JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

Abstract

הפונקציה מיטוכונדריאלי האופטימלי הוא קריטי עבור פעילות תאית בריאה, במיוחד בתאי בעלי אנרגיה גבוהה דרישות כמו אלה במערכת העצבים, שרירים. בקנה אחד עם זה, תפקוד מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר עצום של מחלות ניווניות והתיישנות באופן כללי. Caenorhabditis elegans כבר מערכת מודל רב עוצמה עבור שחקרתי המורכבות הרבה של הפונקציה מיטוכונדריאלי. נשימה מיטוכונדריאלי הוא סימן חזק של פונקציה מיטוכונדריאלי, respirometers פיתחה לאחרונה מציעים פלטפורמה המדינה-of-the-art כדי למדוד את הנשימה בתאים. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה לנתח חיים, שלמים C. elegans. פרוטוקול זה משתרע על פני תקופה של ~ 7 ימים, כולל שלבי (1) גדל וסינכרון של C. elegans, (2) הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים, equilibration וטעינה של מחסנית סמים (3), (4) הכנת assay תולעת צלחת assay לרוץ ו ניתוח נתונים לאחר הניסוי (5).

Introduction

אדנוזין טריפוספט (ATP), המקור העיקרי של אנרגיה תאית, מיוצר בתוך המיטוכונדריה על ידי אנזימים בשרשרת האלקטרונים תחבורה (וכו ') הממוקם בתוך הקרומית מיטוכונדריאלי הפנימי. פירובט, מטבוליט מפתח מנוצל לייצור ATP מיטוכונדריאלי, מיובא לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי איפה decarboxylated לייצר אצטיל קואנזים A (CoA). לאחר מכן, אצטיל CoA מזין את מעגל קרבס וכתוצאה מכך הדור של nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), מולקולה נשא אלקטרונים מפתח. כמו אלקטרונים NADH מועברים למנהל חמצן דרך ועוד, פרוטונים לבנות בחלל intermembrane מיטוכונדריאלי, דבר המתבטא הדור הצבע אלקטרוכימי על פני הקרום. אלה פרוטונים יזרום אז מן המרחב intermembrane מעבר הדרגתי אלקטרוכימי הזה בחזרה לתוך המטריקס מיטוכונדריאלי דרך הנקבובית פרוטון של ATP סינתאז, נהיגה הסיבוב שלה, הסינתזה של ATP1 (איור 1).

הפונקציה מיטוכונדריאלי אינה מוגבלת ייצור אנרגיה, אבל הוא גם מכריע הומאוסטזיס סידן, מינים חמצן תגובתי (ROS) ניקוי של אפופטוזיס, אנושות מיצוב תפקידם בריאות organismal2. הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להיות מוערך באמצעות מגוון של מבחני, כולל אך לא מוגבל ניתוחים המודדים מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית רמות ATP ו- ROS, ריכוזי סידן מיטוכונדריאלי. עם זאת, אלה מבחני לספק תמונה אחת של פונקציה מיטוכונדריאלי, ולכן אולי לא מספקת תצוגה מקיפה של בריאות מיטוכונדריאלי. מאז צריכת חמצן בעת יצירת ATP הוא מסתמך על מספר עצום של תגובות רציפים, היא מגישה כסמן מעולה של פונקציה מיטוכונדריאלי. מעניין, וריאציות שיעורי צריכת חמצן נצפו כתוצאה בתפקוד מיטוכונדריאלי3,4,5.

שיעורי צריכת חמצן (OCR) של החיים דוגמאות ניתן למדוד באמצעות טכניקות ניתן לחלק לשתי קבוצות: amperometric חיישני חמצן, חומר זרחני מבוססי פורפירין זה יכול לכלותה חמצן6. חיישני חמצן Amperometric נעשה שימוש נרחב מודדים OCR ב בתרבית תאים, רקמות, וב -דגם מערכות, כגון C. elegans. עם זאת, חומר זרחני מבוססי פורפירין המכיל respirometers יש את היתרונות הבאים: (1) שהם מאפשרים השוואה לצד השני של שני מדגמים שהפקידים, (2) הם דורשים גודל מדגם קטן יותר (למשל, תולעים 20 לכל טוב לעומת ~ 2, 000−5, 000 תולעים קאמרית)7, ו- (3) ניתן לתכנת את respirometer לעשות ארבע זריקות מורכבים שונים-רצוי פעמים לאורך כל רץ ניסיוני, ומבטל את הצורך עבור יישום ידני.

פרוטוקול זה, הם שלבים המעורבים בשימוש של פורפירין מבוססות חיישן חמצן respirometer מודדים OCR ב- חיים, שלמים C. elegans מתואר. אמנם יש פרוטוקול בכתב לשימוש בפורמט גדול, תפוקה גבוהה respirometer8, פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם מכשיר ידידותי, נגיש וקטן בהיקף תקציב נוסף. פרוטוקול זה שימושי במיוחד להערכת ההבדל ב- OCR בין שני זנים, שבו לא נדרש ההקרנה תפוקה גבוהה, השימוש בו יהיה מוגזם.

Protocol

הערה: איור 2 מספק מבט סכמטי של פרוטוקול מלא.

1. צמיחה וסינכרון של האוכלוסייה נמטודות9,10

  1. העברת L4 הזחלים של רקע גנטי הרצוי (למשל, N2 [wild type] ובעלי sel-12) על גבי נמטודות מדיה (NGM) לוחיות גדילה (ראה טבלה 1 למתכון) טרי נזרע עם מדשאה Escherichia coli (OP50)11. להשתמש לפחות שני 100 מ"מ או שלוש צלחות 60 מ מ עבור כל זן. דגירה התולעים בטמפרטורה המתאימה צמיחה (בין 15-25 ° C) במשך 3-4 ימים או עד שהצלחות מרוכז עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid.
  2. לשטוף ביצים עם תולעים מהצלחות, באמצעות כ- 6 מ של מאגר M9 (ראה טבלה 1 למתכון) לכל 100 מ מ צלחת של נמטודות ולהעביר אותם עם זכוכית פיפטות פסטר לתוך צינורות בודדים 15 מ"ל צנטריפוגה עבור כל זן. ספין הצינורות האלה למטה למשך 3 דקות ב- 6,180-g ולשאוב החוצה מאגר M9, שמירה רק בגדר חיות וביצים.
  3. להוסיף 3-4 מ"ל של פתרון אקונומיקה (ראה טבלה 1 למתכון) כל שפופרת, לסירוגין מערבולת עבור מאגר M9 להוסיף 6 מינימלית למלא כל שפופרת, ספין-6,180 x g עבור 1 דקות, תשאף תגובת שיקוע. חזור על זה לשטוף עם M9 שלוש פעמים ולהעביר בגדר ביצה אל צינור טריים 15 מ"ל המכיל כ- 9 מ של מאגר M9.
  4. לסנכרן התולעים המקווקו טרי על ידי nutating ב 20 מעלות צלזיוס במשך 16 – 48 ה ספין הצינורות האלה למטה ב 6,180 g x 1.5 דקות ואני אוריד את החיות L1 מסונכרן על לוחות NGM בודדים נזרע טרי עם מדשאה של OP50 (כ 6,000 – 10,000 בעלי. חיים לכל צלחת 100 מ מ) לשמור 20 º C.
  5. בעלי חיים אלה מגיעים הזחל L4 לאחר ~ 42 h. בשלב זה, להעביר הזחלים L4 באמצעות איסוף פלטינה כדי OP50 נזרע NGM צלחות המכילה 0.5 מ ג / מ ל 5-פטור-2'-deoxyuridine (FUdR) כדי למנוע מהם בהפקת רומא.
    הערה: ודא כי במסגרת ניסוי כל זני מסונכרנים עבור כמות דומה של זמן. FUdR טיפול sterilizes החיות ומונעת ביצה הנחת על רומא הייצור, אשר עשויה להשפיע על OCR. בעלי חיים אלה סטיריליים ינותחו למחרת (יום 1 למבוגרים בעלי חיים ב- h ~ 66) עבור וזמינותו. FUdR דווח לפגיעה פיזיולוגיה, תוחלת החיים של תולעים מוטציה מסויימת. לכן, זה צריך להילקח בחשבון כאשר התרופה משמשת עבור עיקור12,13,14. תולעים יכולים גם להיות מעוקר בכך ועשתה מוטציות כגון fem-1(hc17) או fem-3(e2006). עם זאת, מוטציות אלה העלולים להשפיע מיטוכונדריאלי פונקציה.

2. הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים

הערה: במהלך וזמינותו לרוץ, שני שיעורי נשימה הבזליים ו מקסימלי נמטודות נמדדים. נשימה מקסימלי המופעלת את החיות על התוספת של קרבוניל ציאניד-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), ionophore uncoupling זה מפריע קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים ובכך סינתזת ATP על ידי הובלת פרוטונים דרך ממברנה מיטוכונדריאלי, תוך מתן אפשרות שאיבה פרוטונים, אלקטרונים תחבורה וצריכת החמצן להמשיך4,15 חשיפות של סינתזת ATP (איור 1). השלב האחרון וזמינותו מערבת התוספת של אזיד הנתרן (נאן3), מעכבת מתחמי IV ו- V בוכו ', המאפשרת לקבוע שאינו מיטוכונדריאלי נשימה16 (איור 1). ניתן לבצע את הפעולות הבאות יום לפני המרוץ assay בפועל.

  1. להכין מלאי פתרונות של FCCP 1 מ"ל (10 מ מ דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]: 1000 x ריכוז הסופית assay) נאן3 (400 מ dH2o: 10 x ריכוז הסופית assay) ואת החנות ב-20 ° C.
    הערה: הפעל עקומת ריכוז כדי למטב את ריכוז FCCP נדרש להפיק תגובה מקסימלי OCR עבור כל כלי וכל הגדרה מעבדה.
  2. מימה הדיו חיישן על-ידי הוספת µL 200 של dH2O מכל קידוח (ו המאגר המקיף) בצלוחית, להבטיח כי החיישן הגששים טובע dH2O, חנות ללילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: מחסנית יכול להיות שמאל הגששים שקוע עבור עד 72 שעות, אך במקרה לחות מתמשכת, הלוחות צריכים להיות עטוף בסרט פרפין ומאוחסנים ב 4 º C. אם הידרציה לילה אינו אפשרי, כדאי hydrated הדיו חיישן במשך לפחות 4 שעות לפני וזמינותו.
  3. לבטל את גוף החימום בממשק respirometer ולאחסן את המכשיר בתוך חממה 15 ° C ונישלח נמוך וטמפרטורת בתוך המכשיר כדי למנוע התחממות יתר במהלך וזמינותו להפעיל את החיות.
    הערה: respirometer הינו מצויד עם אלמנט חימום אבל לא יכול להיות מקורר. בתוך חממה 15 ° C, respirometer יהיה על טמפרטורה יציבה בין 18 – 22 ° C, אשר הוא חום בריא לתחזוקה C. elegans .

3. סמים equilibration וטעינה של מחסנית

  1. פיפטה החוצה וזורקים את dH2O נהגה מימה החיישן רגשים ולהחליף אותו עם µL 200 של הפתרון calibrant (pH 7.4) כל היטב. לדלל את הפתרון FCCP מניות 100 מיקרומטר FCCP dH2O ולהוסיף 20 µL של הפתרון מדולל הזרקת ליציאה a במחסנית חיישן. הוספת µL 22 של אזיד הנתרן 400 מ ליציאה B של מיכל הדיו סניור.
  2. להפוך את respirometer על מסך הבית בחר התחל; תבניות העמוד יופיע. בדף ' תבניות ', בחר ריקים או תבנית מעוצבת בעבר; הדף קבוצות יופיעו. בדף ' קבוצות ', בחר הבארות A ו- H הבארות רקע והקצה הבארות 6 הנותרים לקבוצות המתאים, לפי התוכנית הניסיונית.
  3. ללחוץ על החץ בפינה הימנית התחתונה כדי לעבור אל הדף פרוטוקול. בדף פרוטוקול, להבטיח כי Equilibrate, התאים הבזליים , זריקות 1 ו- 2 הכפתורים שנבחרו. בדף זה, להתאים את מספר קריאות של OCR הבזליים, וכן OCR מקסימלי (לאחר ההזרקה 1 עם FCCP) ואת שאינו מיטוכונדריאלי OCR (לאחר ההזרקה 2 עם אזיד הנתרן).
    הערה: כל אחת מהמידות לפניו תערובת, רגע צעד ומסגרות הזמן עבור פרמטרים אלה מוצגות בטבלה מס ' 2.
  4. בחר על החץ בפינה הימנית התחתונה, תופיע הודעה שתדווח כדי לטעון את הצלחת מחסנית חיישן. ודא כי הצלחת מחסנית חיישן נטען בהכיוון נכון, ועקוב אחר ההוראות על המסך בקש תזכורת. Respirometer עכשיו equilibrate את מיכל הדיו.
    הערה: equilibration הזה מספק מספיק זמן כדי למקם את החיות כדי להיות לבדיקה לתוך ולס המתאימות של צלחת התא.

4. הכנת צלחת התולעת ואת וזמינותו לרוץ

  1. להוסיף 200 µL מאגר M9 לתוך כל הבארות 8 של צלחת התא ולתוך המאגרים הבארות שמסביב.
  2. לבחור ~ 100 תולעים מהמאמץ כל על גבי לוחות NGM unseeded ואפשר לנוח במשך 2-3 דקות רטוב לסוף של האיסוף פלטינה עם מאגר M9 ולקחת 20 בעלי חיים גיל-מסונכרנות לתוך בארות B-G, עוזב את הבארות רקע A ו- H ריק.
    הערה: לאחר טעינה אחד. ובכן, חכה כ 2 דקות כדי לאפשר את החיות להתמקם בתחתית הבארות. רצוי גם כך עקומת בתולעת מספר לפעול כדי למטב את המספר תולעת לכל טוב עבור כל כלי וכל הגדרה מעבדה.
  3. עד עכשיו, respirometer צריכה להיות מכויל, על ידי לחיצה טוב על המסך, הצלחת המכיל מאגר כיול הוצאת ו ניתן להסיר את respirometer, ואילו מחסנית חיישן נשאר בתוך המכשיר. החלף את הצלחת calibrant לצלחת המכילה בעלי חיים. לטעון את הצלחת לסגור את הדלת על ידי להכות את המשך ומאפשרים וזמינותו לפעול.

5. ניסוי שלאחר הניתוח

  1. לאחר סיום המרוץ assay, ועקוב אחר ההנחיות על המסך להסרת צלחת תא חיישן מחסנית ואת להכניס כונן הבזק ליציאת ה-USB כדי לשמור את הנתונים לרוץ בתבנית של מלחמה. הסר את מיכל הדיו חיישן ולאפשר החיות לתחתית הבארות מסתפק כ 2 דק למקם את הצלחות תא מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ, לספור את מספר בעלי חיים לכל טוב.
  2. פתח את תוכנת ניתוח במחשב, פתיחת הכרטיסיה נורמליזציה לנרמל OCR למספר בעלי חיים. החל תוויות המתאימים עבור הקבוצות השונות תחת הכרטיסייה שינוי, לייצא את הקובץ כקובץ פריזמה לצורך ניתוח נוסף.
    הערה: הממוצע של המדידות חמישה, לפני התוספת של FCCP הוא OCR הבזליים, בעוד הממוצע של המדידות חמישה לאחר FCCP תוספת OCR מקסימלי לבין ממוצע המדידות האחרונות חמש (מינימום של שתי מדידות שצריך לעשות) לאחר תוספת אזיד הנתרן הוא קצב הנשימה הלא-מיטוכונדריאלי. הבדיקה יש לחזור שלוש פעמים כדי לוודא הפארמצבטית.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, OCR של חיות פראי סוג ו מוטנטים שונים sel-12 שלושה זנים היו נחושים. sel-12 מקודד את ortholog C. elegans presenilin17. מוטציות בגן presenilin האנושי הם המפגע גנטי הנפוצים ביותר הקשורים להתפתחות מחלת אלצהיימר משפחתית18. המחקר?...

Discussion

נשימה מיטוכונדריאלי הוא מחוון תובנה של פונקציה מיטוכונדריאלי; לכן, היכולת למדוד את שיעור צריכת החמצן במערכת הביולוגית, בין אם במבחנה או ויוו הוא חשוב מאוד. Respirometers חש רמות החמצן באמצעות חומר זרחני מבוססי פורפירין זה לקבל מתרצה באמצעות חמצן או באמצעות חיישני חמצן amperometric המסתמכים על הדור של...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להכיר את ד ר קווין Bittman להדרכה שלו בהקמת את XFp סוסון ים במעבדה. מכוני הבריאות הלאומיים הענק ש-gm088213 נתמך עבודה זו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm, 60 mm Petri dishesKord-Valmark Labware Products2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubesGlobe Scientific6285
15 mL conical tubesCorning430791
22 × 22 mm coverslipGlobe Scientific1404-10
50 mL conical tubesCorning430829
AgarFisher ScientificBP1423-2
Bacto peptoneBD, Bacto211677
Bacto tryptoneBD, Bacto211705
Bacto yeast extractBD, Bacto212705
BleachGeneric
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Fisher ScientificC79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Abcamab120081
CholesterolFisher ScientificC314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Thomas ScientificC987Y85
Glass Pasteur pipettesKrackeler Scientific6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)Fisher ScientificBP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificBP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-1
Seahorse XFp AnalyzerAgilent
Seahorse XFp FluxPakAgilent103022-100
Sodium AzideSigma-AldrichS2002

References

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
  7. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
  9. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
  10. Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
  12. Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
  13. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
  14. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
  15. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
  16. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  17. Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
  18. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
  19. Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
  20. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144C elegansOCRrespirometer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved