Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Riepilogo

La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.

Abstract

La funzione mitocondriale ottimale è critica per l'attività cellulare sano, particolarmente in cellule che hanno richieste di alta energia come quelli del sistema nervoso e muscolare. Coerente con questo, la disfunzione mitocondriale è stata associata con una miriade di malattie neurodegenerative e invecchiamento in generale. Caenorhabditis elegans sono stati un sistema potente modello per chiarire le molte complessità della funzione mitocondriale. La respirazione mitocondriale è un forte indicatore della funzione mitocondriale e sviluppata di recente respirometers offrire una piattaforma di state-of-the-art per misurare la respirazione in cellule. In questo protocollo, mettiamo a disposizione una tecnica per analizzare dal vivo, intatto di c. elegans. Questo protocollo si estende su un periodo di ~ 7 giorni e include passaggi per la coltivazione e la sincronizzazione di c. elegans, (2) preparazione di composti da iniettare e idratazione di sonde, equilibrazione di caricamento e cartuccia di droga (3), (4) preparazione del dosaggio di vite senza fine (1) piatto e analisi del saggio e analisi dei dati post-esperimento (5).

Introduzione

L'adenosina trifosfato (ATP), la principale fonte di energia cellulare, è prodotto nei mitocondri dagli enzimi della catena di trasporto dell'elettrone (ecc) situati nella membrana mitocondriale interna. Piruvato, un metabolita chiave utilizzato per la produzione mitocondriale di ATP, viene importato nella matrice mitocondriale dove è decarbossilata a produrre acetil coenzima A (CoA). Successivamente, acetil CoA entra nel ciclo dell'acido citrico conseguente generazione di nicotinamide adenindinucleotide (NADH), una molecola del trasportatore di elettrone chiave. Come gli elettroni dal NADH sono passati all'ossigeno tramite l'ecc, protoni costruire nello spazio intermembrana mitocondriale, che provoca la generazione di un gradiente elettrochimico attraverso la membrana. Questi protoni scorrerà quindi dallo spazio intermembrana attraverso questo gradiente elettrochimico indietro nella matrice mitocondriale attraverso il poro del protone del trifosfato di adenosina synthase, guidando la sua rotazione e la sintesi di ATP¹ (Figura 1).

La funzione mitocondriale non è limitata alla produzione di energia, ma è anche fondamentale per l'omeostasi del calcio, specie reattive dell'ossigeno (ROS) lo scavenging e apoptosi, posizionamento criticamente la loro funzione in organismal salute². La funzione mitocondriale può essere valutata utilizzando una varietà di saggi, compreso ma non limitato all'analisi che misurano il potenziale di membrana mitocondriale, livelli di ATP e ROS e le concentrazioni nel calcio mitocondriale. Tuttavia, queste analisi forniscono un singolo snapshot della funzione mitocondriale e pertanto potrebbero non fornire una visione completa della salute mitocondriale. Poiché il consumo di ossigeno durante la generazione di ATP fa affidamento su una miriade di reazioni sequenziale, serve come un indicatore superiore della funzione mitocondriale. Interessante, sono state osservate variazioni nei tassi di consumo di ossigeno a causa di disfunzione mitocondriale^3,4,5.

I tassi di consumo di ossigeno (OCR) di campioni viventi possono essere misurati usando le tecniche che possono essere suddivisi in due gruppi: amperometrico sensori di ossigeno e base porfirinica fosfori che possono essere spenta mediante ossigeno⁶. Sensori di ossigeno amperometrico sono stati ampiamente utilizzati su misura OCR in cellule coltivate, tessuti e in sistemi modello, ad esempio c. elegans. Tuttavia, i fosfori base porfirinica contenente respirometers possiedono i seguenti vantaggi: (1) essi consentono un confronto fianco a fianco dei due campioni in triplice copia, (2) richiedono più piccola dimensione del campione (per esempio, 20 worms per pozzetto contro ~ 2, 000−5, 000 worm sezione)⁷e (3) il respirometro può essere programmato per fare quattro distinte iniezioni composte al desiderato volte nel corso della tiratura sperimentale, eliminando la necessità per l'applicazione manuale.

In questo protocollo, passaggi coinvolti nell'utilizzo di un respirometro di rilevamento dell'ossigeno base porfirinica su misura OCR in live, intatto di c. elegans sono descritti. Mentre esiste un protocollo scritto per l'uso del grande formato, elevato throughput respirometro⁸, questo protocollo è stato adattato per l'uso con uno strumento di cordiale, accessibile e più piccola scala di bilancio più. Questo protocollo è particolarmente utile per valutare la differenza in OCR tra due ceppi, dove high throughput screening non è necessario e il suo utilizzo sarebbe eccessivo.

Protocollo

Nota: Nella figura 2 fornisce una descrizione schematica del protocollo completo.

1. crescita e sincronizzazione di popolazione del nematode^9,10

1. Trasferire le larve L4 di ambiti di provenienza genetici desiderate (ad es., N2 [wild-type] e sel-12 animali) sulle piastre di supporto (NGM) crescita del nematode (Vedi tabella 1 per ricetta) appena seminati con un prato di Escherichia coli (OP50)¹¹. Utilizzare 100mm almeno due o tre piastre di 60 mm per ogni sforzo. Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata (tra 15 – 25 ° C) per 3 – 4 giorni o fino a quando le piastre sono concentrate con gran numero di uova e vermi gravid.
2. Lavare le uova e vermi fuori le piastre utilizzando circa 6 mL di tampone di M9 (Vedi tabella 1 per ricetta) per piastra di 100mm di nematodi e trasferimento con pipette Pasteur in vetro in provette da centrifuga individuale 15 mL per ogni sforzo. Selezione questi tubi verso il basso per 3 min a 6.180 x g e aspirare il buffer di M9, conservando solo il pellet animali e uova.
3. Aggiungere 3-4 mL di soluzione di candeggina (Vedi tabella 1 per ricetta) a ciascuna provetta e a intermittenza vortice per 6 min. aggiungere M9 buffer riempire ogni tubo e spin a 6.180 x g per 1 min e aspirare il surnatante. Ripetere questo lavaggio con M9 tre volte e spostare la pallina di uovo a un tubo da 15 mL fresca contiene circa 9 mL di tampone di M9.
4. Sincronizzare i vermi appena schiusi da nutante a 20 ° C per 16 – 48 h. Spin questi tubi giù a 6.180 x g per 1,5 min e posato gli animali L1 sincronizzati su piatti individuali di NGM appena seminati con un prato di OP50 (circa 6.000-10.000 animali per piastra di 100 mm) e tenere a 20 ° C.
5. Questi animali raggiungerà la fase larvale L4 dopo ~ 42 h. In questo momento, spostare le larve L4 usando un plettro platino per OP50 seminato NGM piastre contenenti 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) per impedire loro di produrre progenie.
   Nota: Assicurarsi che all'interno di un esperimento tutti i ceppi sono sincronizzati per una simile quantità di tempo. Trattamento di FUdR sterilizza gli animali e previene la produzione di covata e progenie uovo, che potrebbe influenzare OCR. Questi animali sterilizzati saranno analizzati il giorno successivo (animali adulti giorno 1 a ~ 66 h) per il dosaggio. FUdR è stato segnalato per un impatto fisiologia e durata della vita di alcuni vermi mutanti. Di conseguenza, questo dovrebbe essere preso in considerazione quando il farmaco è usato per sterilizzazione^12,13,14. Viti senza fine possono essere sterilizzati anche con i mezzi di feminizing mutazioni come fem-1(hc17) o fem-3(e2006). Tuttavia, queste mutazioni potrebbero avere un impatto la funzione mitocondriale.

2. preparazione di composti da iniettare e idratazione delle sonde

Nota: Durante l'analisi del saggio, entrambi i tassi di respirazione basale e massima dei nematodi sono misurati. Massima respirazione viene attivato negli animali dopo l'aggiunta di Carbonil cianuro-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un ionoforo disgiungere che disturba il potenziale di membrana mitocondriale e quindi la sintesi di ATP con il trasporto di protoni attraverso la membrana mitocondriale, mentre permettendo protone pompaggio, trasporto degli elettroni e consumo di ossigeno di procedere^4,15 disgiunto dalla sintesi di ATP (Figura 1). Il passaggio finale nell'analisi comporta l'aggiunta di sodio azide (NaN₃), un farmaco che inibisce complessi IV e V in ecc, che permette di determinare la respirazione non mitocondriale¹⁶ (Figura 1). La seguente procedura può essere eseguita il giorno prima il dosaggio effettivo.

1. Preparare 1 mL soluzioni di riserva del FCCP (10 mM in dimetilsolfossido [DMSO]: 1000 x la concentrazione finale del dosaggio) e NaN₃ (400 mM in dH₂o: 10 x concentrazione finale del dosaggio) e conservare a-20 ° C.
   Nota: Eseguire una curva di concentrazione per ottimizzare la concentrazione di FCCP necessaria per suscitare la risposta massima di OCR per ogni strumento e la regolazione del laboratorio.
2. Idratare la cartuccia sensore aggiungendo 200 µ l di dH₂O a ciascun pozzetto (e il serbatoio circostante) nella piastra, assicurando che il sensore sonde sono sommerse in dH₂O e archivio durante la notte a temperatura ambiente.
   Nota: La cartuccia sonde possono essere lasciati sommersi per fino a 72 h, ma nel caso di una prolungata idratazione, le piastre dovrebbero essere avvolti in film di paraffina e conservate a 4 ° C. Se idratazione durante la notte non è possibile, la cartuccia sensore deve essere idratata per almeno 4 ore prima del dosaggio.
3. Disattivare l'elemento di riscaldamento all'interno dell'interfaccia di respirometro e conservare lo strumento all'interno di un incubatore di 15 ° C durante la notte a bassa temperatura all'interno dello strumento per impedire il surriscaldamento durante l'analisi del saggio gli animali.
   Nota: Il respirometro è dotato di un elemento riscaldante ma non può essere raffreddato. All'interno di un incubatore di 15 ° C, il respirometro avrà una temperatura stabile tra 18 – 22 ° C, che è una temperatura sana per manutenzione di c. elegans .

3. equilibratura di carico e cartuccia droga

1. Pipettare fuori e scartare il dH₂O utilizzato per idratare il sensore sonde e sostituirlo con 200 µ l della soluzione calibratore (pH 7.4) in ciascun pozzetto. Diluire la soluzione di riserva FCCP a 100 µM FCCP in dH₂O e aggiungere 20 µ l della soluzione diluita per l'iniezione porta A nella cartuccia sensore. Aggiungere 22 µ l di sodio azide 400 mM alla porta B della cartuccia senor.
2. Accendere il respirometro e nella schermata home selezionare Start; verrà visualizzata la pagina di modelli. La pagina di modelli, selezionare vuoto o un modello precedentemente progettato; verrà visualizzata la pagina di gruppi. Nella pagina gruppi, selezionare i pozzi A e H come i pozzi di sfondo e assegnare i rimanenti 6 pozzi nei gruppi appropriati in base al piano sperimentale.
3. Premere la freccia in basso a destra per andare alla pagina protocollo. Nella pagina protocollo, assicurarsi che i pulsanti equilibrato, basali e iniezioni 1 e 2 siano selezionati. Su questa pagina, regolare il numero di letture di OCR basale, nonché massima OCR (dopo iniezione 1 con FCCP) e non-mitocondriali OCR (dopo iniezione 2 sodio azide).
   Nota: Ogni misurazione è preceduta da un mix e passaggio di attesa e i tempi per questi parametri sono riportati nella tabella 2.
4. Selezionare la freccia in basso a destra e verrà visualizzato un prompt per caricare il piatto della cartuccia del sensore. Assicurarsi che il piatto della cartuccia sensore è caricato nell'orientamento giusto, seguendo le istruzioni sullo schermo rapido promemoria. Il respirometro sarà ora equilibrare la cartuccia.
   Nota: Questa equilibrazione fornisce tutto il tempo per sistemare gli animali deve essere analizzato nei pozzetti della piastra delle cellule.

4. preparazione del verme piatto e analisi del saggio

1. Aggiungere 200 µ l di tampone di M9 in ognuna delle 8 pozzetti della piastra delle cellule e nei serbatoi che circondano i pozzi.
2. Prendono ~ 100 vermi da ogni ceppo sulle piastre NGM non teste di serie e lasciare riposare per 2-3 min bagnato alla fine del plettro platino con buffer di M9 e pick 20 animali età-sincronizzati nei pozzetti B-G, lasciando vuoti i pozzi di sfondo A e H.
   Nota: Dopo il caricamento ogni bene, attendere circa 2 min per consentire agli animali di depositarsi sul fondo dei pozzetti. Si consiglia, inoltre, che una curva numero di vite senza fine eseguire per ottimizzare il numero di vite senza fine per pozzetto per ogni strumento e la regolazione del laboratorio.
3. Ormai, il respirometro deve essere calibrato e cliccando OK sullo schermo, la piastra contenente tampone di calibrazione viene espulso e può essere rimosso dal respirometro, mentre la cartuccia sensore rimane all'interno dello strumento. Sostituire la piastra di calibratore con la piastra che contiene gli animali. Piastra di carico e chiudere lo sportello premendo continua e permettono il dosaggio per l'esecuzione.

5. analisi dei dati post-esperimento di

1. Una volta che viene completata l'esecuzione di test, seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo per rimuovere la piastra di cella e cartuccia sensore e inserire un'unità flash nella porta USB per salvare i dati di esecuzione nel formato. War. Rimuovere la cartuccia sensore e consentire agli animali di depositano sul fondo dei pozzetti per circa 2 min. Posizionare le piastre di cella sotto uno stereo microscopio per dissezione e contare il numero di animali per pozzetto.
2. Aprire il software di analisi del computer e aprire la scheda di normalizzazione per normalizzare OCR al numero di animali. Applicare etichette appropriate per i vari gruppi sotto la scheda modifica ed esportare il file come un file di prisma per ulteriori analisi.
   Nota: La media delle prime cinque misurazioni, prima che l'aggiunta di FCCP è l'OCR basale, mentre la media delle cinque misurazioni dopo FCCP aggiunta è l'OCR di massima e la media delle ultime cinque misurazioni (dovrebbe essere fatto almeno due misurazioni) dopo l'aggiunta di azoturo di sodio è il tasso di respirazione non mitocondriale. Il dosaggio dovrà essere ripetuto tre volte per garantire la riproducibilità.

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto nel presente documento, OCR di tipo selvaggio animali e tre diversi sel-12 mutante ceppi sono stati determinati. SEL-12 codifica l'ortologo di c. elegans di presenilin¹⁷. Le mutazioni presenilin umana sono l'aberrazione genetica più comune connesso con lo sviluppo del morbo di Alzheimer familiare¹⁸. Nostri studi hanno mostrato i livelli elevati del calcio mitocondriale in se...

Discussione

La respirazione mitocondriale è un indicatore penetrante della funzione mitocondriale; Pertanto, è in grado di misurare i tassi di consumo di ossigeno in un sistema biologico, sia in vitro che in vivo è molto prezioso. Respirometers rilevare i livelli di ossigeno utilizzando base porfirinica fosfori che ottenere placati da ossigeno o tramite sensori di ossigeno amperometrico che si basano sulla generazione di una corrente elettrica proporzionale alla pressione di ossigeno. Elettrodo di Clark rientra nella categoria di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm, 60 mm Petri dishes	Kord-Valmark Labware Products	2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubes	Globe Scientific	6285
15 mL conical tubes	Corning	430791
22 × 22 mm coverslip	Globe Scientific	1404-10
50 mL conical tubes	Corning	430829
Agar	Fisher Scientific	BP1423-2
Bacto peptone	BD, Bacto	211677
Bacto tryptone	BD, Bacto	211705
Bacto yeast extract	BD, Bacto	212705
Bleach	Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Abcam	ab120081
Cholesterol	Fisher Scientific	C314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thomas Scientific	C987Y85
Glass Pasteur pipettes	Krackeler Scientific	6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-1
Seahorse XFp Analyzer	Agilent
Seahorse XFp FluxPak	Agilent	103022-100
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002