化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

要約

我々は、細胞および多細胞オルガノイドを用いて3D 培養および実験のためのデバイスを構築する方法について述べる。この装置は定義された化学誘引物質の勾配の3D 微小環境の可溶性信号への細胞応答の分析を可能にする。オルガノイドは、弱いノイズの入力の検出で単一のセルよりも優れています。

要約

2D 細胞培養システムの様々な制限は、3D 細胞培養および分析プラットフォームに対する関心を呼び起こし、生体組織の空間的および化学的複雑性を模倣し、インビボ組織機能を模倣する。微細加工技術の最近の進歩は、細胞が十分に定義された細胞外マトリックス (ECM) および可溶性またはマトリックス関連の生体分子の定義されたセットに統合することができるインビトロ環境における3D の開発を促進した。しかし、技術の壁は、研究室での普及を制限している。ここでは、化学誘引物質勾配を定義した3D 微小環境において、細胞や多細胞オルガノイドを用いて3D 培養や実験のための簡単な装置を構築する方法について述べる。我々は、上皮細胞の応答の分析のためのこのプラットフォームの使用を説明し、上皮増殖因子 (EGF) などの成長因子の勾配にオルガノイドします。EGF の勾配は、乳房オルガノイドにおける分岐形成を誘導する数日間の装置において安定であった。この分析により、セルのグループによる集合的な勾配検出は、単一のセルよりも敏感であると結論づけることができました。また、リソグラフィー設備や高度なソフトリソグラフィ技術を必要としない製造方法についても述べる。この方法は、癌を含む開発と病理学的状態の分析の文脈で3D 細胞の挙動を研究するのに役立ちます。

概要

生理的環境においては、細胞はセル外マトリックス (ECM) に埋め込まれ、大量の生体分子に曝露される。細胞と周囲の微小環境との相互作用は、遊走、成長、分化および生存を含む多様な表現型を制御する細胞内プロセスを調節する^1,2.従来の2D 細胞培養において細胞の挙動について多くのことが学ばれてきた。しかしながら、3D ヒドロゲルに埋め込まれた細胞を用いた生体画像化および実験の出現により、細胞挙動における重要な相違は、3D 組織様環境と比較して単純化された 2D in vitro 培養で認められるようになった。細胞は ECM 繊維と相互作用し、3D マトリックス内でその機械的特性を感知しますが、ゲルの材料剛性は、2D in vitro システムでは完全に独立した変数ではありません。次元は焦点の付着の形成を変え、異なった細胞形態および行動をもたらす。さらに、2D サーフェス上のセルは、3D のすべての方向に開いているセルよりも少ないシグナリングキューにさらされます。

これらの制限は、生体組織の空間的および化学的複雑性を表す3D システムの関心を高め、インビボ組織機能をよりよく予測する。彼らは、ECM^3,4にランダムに散在する細胞への自己組織化細胞微細構造として、オルガノイドから多くの形で開発されています。微細加工技術の最近の進歩は、表現型の変化を研究するための様々なタイプの3d 培養システム^{5、6、7、8、9}の出現を促進し、可溶性信号への細胞応答;しかし、技術的な障壁は、研究室での普及を制限します。多くの場合、製造プロセスは、軟リソグラフィのためのフォトリソグラフィー技術と背景知識を必要とします。さらに、デバイスを正常に構築し、デバイスの最適な機能を長期間にわたって実現するには、さまざまな要因を制御する必要があります。

我々の方法は、定義された化学誘引物質勾配を有する3D 微小環境に細胞および多細胞オルガノイドを組み込み、その後、EGF¹⁰に対する上皮応答を分析するための 3d PDMS 装置を構築する方法を記述する。我々のデータは、浅い EGF 勾配に応答するオルガノイドの能力が、ギャップ結合を介した細胞間化学的カップリングから生じることを明らかにしている。それは弱く、騒々しい空間的に等級付けられた入力のより精密な検出のためのオルガノイドの潜在性を示す。製造工程はクリーンルーム設備やフォトリソグラフィー技術を必要としません。しかし、3D PDMS デバイスには、3D 生理学的環境の必要な要素が含まれています。この方法は、3D 細胞の挙動を研究するのに役立ち、異なる細胞タイプ、chemoattractants、および ECM の組み合わせによる優れた研究の可能性を秘めています。

プロトコル

すべての動物の仕事は、機関の動物のケアと使用委員会、ジョンズ・ホプキンス大学、医学部によって見直され、承認議定書に従って実施しました。

1. mesofluidic 装置の製作

1. 3D CAD ソフトウェアを使用して PDMS デバイス用の金型のマスクを設計します。
2. 耐熱樹脂の立体造形装置を使用して金型を印刷します。
   注: ここで説明する手順は、市販の3D 印刷サービスによって実行されました。
3. 10:1 の比率で硬化剤と PDMS モノマー溶液を徹底的に混合します。3 mL の PDMS 混合物は、装置の製造のために必要とされた。総容積は製造されるべき型の数によって決まる。
4. 社内の実験室の真空または真空ポンプを真空デシケーターで1時間使用して真空をかけることで、混合物を脱気する。
5. 粘着テープでモールドの表面を軽くし、ほこりを取り除き、PDMS 混合物を鋳型に注ぎます。プロセス中に気泡が導入された場合、真空デシケーター内で脱気を繰り返す。金型の柱の間に閉じ込められた気泡は、鋭い針でそれらを刺すことによって除去することができます。
   注: 室温での脱気プロセスは、1時間以内に行う必要があります。
6. 2時間80° c で加熱して PDMS を硬化させる。金型を室温で冷却できるようにします。
7. 刃で金型と PDMS の境界を切り、型から PDMS を注意深く剥がします。
8. 22 mm x 22 mm のカバースリップにフィットし、インレットに穴を開けるように PDMS 部品をトリムします。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。
9. カバースリップの低い組織と 70% のエタノールで表面を拭くことにより、PDMS 部品と 22 mm x 22 mm のクリーニングを行います。その後、粘着テープで dabbing して大きなダスト粒子を除去します。
10. カバースリップを滅菌し、オートクレーブ (121 ° c、濡れた8分間、15分間乾燥) または1時間の UV 光への曝露によって、PDMS 部品を殺菌します。
11. PDMS 部品の底面とカバースリップをコロナ放電ガンで、ティッシュカルチャーフードで5分間処理し、それらを一緒に結合します。
    注意: 底にポリスチレンフォームなどの非導電材を置き、このプロセス中にすべての導電材を除去します。コラーゲンを、5分以内に、コラーゲンゲルとガラスカバースリップ間の結合を増加させる処置の後、すぐに装置に注入してください。

2. 細胞の準備: 第一次乳腺オルガノイドの分離

注: 乳腺オルガノイド分離の詳細は、前の作業¹¹で見つけることができます。任意の種類の単一の細胞またはオルガノイドは、独自の分離/剥離プロトコルに従って調製することができます。

1. マウスの乳腺組織をメスでミンチさせると、組織が弛緩して、37° c で30分、50 mL のコラゲナーゼ/トリプシン溶液 (マウスあたり 10ml) にデメ/F12 で 0.1 g のトリプシンを添加し、0.1 g のコラゲナーゼ、5 mL の FBS、250μ l の1μ g/mL インスリン、50μ l の50μ g/mL ゲンタマイシンを投与します。
2. コラゲナーゼ/トリプシン溶液を10分間 1250 x gで遠心分離する。吸引によって上澄みを取り除く。10 mL の DMEM/F12 に細胞を分散させ、10分間 1250 x gで遠心分離する。吸引によって DMEM/F12 を除去した後、4 mL の DMEM/F12 で細胞を再懸濁し、40μ l の DNase (2 単位/μ l) を補充した。
3. 2-5 分の手で DNase 溶液を振り、その後10分間 1250 x gで遠心分離します。
4. 1つの細胞から4つの差動 centrifugations (1250 x gにパルスし、それが意図された速度に達した後に遠心分離機 3-4 s を停止する) を通してオルガノイドを分離します。各パルス間で、上清を吸引し、10ml の DMEM/F12 でペレットを再懸濁する。
5. 1% のペニシリン/ストレプトマイシン、およびコラーゲン調製のための 1% インスリン-トランスフェリン-セレン-X を用いて、所望の量の DMEM/F12 の成長培地中で最終ペレットを再懸濁させる。

3. コラーゲンの調製と注入

注: 他のタイプの ECM ゲルは、独自のゲル化プロトコルに従って調製することができます。

1. コラーゲンタイプ I 溶液 (3.78 mg/mL)、10倍 DMEM、1 N NaOH 溶液、氷上の正常成長培地を調製する。
   注: 手順が完了するまで氷の上に保管してください。
2. 6μ l の 1 N NaOH 溶液、200μ l の成長培地および50μ l の 2, マイクロ遠心をあらかじめ冷却されたチューブに加え、溶液を完全に混合する。
3. 425μ l のコラーゲンをあらかじめ混合した溶液に添加し、ピペットでよく混ぜる。
4. コラーゲン混合物を短時間 (5 秒未満) 遠心分離し、混合物から気泡を除去します。
5. 中和したコラーゲン溶液を氷上で1時間保持し、繊維形成を誘導します。
6. コラーゲン混合物に50μ l の細胞懸濁液を加え、よく混ぜる。
   注: 最終的なコラーゲン濃度は 2mg/mL です。
7. 全体のチャンバが充填されるまで、PDMS 装置の入口を介して200μ l pipet を使用して溶液を注入する。コラーゲンの混合物が柱の隙間をオーバーフローした場合、過剰なコラーゲンゲルをゲル化後に鋭い外科用ブレードで切り出します。
8. 5% の CO2 で37° c のインキュベーター内のデバイスを1時間、ゲル化を誘発させます。
9. 成長培地で両側の貯水池を満たし、共焦点イメージングが実行されるまで、5% の CO2 で37° c のインキュベーター内のデバイスを維持します。

4. 3D イメージングと定量化

1. 生細胞イメージング培養室を共焦点顕微鏡に設置し、温度と CO2 をそれぞれ37° c、5% に事前設定します。湿度を上げるには、チャンバの貯留部に水を加え、必要に応じて濡れたワイプをチャンバ内に置きます。
2. PDMS 装置をチャンバ内に置き、グラジエント形成中の EGF の「ソース」として EGF を1つのリザーバに加える。もう1つのリザーバは、空間的にグレーディングされた EGF 分布の開発に必要な「シンク」を提供します。この研究では 0.5 nM/mm の勾配を作るために、シンクに 2.5 nM の EGF を添加しました。
3. 目的のオルガノイドのボリュームをカバーする Z スタックの範囲を設定し、イメージングを開始します。
   注意: 光毒性を避けるために、共焦点イメージングではより低いレーザー強度を試すか、マルチフォトンイメージング技術を使用してください。
4. 商用ソフトウェアまたはカスタムメイドのプログラムを使用して、2D イメージスタックから3D イメージを再構築します。オルガノイドから伸びる枝の長さと角度、および個々の細胞の移動を測定します。ここでは、ImageJ を使ってオルガノイドボディの周りにフリーハンドで輪郭を描くことで定量化を行います。

結果

EGF は、乳腺の形態形成を分岐させ、浸潤性の癌増殖における乳房上皮細胞の遊走を誘導する重要な化学誘引物質である。我々は、上述したメゾスコピック流体デバイスを用いて、EGF の勾配を定義した細胞の応答を研究した (図 1a、B)¹⁰。このデバイスは、幅 5 mm、長さ 10 mm、高さ 1 mm の培養エリアを生成します。培?...

ディスカッション

PDMS 金型の製作は、市販の3D プリンティングサービスを使用して行われましたが、自社内のハイエンド3D プリンタでも実現できます。様々な3D 加工方法の中で、高解像度のモールド生成には立体造形が推奨されます。PDMS 硬化は、高温 (80 ° c) で発生するため、材料は、印刷が外部委託されている場合は、明示的に指定する必要があり、十分に熱耐性でなければなりません。サーマルポストキ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935