JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Özet

En iyi mitokondriyal işlev özellikle yüksek enerji talepleri de sinir sistemi ve kas gibi olan hücrelerde sağlıklı hücresel hareketlilik için önemlidir. Tutarlı, mitokondrial disfonksiyon sayısız nörodejeneratif hastalıklar ve genel olarak yaşlanma ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Caenorhabditis elegans mitokondriyal işlev birçok inceliklerini elucidating için bir güçlü modeli sistemi olmuştur. Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev, güçlü bir göstergedir ve son zamanlarda geliştirilen respirometers solunum hücrelerdeki ölçmek için bir state-of--art platformu sunuyoruz. Bu protokol için biz canlı, bozulmamış C. elegansanaliz etmek için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı, ~ 7 gün yayılan ve (1) büyüyen ve senkronizasyon C. elegans, (2) hazırlık bileşikleri enjekte edilir ve hidrasyon probları, (3) uyuşturucu yükleme ve kartuş denge, (4) solucan tahlil hazırlanması için adımları içerir plaka ve tahlil çalıştırmak ve (5) sonrası deneme veri analizi.

Giriş

Adenozin trifosfat (ATP), ana kaynağı hücresel enerjinin mitokondri içinde iç mitokondrial membran bulunan enzimler elektron taşıma zinciri (vb) tarafından üretilmektedir. Pyruvate, mitokondriyal ATP üretimi için kullanılan bir anahtar metaboliti Dekarboksile asetil koenzim A (CoA) üretmek için nerede mitokondrial matris alınır. Daha sonra asetil CoA, sitrik asit döngüsü Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), bir anahtar elektron taşıyıcı molekül üretimi kaynaklanan girer. NADH elektron oksijen vb geçerken proton mitokondriyal intermembrane alanı olan bir elektrokimyasal gradyan üretimi membran arasında sonuçlar kurmak. Bu proton sonra intermembrane uzaydan bu elektrokimyasal degrade boyunca sürüş onun rotasyon ve ATP1 (şekil 1) sentezi ATP sentaz proton gözenek aracılığıyla mitokondrial matris içine geri akacaktır.

Mitokondriyal işlev enerji üretimi için sınırlı değildir ama aynı zamanda kalsiyum Homeostazı, Reaktif oksijen türleri (ROS) atma ve apoptosis, eleştirel onların işlevi organizmalar sağlık2' konumlandırma için çok önemlidir. Mitokondriyal işlev dahil ancak bunlarla sınırlı mitokondri zar potansiyel ölçmek analizleri, ATP ve ROS düzeyleri ve mitokondrial kalsiyum konsantrasyonları değil deneyleri, çeşitli kullanılarak değerlendirilebilir. Ancak, bu deneyleri mitokondriyal işlev tek bir görüntüsünü sağlar ve bu nedenle mitokondrial sağlık kapsamlı bir görünümünü sağlamayabilir. ATP üretimi sırasında oksijen tüketimi sıralı reaksiyonlar çok sayıda bağımlı olduğundan, mitokondriyal işlev üstün bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. İlginçtir, oksijen tüketim oranları değişimler sonucunda mitokondrial disfonksiyon3,4,5gözlemledim.

Oksijen tüketim oranları (OCR) yaşayan örnekleri ölçülen genel olarak iki gruba ayrılabilir teknikleri kullanarak: amperometric oksijen sensörler ve oksijen6tarafından giderdikten porfirin tabanlı fosforun. Amperometric oksijen sensörler kapsamlı bir şekilde ölçmek OCR kültürlü hücreler, dokular ve C. elegansgibi modeli sistemlerinde kullanılmaktadır. Ancak, porfirin tabanlı fosforun respirometers içeren aşağıdaki avantajlara sahip: (1) onlar izin için bir yan yana karşılaştırma iki nüsha, örnekleri (2) onlar daha küçük örnek boyutu gerektirir (örneğin, 000 ~ 2, 000−5, karşı iyi başına 20 solucan solucanlar odası)7ve (3) respirometer adlı dört farklı bileşik enjeksiyon yapmak için programlanmış kez el ile uygulama ihtiyacını ortadan kaldırarak deneysel çalışma boyunca istenilen.

Bu protokol için bir porfirin tabanlı oksijen algılamalı respirometer ölçüde canlı, bozulmamış C. elegans OCR için kullanmakla ilgili adımlardır açıklanan. Geniş format, yüksek işlem hacmi respirometer8, kullanımı için yazılı bir protokol ise bu iletişim kuralı bir daha fazla bütçe dostu, erişilebilir ve daha küçük ölçekli aleti ile kullanmak için adapte edilmiştir. Bu iletişim kuralı OCR nerede yüksek üretilen iş tarama gerekli değildir ve kullanımı aşırı olurdu iki suşlar arasındaki farkı değerlendirmek için özellikle yararlıdır.

Protokol

Not: Resim 2 tam protokolü, şematik bir genel bakış sağlar.

1. büyüme ve eşitleme nematodunun nüfus9,10

  1. İstenen genetik arka L4 larva transferi (örneğin, N2 [vahşi türü] ve sel-12 hayvan) taze bir çim Escherichia coli (OP50)11numaralı seribaşı (bkz. Tablo 1 için reçete) nematodunun büyüme medya (NGM) plakalar üzerine. En az iki 100 mm veya üç 60 mm plakalar için her zor kullanın. Solucanlar (15-25 ° C arasında) uygun büyüme sıcaklıkta 3-4 gün ya da çok sayıda yumurta ve gravid solucanlar konsantre tabaklara kadar kuluçkaya.
  2. Yumurta ve solucanlar yaklaşık 6 mL M9 arabelleği kullanarak plakaları kapalı yıkayın (bkz. Tablo 1 için reçete) nematod ve transfer 100 mm plaka onlarla bireysel 15 mL santrifüj tüpleri her zorlanma için içine Pasteur Pipetler cam. Bu tüpler iyi spin aşağı 3 dk 6,180 x g ve aspiratı sadece hayvan ve yumurta Pelet istinat M9 arabellek dışarı az için.
  3. 3-4 mL çamaşır suyu çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1 için reçete) her tüp ve zaman zaman her tüpün doldurun ve 6,180 x g 1 dk. için de spin ve süpernatant Aspire edin 6 dk. eklemek M9 arabellek için girdap. Bu yıkama M9 ile üç kez tekrarlayın ve yumurta Pelet yaklaşık 9 mL M9 arabelleği içeren bir taze 15 mL tüp taşıyın.
  4. Taze taranmış solucanlar tarafından 16-48 h. Spin için 20 ° C'de nutating bu tüpler aşağı 6,180 x g 1.5 dakika, eşitleme ve taze OP50 çim ile seribaşı bireysel NGM plakalar üzerinde eşitlenmiş L1 hayvanlar indirdi (yaklaşık 100 mm plaka başına 6.000 – 10.000 hayvanlar) ve 20 ° C'de tutmak
  5. Bu hayvanlar L4 larva sahne ~ 42 h sonra ulaşacak. Şu anda, OP50 için Platin bir pick kullanarak L4 larva numaralı seribaşı NGM hareket 0,5 mg / mL 5-fluoro-2' içeren kaplamalar-deoxyuridine (FUdR) onları döl üreten önlemek için.
    Not: bir deney içinde benzer bir miktar için tüm suşların eşzamanlı olduğundan emin olun. FUdR tedavi hayvanlar sterilizes ve OCR etkileyen yumurta döşeme ve döl üretimi, engeller. Bu sterilize edilmiş hayvanlar tahlil için ertesi gün (gün 1 Yetişkin Hayvanlar ~ 66 h) analiz edilecek. FUdR fizyolojisi ve mutant bazı solucanlar ömrü çarpışmaya bildirilmiştir. Bu nedenle, ilaç sterilizasyon12,13,14için kullanıldığında bu dikkate alınmalıdır. Worms da mutasyonlar fem-1(hc17) veya fem-3(e2006) gibi feminizing yöntemle sterilize. Ancak, bu mutasyonlar mitokondriyal işlev etkisi olabilir.

2. bileşikleri enjekte edilir ve sondalar hidrasyon hazırlanması

Not: çalıştırmak tahlil sırasında her iki Bazal ve maksimal solunum oranları nematodlar ölçülür. Maksimal solunum bir mitokondri zar potansiyel rahatsız ediyor uncoupling ionophore ve böylece proton taşıma tarafından ATP sentezi üzerine karbonil siyanür-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), ayrıca hayvanlarda tetiklenir Mitokondrial membran proton pompalama, izin verirken elektron taşıma ve oksijen tüketimi4,15 devam etmek için ATP sentezi (şekil 1) edilişi. Sodyum azid (NaN3), ek tahlil son adımında içerir kompleksleri IV ve V bir sigara mitokondrial solunum16 (şekil 1) belirlemek vererek vb engeller bir ilaç. Aşağıdaki adımları gerçek tahlil Çalıştır önceki gün gerçekleştirilebilir.

  1. 1 mL FCCP hisse senedi çözümler hazırlamak (Dimetil sülfoksit [DMSO] 10 mM: 1000 x son tahlil konsantrasyon) ve NaN3 (dH2O: 10 son tahlil konsantrasyonu x 400 mM) ve mağaza-20 ° C'de
    Not: FCCP konsantrasyonu optimize etmek için bir konsantrasyon eğrisi maksimal OCR yanıt her enstrüman ve laboratuvar ayarı için temin için gerekli çalıştırın.
  2. Sensör kartuş dH2O 200 µL plaka içinde her şey (ve çevresindeki rezervuar) probları dH2O ve oda sıcaklığında gecede store batık sensör sağlamak ekleyerek hidrat.
    Not: probları yaptı kartuşu en fazla 72 saat için batık ama uzun süreli bir hidrasyon söz konusu olduğunda, tabakları olmalı parafin filmde sarılmış ve 4 ° C'de depolanan Gecede hidrasyon mümkün değilse, sensör kartuşu en az 4 h önce tahlil için sulu.
  3. Respirometer arayüzü içinde ısıtma elemanı kapatmak ve enstrüman hayvanlar çalıştırmak tahlil sırasında ısınmasını engellemek için araç içinde alt ısısı için gecede 15 ° C İnkübatör içinde saklayın.
    Not: Respirometer bir ısıtma elemanı ile donatılmış ancak soğutmalı olamaz. 15 ° C İnkübatör içinde respirometer C. elegans bakım için sağlıklı bir sıcaklığı 18-22 ° C arasında istikrarlı bir sıcaklık vardır.

3. ilaç yükleme ve kartuş denge

  1. Pipet dışarı ve2sensör hidrat için kullanılan O probları ve her şey calibrant çözümün (pH 7,4) 200 µL onun yerine dH atın. 100 µM FCCP dH2O FCCP hisse senedi çözümü sulandırmak ve seyreltilmiş çözeltinin 20 µL sensör kartuş enjeksiyon bağlantı noktası A ekleyin. 400 mM sodyum azid 22 µL Senyor kartuş B noktasına ekleyin.
  2. Respirometer açmak ve ana ekran seçin başlatmak; şablonları sayfası görünür. Şablonları sayfasında, boş ya da önceden tasarlanmış şablon seçin; Gruplar sayfası görünür. Gruplar sayfasında, kuyu A ve H arka plan wells seçin ve kalan 6 kuyu deneysel planına göre uygun gruplara atayın.
  3. Protokolü sayfasına gitmek için alt sağ köşesindeki oku itin. Protokolü sayfasında Equilibrate, Bazal ve iğne 1 ve 2 düğmeleri seçili olduğuna emin olun. Bu sayfada, (sonra enjeksiyon 1 FCCP ile) Bazal OCR yanı sıra maksimal OCR Okunma Sayısı ve mitokondrial sigara ayarlamak OCR (sonra enjeksiyon 2 sodyum azid ile).
    Not: Bir karması göre her ölçüm öncesinde ve bekle adım ve bu parametrelerin zaman dilimlerini Tablo 2' de gösterilmiştir.
  4. Sağ alt köşesindeki oku seçin ve sensör kartuş plaka yüklemek için bir ileti kutusu gösterilir. Sensör kartuş plaka hatırlatma istemi ekrandaki yönergeleri izleyerek doğru yönde yüklü emin olun. Respirometer şimdi kartuş equilibrate.
    Not: Bu denge hayvanlar hücre plaka uygun kuyu denetlesinler yerleştirmek için yeterli zaman sağlar.

4. solucan plaka ve çalıştırmak tahlil hazırlanması

  1. M9 arabelleği 200 µL her hücre plaka 8 Wells ve kuyular çevreleyen rezervuar içine ekleyin.
  2. ~ 100 solucanlar her zorlanma seribaşı NGM plakalar üzerine almak ve 2-3 dk. ıslak Platin çekme sonu M9 arabellek ile dinlenme ve 20 yaş senkronize hayvanlar B-G arka plan kuyu A ve H boş bırakmak, kuyu almak için izin.
    Not: yükledikten sonra her şey, yaklaşık 2 dak hayvanlar kuyu dibine yerleşmek izin için sabırsızlanıyorum. Bir solucan numara eğrisi solucan numarası her enstrüman ve laboratuvar ayarı için iyi başına en iyi duruma getirmek için çalıştırılması önerilir.
  3. Artık, respirometer kalibre ve yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık perde Tamam , kalibrasyon tampon içeren plaka çıkarılır ve sensör kartuş alet içinde kaldığı sürece respirometer--dan-ebilmek var olmak çıkarmak. Calibrant plaka hayvanları içeren plaka ile değiştirin. Plaka yüklemek ve devam basarak kapıyı kapat ve tahlil çalıştırmak izin verir.

5. sonrası deneme veri analizi

  1. Tahlil çalışma tamamlandıktan sonra ekrandaki yönergeleri izleyin ve hücre plaka ve sensör kartuşu çıkarın ve bir flash sürücü çalışma veri bırakılamayacak biçiminde kaydetmek için USB bağlantı noktasına takın. Sensör kartuşunu çıkarın ve yaklaşık 2 dk. yerleştirmek için hücre plakaları bir stereo diseksiyon mikroskop altında kuyu dibine halletmek ve hayvan başına iyi saymak hayvan izin.
  2. Analiz yazılımı bilgisayarda açın ve OCR hayvan sayıya normalleştirmek için normalleştirme sekmesini açın. Değiştir sekmesinin altındaki çeşitli grupları için uygun etiketleri uygulamak ve dosyayı daha ayrıntılı bir çözümleme için prizma dosyası olarak verin.
    Not: İlk beş ölçümlerin FCCP ilavesi FCCP ektir maksimal OCR sonra beş ölçümlerin ortalama süre Bazal OCR olmadan ortalama ve ortalama (en az iki ölçüm yapılmalıdır) son beş ölçümler Sodyum azid Ayrıca sigara mitokondrial solunum hızı sonra. Tahlil tekrarlanabilirlik emin olmak için üç kez yinelenmelidir.

Sonuçlar

İletişim kuralını kullanarak burada, OCR vahşi türü hayvan ve üç farklı sel-12 mutant suşları belirlenmiştir nitelendirdi. sel-12 presenilin17 C. elegans ortholog kodlar. İnsan presenilin mutasyonların ailesel Alzheimer hastalığı18gelişimi ile ilişkili en yaygın genetik sapma vardır. Çalışmalarımız yükseltilmiş mitokondrial kalsiyum düzeyleri sel-12 ' mutant hayvanlar vahşi t...

Tartışmalar

Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev anlayışlı bir göstergesidir; Bu nedenle, tüp bebek veya içinde vivo biyolojik bir sistemde, oksijen tüketim oranları ölçmek için güçlü olmak son derece değerlidir. Respirometers oksijen ya da oksijen basıncı için elektrikli bir geçerli orantılı nesil itimat amperometric oksijen sensörler yoluyla su porfirin tabanlı fosforun kullanarak oksijen düzeyleri hissediyorum. Clark elektrot ikinci kategoriye giriyor ve özellikle solunum C. elegansiçinde a...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar laboratuarda Seahorse XFp kurulmasında onun rehberlik için Dr. Kevin Bittman kabul etmek istiyorum. Ulusal Sağlık Enstitüleri GM088213 Bu eser desteklenen verin.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm, 60 mm Petri dishesKord-Valmark Labware Products2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubesGlobe Scientific6285
15 mL conical tubesCorning430791
22 × 22 mm coverslipGlobe Scientific1404-10
50 mL conical tubesCorning430829
AgarFisher ScientificBP1423-2
Bacto peptoneBD, Bacto211677
Bacto tryptoneBD, Bacto211705
Bacto yeast extractBD, Bacto212705
BleachGeneric
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Fisher ScientificC79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Abcamab120081
CholesterolFisher ScientificC314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Thomas ScientificC987Y85
Glass Pasteur pipettesKrackeler Scientific6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)Fisher ScientificBP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificBP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-1
Seahorse XFp AnalyzerAgilent
Seahorse XFp FluxPakAgilent103022-100
Sodium AzideSigma-AldrichS2002

Referanslar

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
  7. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
  9. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
  10. Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
  12. Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
  13. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
  14. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
  15. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
  16. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  17. Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
  18. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
  19. Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
  20. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 144C eleganssolunumoksijen t ketim oran n OCRrespirometermitokondrimetabolizma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır