3D анализ Мультиклеточных реакций на Хемоаттрактантные градиенты

Резюме

Мы описываем метод для построения устройств для 3D-культуры и экспериментов с клетками и многоклеточных органоидов. Это устройство позволяет анализировать клеточные реакции на растворимые сигналы в 3D микросредах с определенными хемоаттрактантом градиентами. Органоиды лучше, чем одиночные клетки при обнаружении слабых шумных входов.

Аннотация

Различные ограничения систем 2D клеток культуры вызвали интерес к 3D клеток культуры и анализа платформ, которые лучше имитируют пространственную и химическую сложность живых тканей и имитировать в естественных условиях ткани функций. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали развитию 3D-среды в пробирке, в которой клетки могут быть интегрированы в четко определенную внеклеточной матрице (ЕСМ) и определенный набор растворимых или матричных связанных биомолекул. Однако технологические барьеры ограничивают их широкое применение в исследовательских лабораториях. Здесь мы описываем метод построения простых устройств для 3D-культуры и экспериментирования с клетками и многоклеточных органоидов в 3D микросредах с определенным градиентом хемоаттрактанта. Мы проиллюстрируем использование этой платформы для анализа реакции эпителиальных клеток и органоидов на градиенты факторов роста, таких как фактор эпидермального роста (EGF). Градиенты EGF были стабильными в устройствах в течение нескольких дней, что привело к созданию направленной ветви в органоиды молочной железы. Этот анализ позволил нам заключить, что коллективный градиент зондирования группами ячеек более чувствителен против одиночных ячеек. Мы также описываем метод изготовления, который не требует фотолитографии объектов, ни передовые методы мягкой литографии. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения в контексте анализа развития и патологических состояний, включая рак.

Введение

В физиологических условиях, клетки встроены в внеклеточной матрицы (ЕСГ) и подвергается множество биомолекул. Взаимодействия между клетками и окружающей микросредой регулируют внутриклеточные процессы, контролирующие различные фенотипы, включая миграцию, рост, дифференциацию и выживание^1,2. Многое было изучено о клеточных поведениях в обычной культуре 2D клеток. Однако, с появлением внутриклеточной визуализации и экспериментов с клетками, встроенными в 3D-гидрогели, важные различия в поведении клеток были признаны в упрощенном 2D в пробирке культур против 3D-ткани, как сред. В то время как клетки взаимодействуют с ПОМЕХОГЕНЕРАТОРАМИ и чувствуют их механические свойства в 3D матрице, жесткость материала геля не является полностью независимой переменной в системе 2D в пробирке. Размерность изменяет формирование фокусной адгезии, что приводит к разной морфологии клеток и поведению. Кроме того, ячейки на 2D поверхности подвержены меньшему сигналу сигнализации, чем ячейки, открытые для всех направлений в 3D.

Эти ограничения увеличили интересы для 3D-систем, которые представляют пространственную и химическую сложность живых тканей и лучше предсказать в естественных условиях ткани функции. Они были разработаны во многих формах от органоидов как самостоятельной сборки клеточных микроструктур для клеток случайным чередовались в ЕСГ^3,4. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали появлению различных типов систем 3D-культуры^5,6,7,8,9 для изучения фенотипических изменений и Сотовые ответы на растворимые сигналы; Однако технологические барьеры ограничивают широкое применение в исследовательских лабораториях. Во многих случаях процессы изготовления требуют методов фотолитографии и фоновых знаний для мягкой литографии. Кроме того, необходимо контролировать различные факторы, чтобы успешно построить устройство и достичь оптимальной функции устройства в течение длительного периода времени.

Наш метод описывает, как построить 3D PDF-устройство для включения клеток и многоклеточных органоидов в трехмерную микросреду с определенными градиентами хемоаттрактанта, а затем проанализировать эпителиальные реакции на EGF¹⁰. Наши данные свидетельствуют о том, что способность органоидов реагировать на мелкие градиенты EGF обусловлена межклеточной химической связью через узлы разрыва. В нем предлагается потенциал органоидов для более точного выявления слабых и шумных, территориально дифференцированных входов. Процесс изготовления не требует чистых помещений или техники фотолитографии. Тем не менее, 3D PDF устройство включает в себя необходимые факторы 3D-физиологической среды. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения и имеет большой исследовательский потенциал с различными типами клеток, хемоаттрактанты, и ЕСМ комбинаций.

протокол

Все животные работы были проведены в соответствии с протоколами рассмотрены и утверждены институционального ухода за животными и Комитета по эксплуатации, Университет Джонса Хопкинса, школа медицины.

1. Изготовление мезфлуидических устройств

1. Дизайн маски прессформы для устройства PDF-файлов с использованием 3D CAD программного обеспечения.
2. Печать формы с использованием стереолитографии оборудования с термической устойчивостью смолы.
   Примечание: описанные здесь процедуры осуществлялись коммерческой службой 3D-печати.
3. Тщательно перемешать решение по мономера PDF с лечением агента в соотношении 10:1. для изготовления прибора требовалось 3 мл смеси PDF-файлов. Общий объем зависит от количества изготовленных форм.
4. Дега смеси, применяя вакуум с использованием в доме лаборатории вакуума или вакуумного насоса в вакуумной сушки в течение 1 часа.
5. Нанесите поверхность плесени клейкой лентой, чтобы удалить пыль, а затем вылейте смесь PDF-смеси в форму. Если пузырьки вводятся в процесс, повторите дегазации в вакуумной сушки. Пузырьки ловушке между колоннами формы могут быть удалены, тыкать их с острыми иглы.
   Примечание: процесс дегазации при комнатной температуре должен быть сделан в течение 1 часа или меньше.
6. Вылечить PDF-файлы при нагревании при температуре 80 ° c в течение 2 часов. Дайте плесени остыть при комнатной температуре.
7. Вырезать границу между плесенью и PDF-файлами с лезвием, а затем снимите PDF-файлы из формы тщательно.
8. Обрезать часть PDF-файлы, чтобы соответствовать 22 мм х 22 мм комбинезон и пробить отверстие в входе.
   Примечание: протокол может быть приостановлен здесь.
9. Очистите часть PDF-файлы и 22 мм х 22 мм комбинезон путем очистки поверхностей с низким содержанием волокна тканей и 70% этанола. Затем удалите большие частицы пыли, вытирая клейкой лентой.
10. Стерилизовать PDF-часть и комбинезон либо аутоклюв (121 ° c в течение 8 минут мокрый, 15 минут сухой) или воздействия УФ-излучения в течение 1 часа.
11. Лечить нижнюю поверхность части PDF-файлов и крышка скольжения с короной разряда пушки в течение 5 минут в ткани капот культуры, а затем связать их вместе.
    Предосторежение: положите любой non-дирижируя материал как пена полистирола на дне и извлекайте все дирижируя материалы во время этого процесса. Впрыснуть коллаген в прибор немедленно, не познее 5 минут, после обработки для того чтобы увеличить скреплять между гелем коллагена и покрывным стеклом.

2. Приготовление клеток: первичная изолированность молочной оргаоида

Примечание: Подробная информация о изоляции молочной органоида можно найти в предыдущей работе¹¹. Любой вид одиночной клетки или оргаоида можно подготовить согласно их собственному изоляции/протоколам отряда.

1. Фарш молочной железы ткани мышей с скальпелем, пока ткань расслабляется и поколебать его в течение 30 минут при температуре 37 ° c в 50 мл коллагеназы/трипсина раствор (10 мл на мышь) в DEME/F12 дополнено 0,1 г трипсин, 0,1 г коллагеназы , 5 мл ФПС, 250 мкл 1 мкг/мл инсулина, и 50 мкл 50 мкг/мл гентатамин.
2. Центрифуга раствор коллагеназы/трипсина на 1 250 x g в течение 10 мин. удалить супернатант по аспирации. Дисперсные ячейки в 10 мл ДМ/F12 и центрифуга на 1 250 x g в течение 10 мин. После удаления ДМЕМ/F12 путем аспирации, повторно приостановить ячейки в 4 мл ДМЕМ/F12 дополнено 40 мкл Дназы (2 единицы/мкл).
3. Встряхните раствор дндаза вручную за 2-5 мин, а затем центрифугу на 1 250 x g в течение 10 мин.
4. Отдельные органоиды из одиночных клеток через четыре дифференциальных центрифугирования (пульс 1 250 x g и остановить центрифугу 3-4 s после того, как он достигнет предполагаемой скорости). Между каждым пульсом, Асет супернатант и ресуспензируем гранулы в 10 мл ДМЕ/F12.
5. Re-приостановить окончательный гранулы в нужное количество роста среды ДМ/F12 с 1% пенициллин/стрептомицин и 1% инсулина-трансферрин-селен-х для выработки коллагена.

3. Подготовка и инъекция коллагена

Примечание: другие типы гелей могут быть подготовлены в соответствии с их собственными протоколами Желирование.

1. Приготовьте коллаген типа I (3,78 мг/мл), 10x ДМЭМ, 1 N NaOH раствор, нормальный рост среды на льду.
   Примечание: Держите лед до завершения процедуры.
2. Добавьте 6 мкл 1 N NaOH раствор, 200 мкл роста среды и 50 мкл 10x ДМЭМ в предварительно охлажденной микроцентрифуге трубки и тщательно перемешать раствор.
3. Добавить 425 мкл коллагена в предварительно смешанном растворе и тщательно перемешать, петтинг.
4. Центрифуга смесь коллагена кратко (менее 5 секунд), чтобы отделить и удалить пузырьки из смеси.
5. Держите нейтрализованного раствора коллагена на льду в течение 1 часа, чтобы побудить образование волокна.
6. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в смесь коллагена и тщательно перемешать.
   Примечание: окончательная концентрация коллагена составляет 2 мг/мл.
7. Впрыснуть раствор с помощью 200 мкл пипетки через входе устройства PDF-файлов до тех пор, пока вся камера заполнена. Если коллагеновая смесь переливается через щели столбов, вырезать избыток коллагена гель с острым хирургическим лезвием после gelation.
8. Держите устройство в инкубаторе при температуре 37 ° c с 5% CO₂ в течение 1 часа, чтобы вызвать gelation.
9. Заполните резервуары с обеих сторон с ростом среды и держать устройство в инкубаторе при температуре 37 ° c с 5% CO2 до конфокальной визуализации выполняется.

4.3D визуализация и количественная оценка

1. Установите живую клетку изображения культуры камеры в Конфокальный микроскоп и предварительно установить температуру и CO₂ до 37 ° c и 5%, соответственно. Для того чтобы получить влажность вверх, добавьте воду в резервуаре камеры и положите влажные салфетки в камере если необходимо.
2. Поместите устройство PDF-файлов в камеру и добавьте EGF в один из резервуаров в качестве «источника» EGF в формировании градиента. Другое водохранилище будет служить «раковине», необходимой для развития распределительного распределения по территориально-пространству. 2,5 Нм EGF был добавлен в раковину для изготовления градиента 0,5 Нм/mm в этом исследовании.
3. Установите диапазон Z-стека, охватывающий объем органоидов, представляющих интерес, и запустите изображение.
   Осторожно: чтобы избежать фототоксичности, попробуйте более низкую лазерную интенсивность в конфокальной визуализации или используйте методы мультифотонных изображений.
4. Реконструировать 3D-изображение из 2D-изображений, используя коммерческое программное обеспечение или программу, изготовную на заказ. Измерение длины и угла ветвей, простирающихся от органоидов или миграции отдельных клеток. Здесь, выполните квантификации, опираясь от руки контур вокруг органаид тела с помощью Iiiej.

Результаты

EGF является важнейшим регулятором ветвления морфогенеза в молочных железах и критическим химиотерагоаттрактантом, направляющим миграцию эпителиальных клеток молочной железы при инвазивной опухоли. Мы использовали месоскопик устройства, описанные выше, для изучени...

Обсуждение

Изготовление форм PDF-формы было выполнено с использованием коммерческой 3D-печати, но также может быть выполнена на высоком конце 3D принтера в доме. Среди различных 3D методы изготовления, стереолитографии рекомендуется для высокого разрешения поколения плесени. Поскольку лечение ипрс ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935