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要約

ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。

要約

最適なミトコンドリアの機能は、これら神経系および筋のような高いエネルギー需要を持つセルを中心に、健康な細胞の活動にとって重要です。一貫性のある、このミトコンドリア機能障害は無数の神経変性疾患と一般的に高齢化に関連付けられています。線虫は、ミトコンドリア機能の多くの複雑さを解明するための強力なモデル システムをされています。ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能の強力な指標と最近開発された respirometers は、細胞内呼吸を測定する最新のプラットフォームを提供します。このプロトコルでは、ライブ、そのままc. の elegansの解析手法を提供します。このプロトコルは 〜 7 日間の期間にわたる、(1) 成長と注入する化合物の線虫、 (2) の合成とプローブ、(3) 薬剤の読み込みとカートリッジの平衡、ワームの分析の準備 (4) 水和の同期するための手順が含まれていますプレートと分析を実行すると、(5) の後の実験データ解析。

概要

アデノシン三リン酸塩 (ATP)、細胞のエネルギーの主要なソースは、ミトコンドリアの電子輸送鎖 (ETC) 内のミトコンドリアの膜にある酵素によって生成されます。ピルビン酸は、ミトコンドリアの ATP の生産に利用されている主要代謝物は、ベタニン脱炭酸アセチル補酵素 A (CoA) を生成する、ミトコンドリア マトリックスにインポートされます。その後、アセチル CoA はクエン酸ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) キー電子キャリア分子の生成に終ってを入力します。NADH から電子が酸素に ETC 経由で渡されるとき、プロトンは膜間で電気化学的勾配の世代で結果ミトコンドリアの膜間スペースに蓄積します。これらのプロトンは、ATP 合成酵素、ATP1 (図 1) の合成とその回転を運転のプロトン通過孔を介してミトコンドリア マトリックスに戻って、この電気化学的勾配にわたって膜間腔からフローさせます。

ミトコンドリアの機能はエネルギー生産に限定されていませんがカルシウムの恒常性、活性酸素種 (ROS) 清掃、アポトーシス、個体の健康2に批判的に位置決めの機能に重要なも。ミトコンドリアの機能は、様々 なアッセイ、ミトコンドリアの膜電位を測定解析、ATP と ROS レベル、およびミトコンドリアのカルシウム濃度に限らずを使用して評価できます。ただし、これらの試金はミトコンドリア機能の単一のスナップショットを提供する、したがってミトコンドリア健康の包括的なビューを提供可能性があります。ATP の生成中に酸素消費量は逐次反応の無数に依存して、のでそれはミトコンドリア機能の優れた指標として役立ちます。興味深いことに、ミトコンドリア機能障害3,4、5の結果として酸素消費量の変化が観察されています。

2 つのグループに大別することができます技術を使用して生体試料の酸素消費量 (OCR) を測定することができます: アンペロ メトリック酸素センサー、酸素6で急冷することができますしたポルフィリンの蛍光体。電流検出型酸素センサーは、メジャー OCR 培養細胞、組織、や線虫などのモデル システムに広く使用されています。ただし、respirometers を含むポルフィリンを用いた蛍光体は、次の利点を所有している: (1) 彼らは、3 通、2 つのサンプルの横に並べて比較 (2) 彼らが必要なサンプル サイズを小さく (など 〜 2、000−5、対ウェルあたり 20 ワーム 000 ワーム、商工会議所)7、および (3) 呼吸度計をプログラムすることで 4 つの異なる化合物注射を行う目的の手動でのアプリケーションの必要性を除去する実験の実行の時刻。

このプロトコルではライブ、そのままc. の elegansのメジャー OCR にポルフィリンを用いた酸素センサー計の使用に関連する手順が記述されていた.大判、高スループット計8の使用のための書かれたプロトコルがこのプロトコル詳細予算友好的、アクセスと小さくスケール計測器で使用するために対応しています。このプロトコルは、2 株が高スループット スクリーニングは必須ではありませんあり、その使用が過度の OCR の違いを評価する場合に特に便利です。

プロトコル

注:図 2は、完全なプロトコルの図式的な概観を提供します。

1. 成長と線虫密度9,10の同期

  1. 必要な遺伝的背景の L4 幼虫を転送 (例えば、N2 [野生] および sel 12 動物) 線虫成長メディア (NGM) 板 (レシピの表 1を参照) を新鮮な芝生の大腸菌(OP50)11のシードに。各緊張に少なくとも 2 つの 100 mm または 3 つの 60 mm プレートを使用します。3-4 日のため、またはプレートに卵や妊娠ワームの数が多いと集中しているまでは、適切な成長温度 (15-25 ° C) の間にワームを孵化させなさい。
  2. 卵と約 6 mL の M9 のバッファーを使用して皿のワームを洗う (レシピの表 1を参照) 線虫、伝達の 100 mm プレートあたりには各緊張に個々 の 15 mL 遠沈管にパスツール ピペットをガラスします。X g と動物の卵のペレットだけを保持、M9 バッファーを吸引 6,180 3 分のこれらの管をスピンダウンします。
  3. 漂白剤溶液の 3-4 mL を追加 (レシピの表 1を参照) 各管と断続的に各管を埋めると 1 分 6,180 x g でスピンし、上清を吸引 6 分追加 M9 バッファーの渦に。M9 でこの洗浄を 3 回繰り返すし、卵ペレットを約 9 mL の M9 のバッファーを含む新しい 15 mL チューブに移動します。
  4. 1.5 分 6,180 x g でダウンならびに 16-48 スピンのための 20 の ° c によってふ化ワームこれらのチューブを同期し、NGM ウエディング OP50 の芝生と新鮮なシード同期 L1 動物を置く (板 100 mm につき約 6,000-10,000 動物)20 ° C で
  5. これらの動物は L4 仔稚魚期 〜 42 h 後に達する。この時点で OP50 にプラチナ ピックを使用して L4 幼虫シード NGM 移動プレート 0.5 mg/mL 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン (FUdR) の子孫の生産からそれらを防ぐために。
    注: 実験の内で、すべての株が時間の同量のため同期を確認します。FUdR 治療は動物を殺菌し、OCR に影響を与えることができる卵を敷設し、子孫生産を防ぐことができます。これらの滅菌動物試金のための次の日 (1 日目 〜 66 h で大人動物) を分析します。FUdR は、生理学と特定の突然変異体のワームの寿命に影響する報告されています。したがって、これは殺菌12,13,14に薬を使用する場合を考慮した取られるべき。ワームには、fem-1(hc17) や fem-3(e2006) などの突然変異の女性化を妨害する手段も滅菌できること。ただし、これらの突然変異は、ミトコンドリアの機能を影響可能性があります。

2. 注入する化合物と水和反応プローブの準備

注: 試金の実行中に、線虫の両方の基底と最大呼吸速度が測定されます。ミトコンドリアの膜電位を妨げる連結を解くイオノフォアとこうしてプロトンを輸送することによって ATP 合成カルボニル シアン化物-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP) の添加によって動物で最大呼吸が起動されます。ミトコンドリア膜プロトン ポンプ、しながら電子伝達と酸素消費量4,15を続行する非 ATP 合成 (図 1) から。分析の最後の手順は、アジ化ナトリウム (NaN3) の付加を含む複合体 IV および V 非ミトコンドリア呼吸16 (図 1) を決定すること等を阻害する薬。次の手順は、実際の試金実行の前日を実行できます。

  1. 1 mL、FCCP の貯蔵液の準備 (ジメチルスルホキシド [DMSO] 10 mM: 最終的な試験濃度 x 1000) ナン3 (dH2o: 10 最終測定濃度 x 400 mM) と-20 ° C でストア
    注: は、FCCP の濃度を最適化する濃度曲線は各計測器と実験室の設定の最大の OCR の応答を引き出すために必要なを実行します。
  2. センサー プローブが dH2O および室温で一晩保管に浸漬を確保すること、プレートの各ウェル (と周辺の貯水池) に dH2O の 200 μ L を追加することによってセンサー カートリッジをメタンハイド レートします。
    注: 最大 72 時間浸漬プローブを残すことができるカートリッジが長期水和の場合プレート パラフィン フィルムで包まれるべきであるし、4 ° C で保存一晩水分補給できない場合センサー カートリッジは分析する前に、少なくとも 4 時間のため水和する必要があります。
  3. 計インターフェイス内の発熱を切り、一晩に動物の試金の実行中の過熱を防ぐために装置内のより低いコア温度 15 ° C インキュベーター内部機器を格納します。
    注: 工場加熱要素が装備が冷却することはできません。15 ° C の定温器内呼吸度計c. の elegansメンテナンスのため健康的な温度では 18-22 ° C 間の安定した温度でお越し。

3. 医薬品の読み込みとカートリッジの平衡

  1. ピペットのうち、dH2水和物のセンサーに使用される O プローブおよび calibrant 溶液 (pH 7.4) 各ウェルの 200 μ L で交換を破棄します。100 μ M FCCP dH2O に FCCP 原液を希釈し、センサー カートリッジの注入ポート a の希釈液 20 μ L を追加します。セニョール カートリッジのポート B に 400 mM アジ化ナトリウムの 22 μ L を追加します。
  2. 呼吸度計をオンしてホーム画面を選択する開始にテンプレート ページが表示されます。[テンプレート] ページで、空白または以前にデザインされたテンプレートを選択します。グループのページが表示されます。[グループ] ページで、背景の井戸と井戸 A と H を選択し、実験計画に従って、適切なグループに残り 6 井戸を割り当てます。
  3. プロトコルのページに移動する右下隅の矢印を押してください。[プロトコル] ページで、 Equilibrate、基底と注射の 1 と 2のボタンが選択されていることを確認します。このページで (後で注入 1 FCCP) 最大 OCR と同様、基底の OCR の測定値の数と非ミトコンドリア調整 (アジ化ナトリウム投与 2) 後 OCR。
    注: 各測定の組合せによって前し、待機のステップと、これらのパラメーターの時間枠を表 2に示します。
  4. 右下隅にある矢印を選択し、センサー カートリッジ プレートをロードするプロンプトが表示されます。アラーム入力画面の指示に従って、正しい方向にセンサー カートリッジ プレートがロードされていることを確認します。呼吸度計は今カートリッジを平衡させ。
    注: この平衡セル板の適切な井戸に試金するのに動物を配置する十分な時間を提供します。

4. ワーム プレートと試験の準備を実行します。

  1. 各細胞の版 8 の井戸のと周囲の井戸貯水池に M9 バッファーの 200 μ L を追加します。
  2. シードされていない NGM プレートの上に各株から 100 ~ ワームをピックアップし、M9 バッファーと 2-3 分ウェット プラチナ選択の最後の残りの部分し、井戸 B G、A と H のバック グラウンド井戸を空のままに 20 歳同期動物を選択できるように。
    注: 読み込み後それぞれ、待って約 2 分、ウェルの底に解決する動物を許可します。ワーム数曲線がワームも各楽器と実験室の設定の数を最適化するために実行することをお勧めします。
  3. 今では、呼吸度計を校正する必要があります、画面に[ok]をクリックすると、校正バッファーを含むプレートを取り出して、内部センサー カートリッジ滞在中、呼吸から削除できます。動物を含むプレート calibrant プレートを交換してください。プレートを読み込む続行を押すことでドアを閉めるし、実行する分析を許可します。

5. 後実験データ解析

  1. 試金の実行が完了すると、画面上の指示に従ってセル板を外し、センサー カートリッジと .war 形式で実行のデータを保存する USB ポートにフラッシュ ドライブを挿入します。センサー カートリッジを取り外し、約 2 分置く解剖顕微鏡ステレオの下のセル版の井戸の底に沈殿し、井戸ごとのペット数を数える動物を許可します。
  2. コンピューターで解析ソフトウェアを開き、動物数に OCR を正規化する正規化] タブを開きます。[修正] タブのさまざまなグループでの適切なラベルを適用し、さらなる分析のためのプリズム ファイルとしてファイルをエクスポートします。
    注: FCCP の付加である基底の OCR、FCCP 追加は最大の OCR 後の 5 つの測定値の平均、前に最初の 5 つの測定の平均と (最低 2 つの測定を行なうべき) 最後の 5 つの測定値の平均ナトリウムのアジ化物添加非ミトコンドリア呼吸後です。アッセイは、再現性を確保するため 3 回繰り返す必要があります。

結果

プロトコルを使用して記載、OCR の野生型動物と 3 つの異なるsel 12変異株と判断されました。sel 12プレセニリン17 c. の elegansオーソログをエンコードします。人間プレセニリン変異が家族性アルツハイマー病18の開発に関連付けられている最も一般的な遺伝的異常です。私たちの研究は野生型動物3

ディスカッション

ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能; の洞察力に富んだインジケーターです。したがって、体外か体内かどうか生物学的システムの酸素消費量を測定することは非常に貴重です。Respirometers 酸素または酸素分圧に比例した流れ電気の世代に依存する電流検出型酸素センサーを介して取得急冷したポルフィリンの蛍光体を使用して酸素レベルを感じる。クラーク電極は後者のカテゴリに...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、ラボでタツノオトシゴ XFp の確立に彼の指導の博士ケビン Bittman を認めたいと思います。健康の国民の協会は、GM088213 はこの仕事を支えたを付与します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm, 60 mm Petri dishesKord-Valmark Labware Products2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubesGlobe Scientific6285
15 mL conical tubesCorning430791
22 × 22 mm coverslipGlobe Scientific1404-10
50 mL conical tubesCorning430829
AgarFisher ScientificBP1423-2
Bacto peptoneBD, Bacto211677
Bacto tryptoneBD, Bacto211705
Bacto yeast extractBD, Bacto212705
BleachGeneric
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Fisher ScientificC79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Abcamab120081
CholesterolFisher ScientificC314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Thomas ScientificC987Y85
Glass Pasteur pipettesKrackeler Scientific6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)Fisher ScientificBP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificBP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-1
Seahorse XFp AnalyzerAgilent
Seahorse XFp FluxPakAgilent103022-100
Sodium AzideSigma-AldrichS2002

参考文献

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
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  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
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