趋化梯度多细胞响应的三维分析

摘要

我们描述了一种方法来构建设备的三维培养和实验与细胞和多细胞有机体。该装置允许分析在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号的细胞反应。在检测弱噪声输入时, 有机体优于单个细胞。

摘要

2D 细胞培养系统的各种局限性引发了人们对三维细胞培养和分析平台的兴趣, 这些平台将更好地模拟活组织的空间和化学复杂性, 并模拟体内组织功能。最近在微细加工技术的发展促进了三维在体外环境中的发展, 在这种环境中, 细胞可以被整合到一个明确的细胞外基质 (ECM) 和一组定义的可溶性或基质相关的生物分子。然而, 技术障碍限制了其在研究实验室的广泛使用。在这里, 我们描述了一种方法, 以构建简单的设备, 用于三维培养和实验的细胞和多细胞有机体在三维微环境中具有明确的趋化因子梯度。我们说明了使用这个平台来分析上皮细胞和有机体对生长因子梯度的反应, 如表皮生长因子 (EGF)。EGF 梯度在设备中稳定了几天, 导致乳腺有机体中的定向分支形成。这一分析使我们能够得出结论, 细胞组的集体梯度检测对单个细胞更为敏感。我们还描述了制造方法, 它不需要光刻设施, 也不需要先进的软光刻技术。该方法将有助于研究三维细胞行为的背景下, 分析发展和病理状态, 包括癌症。

引言

在生理环境中, 细胞被嵌入细胞外基质 (ECM) 中, 并暴露在大量的生物分子中。细胞与周围微环境之间的相互作用调节控制多种表型的细胞内过程, 包括迁移、生长、分化和存活^1,2。在传统的2D 细胞培养中, 人们已经对细胞行为有了很多了解。然而, 随着血管内成像和3D 水凝胶中嵌入细胞实验的出现, 在简化的二维体外培养物与三维组织样环境中已经认识到细胞行为的重要差异。当细胞与 ECM 纤维相互作用并在三维矩阵中感知其机械性能时, 凝胶的材料刚度在2D 体外系统中并不是一个完全独立的变量。尺寸改变了焦点粘附的形成, 导致细胞形态和行为不同。此外, 与在3D 中打开向所有方向开放的细胞相比, 2D 表面上的细胞接触到的信号线索更少。

这些限制增加了对代表活组织的空间和化学复杂性的三维系统的兴趣, 并更好地预测体内组织功能。它们以多种形式发育, 从自组装细胞微结构到随机穿插在 ecm^3,4中的细胞。最近在微细加工技术方面的进展促进了各种类型的3d 培养系统^{5、6、7、8、9的出现} , 用于研究表型变化和细胞对可溶性信号的反应;然而, 技术障碍限制了研究实验室的广泛使用。在许多情况下, 制造过程需要光刻技术和软光刻的背景知识。此外, 必须控制各种因素, 才能成功构建设备, 并在很长一段时间内实现设备的最佳功能。

我们的方法描述了如何构建一个 3D PDMS 设备, 将细胞和多细胞有机体整合到具有明确趋化因子梯度的三维微环境中, 然后分析上皮对 EGF¹⁰的反应。我们的数据表明, 有机生物对浅 EGF 梯度的反应能力来自于通过缝隙连接的细胞间化学耦合。这表明有机生物在更精确地检测弱和嘈杂的空间梯度输入方面具有潜力。制造过程不需要洁净室设施, 也不需要光刻技术。然而, 3D PDMS 设备包含了3D 生理环境的必要因素。该方法将有助于研究三维细胞行为, 具有较大的研究潜力, 不同的细胞类型, 趋化因子和 ECM 组合。

研究方案

所有动物工作都是根据约翰·霍普金斯大学医学院动物护理和使用机构委员会审查和批准的协议进行的。

1. 中流体装置的制造

1. 利用三维 CAD 软件设计 PDMS 设备模具的掩模。
2. 使用带有耐热性树脂的立体平版印刷设备打印模具。
   注: 此处描述的过程是由商业3D 打印机构执行的。
3. 以10:1 的比例将 PDMS 单体溶液与固化剂彻底混合。制造该装置需要3毫升的 PDMS 混合物。总体积取决于要制造的模具的数量。
4. 通过在真空干燥器中使用内部实验室真空或真空泵对混合物进行1小时的真空处理。
5. 用胶带将模具表面压入, 去除灰尘, 然后将 PDMS 混合物倒入模具。如果在此过程中引入气泡, 请在真空干燥器中重复脱气。被困在模具支柱之间的泡泡可以通过用锋利的针头戳它们来去除。
   注: 室温下的脱气过程应在1小时内或更短内完成。
6. 在80°c 加热 2小时, 以治疗 PDMS。让模具在室温下冷却。
7. 用刀片切割模具和 PDMS 之间的边界, 然后小心地从模具上剥离 PDMS。
8. 修剪 PDMS 部件以适应22毫米 x 22 毫米的盖板, 并在入口打一个洞。
   注: 协议可以在此处暂停。
9. 用低皮棉组织和70% 乙醇擦拭表面, 清洁 PDMS 部件和 22 mm x 22 mm 覆盖物。然后用胶带轻拍去除大的灰尘颗粒。
10. 通过高压灭菌 (121°c 湿 8分钟, 干燥 15分钟) 或暴露在紫外线下 1小时, 对 PDMS 部件和盖板进行消毒。
11. 在组织培养罩中, 用电晕放电枪处理 PDMS 部件的底部表面和盖滑移 5分钟, 然后将它们粘合在一起。
    注意: 在此过程中, 将任何非导电材料 (如聚苯乙烯泡沫) 放置在底部, 并去除所有导电材料。在治疗后5分钟内立即将胶原蛋白注入设备, 以增加胶原蛋白凝胶与玻璃覆盖物之间的粘合。

2. 细胞制备: 原发性乳腺有机体分离

注: 乳腺有机体隔离的细节可在以前的工作¹¹中找到。任何一种单细胞或有机体都可以根据它们自己的分离/分离协议来制备。

1. 用手术刀将小鼠的乳腺组织弄碎, 直到组织放松, 并在 DEMEE/F12 中的胶原蛋白溶液 (每只小鼠10毫升) 中, 在37°c 时将其摇匀 30分钟, 再加上0.1 克胰蛋白酶, 0.1 克胶原酶FBS 为5毫升, 155μl 为 1μgml, 50μml 为庆大霉素。
2. 以 1, 250 x 克离心胶原酶溶液 10分钟, 通过抽吸去除上清液。在 DMEM/F12 的10毫升中分散细胞, 在 1, 250 x g下离心机10分钟。在抽吸去除 DMMM\ f12 后, 在 DMEM/F12 的4毫升中重新悬浮细胞, 辅以40Μl 的 DNase (2 unitsμl)。
3. 用手晃动 DNase 溶液 2-5, 然后以 1, 250 x 克离心 10分钟.
4. 通过四个差动离心分离单个细胞的有机体 (脉冲到 1 250 x g,并在离心机达到预期速度后停止 3-4秒)。在每个脉冲之间, 吸气上清液, 并在 dmmml f12 中重新悬浮颗粒。
5. 用1% 的青霉素和1% 的胰岛素-转铁硒-x 重新悬浮在 DMM/F12 所需的生长介质中的最后一个颗粒, 用于胶原蛋白的制备。

3. 胶原蛋白制剂和注射

注: 其他类型的 ECM 凝胶可以根据自己的凝胶协议进行制备。

1. 制备胶原蛋白 I 型溶液 (3.78 mg/mL), 10倍 DMEM, 1 N NaOH 溶液, 冰上正常生长介质。
   注: 保持冰, 直到该过程完成。
2. 在预冷的微离心管中加入6μl 的 1 n NaOH 溶液、200μl 的生长介质和50μl 的 10x DMEM, 然后将溶液充分混合。
3. 将425微克利用胶原蛋白加入预混合溶液中, 通过移液彻底混合。
4. 将胶原蛋白混合物短暂离心 (少于 5秒), 从混合物中分离和去除气泡。
5. 将中和胶原蛋白溶液保存在冰上 1小时, 以诱导纤维形成。
6. 将50Μl 细胞悬浮液加入胶原蛋白混合物中, 彻底混合。
   注: 最后胶原蛋白浓度为 2 mg/mL。
7. 使用200μl 管道通过 PDMS 设备的入口注入溶液, 直到整个腔内被填充。如果胶原蛋白混合物溢出通过支柱的缝隙, 切断多余的胶原蛋白凝胶与尖锐的手术刀片后凝胶化。
8. 将设备保持在37°c 的孵化器中, 用5% 的 CO2保持 1小时, 以诱导凝胶化。
9. 用培养基填充两侧的储层, 并将设备保存在37°c 的孵化器中, 并使用5% 的 CO2, 直到进行共聚焦成像。

4. 3D 成像和定量

1. 将活细胞成像培养室安装在共聚焦显微镜上, 并分别预先设定温度和二氧化碳至37°c 和5%。为了提高湿度, 在室内的储罐中加水, 如有必要, 在室内放置湿巾。
2. 将 PDMS 装置放置在腔内, 并将 EGF 添加到其中一个储层中, 作为梯度地层中 EGF 的 "源"。另一个水库将服务于发展空间分级 EGF 分布所需的 "汇"。本研究在水槽中加入了 2.5 nM egf, 使梯度达到 0.5 nmmm。
3. 设置 z 堆栈的范围, 覆盖感兴趣的有机体的体积, 并开始成像。
   注意: 为避免光毒性, 请尝试在共聚焦成像中降低激光强度, 或使用多光子成像技术。
4. 使用商业软件或定制程序从2D 图像堆栈重建3D 图像。测量从有机细胞延伸的分枝的长度和角度或单个细胞的迁移。在这里, 使用 ImageJ 在有机体周围绘制手绘轮廓来执行量化。

结果

EGF 是乳腺分枝形态发生的重要调节剂, 也是指导浸润性癌症生长中乳腺上皮细胞迁移的关键趋化剂。我们使用上述介观流体器件来研究细胞对定义的 EGF 梯度的反应 (图 1a, b)¹⁰。该装置产生5毫米宽、10毫米长、1毫米高的养区。培养区的两侧由六角形柱从开井中分离, 这些柱通过表面张力将液体 ECM 和细胞混合物捕获在细?...

讨论

PDMS 模具的制造是使用商业3D 打印服务进行的, 但也可以通过内部高端3D 打印机来完成。在各种3D 制造方法中, 建议采用立体平版印刷来生成高分辨率模具。由于 PDMS 固化是在高温 (80°c) 下进行的, 因此如果将打印外包, 材料应具有足够的耐热性, 应明确指定。可以与印刷服务公司讨论热后固化问题, 以提高零件的耐热性。印刷服务和材料的细节在材料表中规定。

固?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935