה מועלת (ECM) ונחשפת למגוון רחב של biomolecules. אינטראקציות בין תאים לבין מיקרואקולוגיה סביב ויסות תהליכים תאיים השליטה בפנוטיפים מגוונים, כולל הגירה, צמיחה, בידול והישרדות^1,2. הרבה למדו על התנהגויות סלולריות בתרבות התא 2D קונבנציונאלי. עם זאת, עם הופעתו של הדמיה וניסויים עם תאים המוטבעים בתוך 3D הידרוג'לים, הבדלים חשובים התנהגויות תא זוהו ב-2D פשוטה בתרבויות מבחנה לעומת 3D רקמות כמו בסביבות. בעוד תאים אינטראקציה עם סיבי ECM ולחוש תכונות מכניות שלהם בתוך מטריצה תלת-ממדית, קשיחות החומר של ג'ל אינו משתנה בלתי תלוי לחלוטין ב-2D במערכת מבחנה. הממד משנה מערך הדבקה מוקד, וכתוצאה מכך מורפולוגיה והתנהגות של תאים שונים. יתר על כן, תאים על פני שטח דו-ממדי חשופים ליותר אותות איתות מאשר תאים הפתוחים לכל הכיוונים ב-3D.

מגבלות אלה הגדילו את האינטרסים עבור מערכות 3D המייצגים את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות החיים ולנבא טוב יותר בפונקציות vivo רקמה. הם פותחו בצורות רבות של אורגנואידים כמו הרכבה עצמית מיקרו מבנים סלולריים לתאים באופן אקראי ב ecm^3,4. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות microfabrication הקלו את הופעתו של סוגים שונים של 3d מערכות תרבות^5,6,7,8,9 עבור לימוד שינויים פנוטיפים ו תגובות סלולריות לאותות מסיסים; עם זאת, מחסומים טכנולוגיים מגבילים את השימוש הנרחב במעבדות המחקר. במקרים רבים, תהליכי הייצור דורשים טכניקות ליתוגרפיה ורקע לדפוס רך. יתר על כן, גורמים שונים חייבים להיות נשלט כדי לבנות בהצלחה מכשיר להשיג פונקציה אופטימלית של המכשיר על פני תקופה ארוכה של זמן.

השיטה שלנו מתארת כיצד לבנות התקן 3D PDMS לשילוב תאים ואורגנואידים רב-תאיים לתוך המיקרו מיקרו הסביבה עם מעברי הצבע המוגדרים כימוסטנט ולאחר מכן לנתח את התגובות האפיתל ל-EGF¹⁰. הנתונים שלנו חושפים כי הקיבולת של אורגנואידים להגיב על מעברי egf רדוד נובע צימוד כימי התרבות באמצעות צמתים הפער. הוא מציע את הפוטנציאל של אורגנואידים לזיהוי מדויק יותר של קלט מדורגים חלש ורועש מרחב. תהליך הייצור אינו מצריך מתקן חדר נקי ושיטות פוטוגרפיה. עם זאת, המכשיר 3D PDMS כולל את הגורמים הדרושים של הסביבה הפיסיולוגית 3D. שיטה זו תהיה מועילה ללמוד התנהגויות סלולר 3D ויש לו פוטנציאל מחקר גדול עם סוגי תאים שונים, כימומי, ו ECM שילובים.

Protocol

כל עבודת החיות נערכה בהתאם לפרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש, אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בית הספר לרפואה.

1. הייצור של המכשיר מסופלודיום

1. עיצוב המסיכה של התבנית עבור התקן PDMS באמצעות תוכנת CAD 3D.
2. הדפס את העובש באמצעות ציוד סטריאואוליתוגרפיה עם שרף עמיד תרמית.
   הערה: ההליכים המתוארים כאן בוצעו על-ידי שירות הדפסה תלת-ממדי מסחרי.
3. מערבבים ביסודיות פתרון מונומר PDMS עם סוכן ריפוי ביחס 10:1. 3 מ ל של תערובת PDMS נדרש עבור הייצור של המכשיר. אמצעי האחסון הכולל תלוי במספר התבניות שיש לזייף.
4. דגה את התערובת על ידי החלת ואקום עם שימוש בתוך הבית ואקום מעבדה או משאבת ואקום desiccator במשך שעה אחת.
5. הפוך את המשטח של העובש עם סרט דביק כדי להסיר אבק, ולאחר מכן יוצקים את תערובת PDMS לתבנית. אם בועות מוצגים בתהליך, לחזור על הdesiccator ואקום. בועות לכוד בין עמודי העובש ניתן להסיר על ידי לדקור אותם עם מחט חדה.
   הערה: התהליך החסר בטמפרטורת החדר צריך להתבצע תוך שעה או פחות.
6. לרפא את PDMS על ידי חימום ב 80 ° c עבור 2 שעות. הניחו לעובש להתקרר בטמפרטורת החדר.
7. לחתוך את הגבול בין העובש ו-PDMS עם להב ולאחר מכן לקלף PDMS מן העובש בזהירות.
8. לקצץ את החלק PDMS כדי להתאים את 22 מ"מ x 22 מ"מ coverslip ולחבוט חור על הים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
9. לנקות את החלק PDMS ו 22 מ"מ x 22 מ"מ coverslip ידי ניגוב משטחים עם ברקמות נמוך-מוך ו 70% אתנול. לאחר מכן להסיר חלקיקי אבק גדולים על ידי באמצעות מדבקה דבק.
10. לחטא את החלק PDMS ואת שמיכות על ידי אוטוקלינג (121 ° c עבור 8 דקות רטוב, 15 דקות יבש) או חשיפה לאור UV במשך שעה אחת.
11. לטפל במשטח התחתון של חלק PDMS ולכסות את הכיסוי עם האקדח הכתר פריקה עבור 5 דקות בשכונה תרבות הרקמה ולאחר מכן קשר אותם יחד.
    התראה: הניחו חומר שאינו מתנהל כגון קלקר בתחתית והסירו את כל חומרי הניצוח בתהליך זה. הכנס את הקולגן לתוך המכשיר מיד, בתוך 5 דקות, לאחר הטיפול כדי להגדיל את הקשר בין ג'ל קולגן ושמיכות זכוכית.

2. הכנת תא: בידוד פריאיד ראשי לחלב

הערה: ניתן למצוא את פרטי הבידוד האורגמאיד בעבודה קודמת¹¹. ניתן להכין כל סוג של תא יחיד או אורגנואיד בהתאם לפרוטוקולי הבידוד/ניתוק שלהם.

1. האוהב את רקמת בלוטת החלב של העכברים עם אזמל עד הרקמה מרגיע לנער אותו 30 דקות ב 37 ° c ב 50 mL של הקולגן התמיסה/טריפסין פתרון (10 מ"ל לעכבר) ב DEME/F12 בתוספת עם 0.1 g של טריפסין, 0.1 g של הקולגנאז , 5 מ ל של FBS, 250 μL של 1 μg/mL אינסולין, ו 50 μL של 50 μg/mL gentamicin.
2. צנטריפוגה את הקולגן התמיסה/טריפסין פתרון ב 1,250 x g עבור 10 דקות. הסר את הסופרנטנט על ידי השאיפה. לפזר תאים ב 10 מ ל של Dמאמ/F12, ו צנטריפוגה ב 1,250 x g עבור 10 דקות. לאחר הסרת Dמאמ/F12 על ידי השאיפה, להשעות מחדש תאים ב 4 מ ל של Dמאמ/F12 בתוספת עם 40 μL של DNase (2 יחידות/μL).
3. לנער את הפתרון DNase ביד עבור 2-5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,250 x g עבור 10 דקות.
4. ארגונית נפרדת מתאים בודדים דרך ארבעה centrifugations דיפרנציאלי (הדופק 1,250 x g ולהפסיק את הצנטריפוגה 3-4 s לאחר שהוא מגיע למהירות המיועדת). בין כל פעימה, משלחים את הסופרנטאנט ומשלחים את הגלולה ב -10 מ ל/F12.
5. השהה מחדש את הגלולה הסופית בכמות הרצויה של גידול בינוני של DMEM/F12 עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% אינסולין-הtransferrin-סלניום-X עבור הכנה קולגן.

3. הכנת קולגן והזרקה

הערה: סוגים אחרים של ג'לים ECM יכולים להיות מוכנים בהתאם לפרוטוקולי הגלגנציה שלהם.

1. הכנת מסוג קולגן אני פתרון (3.78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH פתרון, מדיום צמיחה רגילה על קרח.
   הערה: המשך בקרח עד להשלמת ההליך.
2. הוסף 6 μL של 1 N NaOH פתרון, 200 μL של בינוני גדילה ו 50 μL של 10x DMEM לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש ולערבב את הפתרון ביסודיות.
3. הוסף 425 μL של קולגן לתוך הפתרון טרום מעורב ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף.
4. צנטריפוגה את תערובת הקולגן בקצרה (פחות מ 5 שניות) כדי להפריד ולהסיר בועות מן התערובת.
5. לשמור על הפתרון הקולגן מנוטרל על קרח 1 שעה כדי לגרום להיווצרות סיבים.
6. הוסף 50 μL של השעיית תא לתוך תערובת הקולגן וערבבו ביסודיות.
   הערה: ריכוז הקולגן הסופי הוא 2 מ"ג/mL.
7. הכנס את הפתרון באמצעות 200 μL pipet דרך החלל של התקן PDMS עד החדר כולו מתמלא. אם תערובת הקולגן גולשת דרך הפערים של העמודים, לגזור את ג'ל הקולגן עודף עם להב כירורגי חדה לאחר הגלציה.
8. שמור את המכשיר בחממה ב 37 ° c עם 5% CO₂ במשך שעה אחת כדי לגרום לגגנציה.
9. ממלאים את המאגרים בשני הצדדים עם בינוני גדילה ולשמור את המכשיר בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 עד הדמיה קונפוקלית וקד מבוצע.

4.3D הדמיה וכימות

1. התקנת תא חי הדמיה התמונה למיקרוסקופ קונפוקלית וקד ולהגדיר מראש את הטמפרטורה ו-CO₂ כדי 37 ° צ' ו 5%, בהתאמה. כדי לקבל לחות, להוסיף מים במאגר של החדר ומניחים מגבונים רטוב בחדר במידת הצורך.
2. הצב את התקן PDMS בתא והוסף EGF לאחד המאגר כ ' מקור ' של ה-EGF במערך מעבר הצבע. מאגר אחר ישרת ' כיור ' הדרושים לפיתוח התפלגות egf מדורגים מרחב. 2.5 nM של EGF נוספה הכיור לביצוע הדרגתי של 0.5 nM/mm במחקר זה.
3. הגדר את הטווח של מחסנית Z המכסה את עוצמת הריבית של הארגון והפעל את ההדמיה.
   התראה: כדי להימנע מתמונות רעילות, נסה להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה יותר בדימות ממוקד או השתמש בטכניקות הדמיה מרובות פוטון.
4. בנייה מחודש של תמונה תלת-ממדית מערימות של תמונות דו-ממדיות באמצעות תוכנה מסחרית או תוכנית שנעשתה בהתאמה אישית. למדוד את האורך ואת הזווית של ענפים הארכת מאורגנואידים או הגירה של תאים בודדים. כאן, לבצע כימות על ידי ציור מיתאר ביד חופשית סביב הגוף אורגאיד באמצעות ImageJ.

תוצאות

EGF הוא מווסת חיוני של הסתעפות מורפולגנזה בבלוטות החלב ואת כימוג קריטי המנחה את הגירה של תאים אפיתל השד בצמיחה סרטן פולשנית. השתמשנו מכשירים פלואידים מזוסקופיים שתוארו לעיל כדי ללמוד את תגובת התאים כדי להגדיר מעברי EGF (איור 1A, ב)¹⁰. המכ?...

Discussion

הייצור של תבניות PDMS בוצע באמצעות שירות הדפסה תלת-ממדי מסחרי, אבל יכול להתבצע גם על-ידי מדפסת תלת-ממד באיכות גבוהה בתוך הבית. בין שיטות ייצור תלת-ממד, סטריאואוליתוגרפיה מומלצת ליצירת עובש ברזולוציה גבוהה. מכיוון שריפוי PDMS מתרחש בטמפרטורה גבוהה (80 ° c), החומרים צריכים להיות עמידים בפני חום מספ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935