Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התרבות האנושית enteroid או monolayers colonoid שיש להם פונקציה נפגע המחסום ללמוד אינטראקציות אפיתל-microbiota מארח ברמה התאית וביוכימי.

Abstract

תלת-ממדי (3D) enteroid או colonoid התרבויות האנושיות נגזר מתאי גזע הבסיס קריפטה נכון להיום הדגם המתקדם ביותר ex-vivo של האפיתל במעי. בשל מבנים סגורים שלהם משמעותית התומכים מטריצה חוץ-תאית, 3D תרבויות אינן אידיאלי ללימודי פתוגן-פונדקאי. Enteroids או colonoids יכול להיות גדל ככל monolayers אפיתל על קרום חדיר תרביות רקמה כדי לאפשר מניפולציה של שני luminal ו- basolateral תא משטחים ונוזלים הנלווה. נגישות משטח luminal משופרת זו מקלה על מידול וקרקע אפיתל אינטראקציות כגון היכולת משפילים ריר של enterohemorrhagic e. coli (EHEC) על אפיתל המעי הגס. שיטת הפיצול תרבות 3D טפט זריעה, transepithelial מדידות התנגדות חשמלית (TER) כדי לעקוב אחר ההתקדמות לקראת confluency ובידול מתוארים. בידול חד שכבתי Colonoid מניב ריר המופרש שניתן ללמוד על ידי טכניקות immunofluorescence או immunoblotting. באופן כללי יותר, monolayers enteroid או colonoid לאפשר פלטפורמה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להעריך את אוכלוסיות תאים מסוים עשויות להיות ממוקדות על ידי פתוגניים או commensal microbiota.

Introduction

Organoids מעיים, enteroids ו- colonoids הובילו להתקדמות רבות להבנת התנהגות תאי גזע, מעיים, הפונקציה מכשול/תחבורה ופיתוח התמיינות. ¹ . אולם, תרבות 3D מגביל המחקר של המארח פתוגן-אפיתל אינטראקציה כי לומן אינם נגישים ישירות חיידקים או התקפה אלימה גורמים אלא אם המבנים סגורים. נתונים microinjection. ^{2 , 3} . בנוסף, מופרש חומרים כגון מולקולות קטנות, חלבונים, או ריר לא ניתן לטעום בקלות מתרבות 3D לניתוח במורד הזרם. ההשפעה של סוכני פתוגניים על מחסום האפיתל פונקציה⁴ ויון תחבורה⁵ יוערכו בתרבות תלת-ממד באמצעות צבעי פלורסנט, מיקרוסקופיה זמן לשגות, אבל monolayers גדל על תרביות רקמה חדיר תומך נתונות שיטות נוספות כגון TER מדידה ורישום קלאמפ קאמרית/מתח Ussing. ^{6 , 7}

פרסומים רבים תיארו פרוטוקולים עבור תרבות 2D או טפט של enteroids/colonoids. חומרים שנמצאו כדי לקדם תאים אפיתל מצורף כוללים קולגן hydrogels, ג'לטין 0.1%^8,9 ,¹⁰ דק-שכבה מאתר קרום המרתף סרקומה-derived מטריצה (BMM),^{11,12, 13} ו קולגן אנושי הרביעי. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17} זריעת גישות לכלול מכני פיצול על-ידי pipetting^6,14,15 ו/או דיסוציאציה של גורמים אדהזיה התא באמצעות טריפסין,^10,11 dispase,¹³ או EDTA. ⁹ כמה פרוטוקולים להשתמש תרביות רקמה שאינו נקבובי plasticware זריעה, אבל זו מגבילה את הגישה basolateral, אז מרבית היישומים תלויים מוסיף חדיר תרביות רקמה. תיעוד של טפט confluent יציבה היווצרות ותחזוקה משתנה מאוד בין הפרסומים. בנוסף, יצירות מדיה בהתפתחותם התרבויות האנושיות משתנים בין הקבוצות השונות ולהמשיך להתפתח כאשר חוקרים יותר לאמץ ולהתאים את המתודולוגיה כדי להתאים את היישום שלהם ואת המשאבים הזמינים.

כדי לטפל המגבלות של תלת-ממד תרבות אפיתל המעי במחקרים אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, אנו מציגים עבור המרת תלת-ממד אנושי enteroids או colonoids טפט פרוטוקול ששונה. לאחר השגת confluency במצב לא בשלה כמו קריפטה, נסיגה של גורמי גדילה WNT3A, RSPO1, את מעכבי A-83-01 ו- SB 202190 מוביל בידול נציג של סיסי מעיים קטן או משטח אפיתל המעי הגס. אנו מתארים את מטריקס אידיאלי, קולגן אנושי הסוג הרביעי, כדי להרגיע את הכיסויים ולקבל שברים enteroid או colonoid אחיד עבור ציפוי. נדגים את פרוטוקול זה מייצר של טפט confluent עם גבוה TER. Colonoid monolayers מפרישים ריר סמיך הפסגה שכבה, ומאפשר ללימודים לשעבר vivo של פתוגן-ריר אינטראקציה באמצעות immunoblotting או immunostaining. גם מתואר הליך קיבוע ששונה כדי לשמר את שכבת הריר חוקן עבור immunostaining. שיטה זו שואפת לספק מודל צייתן ללמוד את האינטראקציות פתוגן-פונדקאי מעיים המוקדם על זיהום.

Protocol

פרוטוקול זה מבוסס על מחקרים שפורסמו בעבר על-ידי המחברים. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16} השלבים הבאים צריך להתבצע בארון סטרילי אבטחה באמצעות טכניקות aseptic נאותה. כל השיטות מעורבים דגימות האנושי אושרו על-ידי המוסדיים סקירה לוח של ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת (IRB NA_00038329).

1. מעיל תא מוסיף תרבות עם מטריצה חוץ-תאית

1. להכין 5 מ של מלאי הקולגן הרביעי פתרון (1 מ"ג/מ"ל) חומצה אצטית 100 מ מ. תן לעמוד ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 4 שעות באופן מלא מימה/להמיס.
2. Aliquot הקולגן הרביעי במניה פתרון ולאחסן ב 4 ° C (≤ 1 חודש) או-20 ° C (> 1 חודש).
3. מייד לפני ציפוי, לדלל את הקולגן הרביעי הפתרון מלאי במים כיתה תרביות רקמה סטרילי כדי ריכוז סופי של 34 μg/mL. לצלחת 24-ובכן תרבית תאים מוסיף, מעיל אחד הכנס עם 100 μL של פתרון, המתאים μg/cm 10².
4. דגירה על צלחת תקן CO₂ תרביות רקמה חממה ב 37 ° C עבור ≥ 2 h, או לנוחות, לאטום את הקצוות צלחת עם סרט פרפין, דגירה בשבוע לילה או 1 עד 4 ° C.

2. לבודד את enteroids/colonoids מתרבות תלת-ממד

הערה: Enteroids או colonoids הן נוצרו מתורם ביופסיות ומתוחזק בתרבות 3D על פי פרוטוקולים סטנדרטיים שתואר קודם לכן. ^{14 , 18} . בקצרה, כוכים נקצרים מן ביופסיות מעי או כריתות דרך קלאציה ועצבנות מכני. כוכים, שנקטפו, שטופים מצופה ב BMM. התרחבות המדיה (שמתואר בשלב 4.2) להוסיף את התרבות, הוחלפו כל יומיים. היווצרות תרבות 3D מוצגת בתוך שעות לאחר ציפוי.

1. האחות המדיום תרבות מהצלחת 24-ובכן ולהחליף עם פתרון האיסוף כקרח 1 מ"ל (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב.
2. להשתמש במגרדת תא מיני כדי לסלק הפרידות בגדר מטריקס קרום המרתף, תוך תשומת לב מיוחדת לכל חומר סמוך לקצות היטב.
3. להתסיס על הלוחית תפקודי לב / כ 200 סל ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות.

3. מביצועם enteroids תלת-ממד/colonoids

1. להשתמש על פיפטה ערוץ אחד P200 או פיפטה רב ערוצית מצוידים עם טיפים מסנן סטרילי כדי triturate התליה תא.
2. מאגר של suspension(s) תא בבקבוקון חרוט 15 מ"ל. השתמש בקבוקונים מרובים אם אמצעי האחסון השעיה טוטאלית > 6 מ.
3. הוסף אמצעי שווה של מדיום DMEM/F12 מתקדם המכיל 10 מ מ HEPES, dipeptide-alanyl-L-גלוטמין (1 x) ו פניצילין-סטרפטומיצין (1 x) (שטיפת בינוני). היפוך ברכבת התחתית 3 - 4 פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה 300 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
   1. באופן אופציונלי, תשאף המדיום לשטוף ולהחליף עם 0.5 mL/טוב טריפסין (ראה טבלה של חומרים). Resuspend colonoids עם פיפטה P200, קאפ הצינור והציבו באמבט מים 37 ° C כ 2 דק מיד להסיר את הצינור, שטיפת בינוני להוסיף נפח סופי של 10 מ"ל, וחיזרו את צנטריפוגה כמו שלב 3.3.
      הערה: שלב זה עשוי להיות עדיף אם trituration הוא לא וכתוצאה מכך שברים בגודל אחיד.

4. ציפוי המתלה enteroid/colonoid

1. אם הוספת מצופה אוחסנו ב 4 ° C, equilibrate של °C/5% CO₂ תרביות רקמה חממה 37 במשך לפחות 30 דקות לפני ציפוי התא.
2. עבור כל הוספה להיות מצופה, להכין 1 מ"ל חמים (בין 25-37 מעלות צלזיוס) הרחבה בינונית (EM) ולהוסיף 10 μM Y-27632 ו- 10 μM ח'יר 99021.
   הערה: EM מורכב של מתקדם DMEM/F12 המכיל B27 (1 x), 50% WNT3A ממוזגים בינוני, 15% RSPO1 ממוזגים בינונית, 10% Noggin ממוזגים בינוני, 50 ng/mL האנושי EGF, 500 ננומטר A-83-01, 10 μM SB 202190, אנטיביוטיקה/antimycotic קוקטייל (1 x), 10 מ מ HEPES, Dipeptide-alanyl-L-גלוטמין (1 x), פניצילין-סטרפטומיצין (1 x) (ראה טבלה של חומרים).
3. האחות המדיום שטיפת מהצינור המכיל בגדר תא, resuspend באמצעי אחסון של EM מספיק להניב μL לפחות 100/הוספה.
4. האחות הפתרון הרביעי קולגן מן כל הוספה, לשטוף פעמיים עם 150 μL של המדיום שטיפת לכל הוספה.
5. Pipet 600 μL של EM אל החלל מתחת כל הוספה.
6. Pipet 100 μL תא השעיה לתוך כל הוספה.
7. להחזיר את הצלחת החממה תרביות רקמה ולהשאיר ללא הפרעה במשך לפחות 12 שעות.
   הערה: להימנע טלטולים או בחדות הטיית הלוח כדי למנוע הפצה אחידה של colonoid קטעים על קרום הוספה.
8. לפקח על הקובץ המצורף תא והפצת כדי ליצור טפט confluent על ידי הצבת את הצלחת על מיקרוסקופ אור שלב-ניגודיות תחת 2.5 x-10 x עדשה אובייקטיבי.
9. לאחר 1-2 ימים, שברי רוב צריך לדבוק קולגן המטריצה. לרענן את המדיום תרבות, להפסיק את הטיפול עם Y-27632 ועם ח'יר 99021. להמשיך לרענן את המדיום כל 2-3 ימים עד confluent. Confluency נגיש בדרך כלל ב- 7-10 ימים.

5. מדד transepithelial ההתנגדות החשמלית

1. לצרף את הפניות אלקטרודה והכוח -voltohmmeter אפיתל (EVOM). ודא כי הפונקציה מדידה מוגדר אוהם.
2. טובלים את הטיפים אלקטרודה בקצרה ב-70% אתנול, לנגב היבש עם טישו מעבדה. Equilibrate האלקטרודה ב 5 מ של שטיפת בינונית במשך כ 5 דקות.
3. לטבול את קצה האלקטרודה קצר יותר במדיום הוספה, אוריינט קצה האלקטרודה יותר לתוך הלוח התחתון טוב. לשמור על האלקטרודה בכיוון אנכי מלא עד הקריאה EVOM יציב יחסית, או לא יותר מ- 60 s.
   הערה: אם מכלול אלקטרודת מטים רחוק אנכי, או גובה הטיפ מכוונן באופן לא תקין, הטיפ קצר יותר עשוי לבוא במגע עם ולשבש את טפט תא.
4. השוואת מידות EVOM את הערך המתקבל הוספה ללא התא שקועים תרבות בינוני כדי להעריך את ההתקדמות לקראת confluency או בידול.

6. הבידול של monolayers enteroid/colonoid confluent

1. להחליף אותם בידול בינוני (DM), להמשיך לרענן מדיה בכל יומיים עד היום 5. זה DM EM חסר WNT3A, RSPO1, A-83-01, SB 202190.
2. נמשיך לעקוב TER לוודא בידול הוא הליך כצפוי. טר ימשיכו להגדיל בימים 1-5 של בידול. Monolayers יכול להמשיך להגדיל טר, שומרים על הכדאיות מעבר יום 5-6 אבל התערוכה מקסימלית וללא ביותר לשחזור תוצאות בעת שימוש ביום 5-6.

7. זיהום חיידקי עם commensal או פתוגניים החיידק

1. יום אחד לפני ביצוע הזיהום, לרחוץ ולהאכיל monolayers עם EM או DM תרופתיים.
2. השתמש לולאה מיקרוביולוגיה סטרילי כדי לגרד את פני השטח של מניה גליצרול חיידקי קפוא ובעדינות לחסן 2 מ ל מרק ליברות. העברת הצינור תקן רועד חממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 h.
3. לדלל 50 μL של התרבות starter לתוך מרק LB טרי מ ל (1: 100) ולהמשיך הדגירה ברעידות במשך 90 דקות. זה תניב תרבות שלב יומן עם צפיפות של 10⁵-10⁶ המושבה יוצרי יחידות (cfu) / mL.
   1. באופן אופציונלי, לאשר את ריכוז חיידקי על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) בספקטרופוטומטר.
4. ספין למטה התרבות חיידקי ב g x 12,000 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend לחיידקים תרופתיים EM או DM ריכוז סופי של 10⁷ cfu/mL.
5. להוסיף 10 μL של חיידקי השעיה תותב (הריכוז הסופי 10⁶ cfu/mL). Pipet לאט כדי לערבב להימנע מהפרעה בשכבת ריר חוץ-תאית.
6. להחזיר את הצלחת חממה תרביות רקמה עבור התקופה זיהום הרצוי.

8. קיבוע כדי לשמר, immunostain ריר

1. מעלית התרבות התא מוסיף מהצלחת 24-ובכן, היפוך בקפידה על נייר טישו מעבדה כדי להסיר את המדיום הפסגה, ותנגב נמצא נוזל חיצוני נצמדים תותב.
2. בצלחת. ובכן 24 חדשים, לטבול את תותב בריכוז 1:3 של חומצה אצטית באתנול מוחלטת (פתרון של קלארק) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. היפוך של הוספה כדי להסיר את מקבע נתרענן התאים ב- PBS x 1 עבור 10 דקות להמשיך עם פרוטוקולים סטנדרטיים immunostaining.
4. השימוש סכין גילוח לחתוך מסביב להיקף של קרום הוספה. להעביר את הקרום לשקופית מיקרוסקופ זכוכית באמצעות מלקחיים, ולהצמיד של coverglass הרכבה בינונית.

9. הכנה של תא lysates immunoblotting

הערה: בצע את השלבים הבאים על קרח או בחדר קר.

1. וביופסיה בינונית, שטיפת הכנס פעם עם PBS.
2. להוסיף 150 μL פירוק מאגר המכיל פרוטאז מעכבי (ראה טבלה של חומרים) הכנס, מעצור 5-10 דקות פירוק המאגר מכיל 50 מ מ טריס pH 8, 150 מ מ NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% מרחביות, מעכבי פרוטאז מטריים קוקטייל.
3. להשתמש במגרדת תא מיני כדי להסיר התאים תותב ולאחר מכן השתמש פיפטה P200 כדי triturate בקצרה את ההשעיה ואת העברת צינור microcentrifuge.
4. Sonicate את הבולם עם 5 x 1 s פולסים במהירות משרעת 20% באמצעות microtip של בדיקה (ראה טבלה של חומרים).
5. להוסיף מאגר מרחביות-דף הטעינה אם מיד מבצע אלקטרופורזה, או aliquot ולאחסן lysates ב-20 ° C.

תוצאות

התרבויות האנושיות enteroid ו- colonoid גדל כמו מבנים תלת-ממדיים, ולאחר מכן הפומבית, מקוטעת עבור ציפוי קולגן אנושי תא מצופים הרביעי תרבות מוסיף. ההתקדמות של היווצרות חד שכבתי מנוטר בקלות על בסיס יומי באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר, immunofluorescence מכתים (איור 1), ועל -ידי על עלייה מתמדת ב transepithelial ההתנגדות החשמלית (TER) (איור 2), אשר משקפת החדירות של צמתי צר יונים ו בקורלציה עם טפט confluency. TER של מוסף 24-ובכן ריק הוא כ 50-100 Ω·cm², כשמגיעים confluency עולה בערך 400-500 Ω·cm². כל התאים אפיתל confluent monolayers מחוברים באמצעות קומפלקסים מהחיבור שזיהה את הטבעת F-אקטין הפלייבק תא (איור 1). Monolayers בתקשורת מלאה פקטורי גדילה מייצגים האפיתל כמו קריפטה proliferative המורכבת בעיקר מ פעיל חלוקת תאים המשלבים את nucleoside אדו אנלוגי (איור 2). נסיגה של גורמי גדילה WNT3A ו- RSPO1 מקדם בידול, המוביל אל תרבויות כמו סיסי חסרי תאים מתרבים. Monolayers הבדיל מכילים enterocytes (enteroids) או colonocytes (colonoids) ולפתח תאים אפיתל המעי מיוחדים כמו הוכח בתרבויות תלת-ממד,¹⁸ כולל תאי גביע ו- enteroendocrine. ¹⁵ Differentiated monolayers גם להדגים גידול משמעותי טר (Ω·cm > 1000²) (איור 2), המציינת את צמתי צר בוגרת.

פיזיולוגיה אנושית רגילה, השכבה אפיתל המעי מפריד בין החומרים המזינים ואת הרווח luminal מועשר חיידק מהסביבה serosal סטרילי. האפיתל בחוזקה מסדיר את צולבות לדבר בין שני תאים אלה. Monolayers Enteroid, colonoid לשמר את מאפיין חשוב מידור זה כפי שמוצג במסגרת הניתוח פרוטיאומיה מבנית טבלה 1- יש הבדלים ניכרים בין הרכב החלבון בהפסגה, basolateral ממוזגים מדיה שנאסף monolayers enteroid הבדיל. גישה אל שני הצדדים הפסגה, basolateral מאפשר איסוף של שני supernatants באופן תלוי זמן למדידת דיפרנציאלית הפרשת מולקולות אחרות כגון ציטוקינים נוגדנים. ^{15 , 17}

Monolayers הם דגמים נוחים מאוד לשחזור כדי לזהות השינויים בביטוי חלבונים באמצעות immunoblotting ו- immunostaining. לפיכך, שינויים ב mucin 2 (MUC2) ביטוי shRNA נוקאאוט (KD) ניתן להבחין באמצעות שתי טכניקות (איור 3). התמרה חושית shRNA מתבצע על 3D colonoids ומתוחזק בתקשורת הבחירה אנטיביוטי. לאחר אימות של KD, colonoids יכול להיות באופן רציף נשמר כמו תרבויות 3D ו/או מצופה כמו monolayers למטרות ניסוי. יתר על כן, MUC2 KD אינה משפיעה על היעילות של היווצרות חד שכבתי לעומת הקו הורים colonoid פראי סוג. אוסף של monolayers עבור immunoblotting הוא פשוט דומה לפרוטוקולים המתוארות עבור שורות תאים אדנוקרצינומה-derived האפיתל אנוש. בדרך כלל, כ 50 µg או יותר של חלבון הכולל יכול להיות מופק טפט תוצרת הוספה² ס מ 0.33 יחיד. כפי שמוצג באיור3, MUC2 בקושי שקיימים ב- monolayers colonoid (לעוד) WT מובחן אבל מאוד מתבטאת הבדיל WT (DF) monolayers. MUC2 נמצא מתחת לרמה של זיהוי ב- monolayers colonoid transduced עם MUC2 shRNA אוד ו- DF.

חשוב לציין, monolayers הם מודל מתאים ללמוד אינטראקציות מארח-מיקרוביאלית בפני השטח הפסגה של epithelia. Colonoid monolayers טופס המצורף MUC2-חיוביות ריר שכבה עבה על בידול אשר לא חילחלו בקלות על-ידי commensal e. coli HS חיידקים (איור 4), הדומה מה הוצע במעי הגס אנושי נורמלי. ¹⁹ . אולם, enterohemorrhagic e. coli (EHEC), חוקן פתוגניות, הוכח יש את היכולת להרוס את השכבה מועשר MUC2 ריר המצורף כדי להגיע אל פני השטח הפסגה של האפיתל (איור 4). ^{14 , 20} MUC2 הנותרים קיים רק בתוך התאים בגביע.

איור 1: הקמתה של האדם enteroid/colonoid monolayers. (א) דוגמה colonoid קטעים לאחר פירוק BMM ו- trituration. (B) דוגמה הוספה מיד לאחר ציפוי שברי colonoid. קנה המידה של בר (A-B) = 200 μm. נציג הטלה בעוצמה מרבית (C) (D) קונאפוקלית אופטי Z-סעיף עם ההשלכות orthogonal המתאימים מראים קטעים colonoid נזרע על גבי טופס מסננים מצופי הרביעי קולגן אנושי כמה איים חד שכבתי 2-4 ימים לאחר זריעה. אזורים ללא תא (כוכבית) ניתנים לזיהוי על ידי העדר של שני גרעיני (Hoechst 33342, כחול) ו- F הפסגה-אקטין (phalloidin, ירוק) צביעת C וד נציג הטלה בעוצמה מרבית (E) והן (נ) קונאפוקלית אופטי בסעיף המתאים לתוכניות orthogonal יציג של טפט confluent colonoid עם משטח רציף הפסגה זוהה על ידי F-אקטין immunostaining כ- 1-בשבוע שלאחר זריעה. (G) בהגדלה של הטלה בעוצמה מרבית נציג ו סעיף אופטי קונאפוקלית (H) עם ההשלכות orthogonal המתאים להראות כי התאים confluent colonoid monolayers טופס על perijunctional F-אקטין טבעות (חץ לבן), גבול מברשת הפסגה ילדותי (ראשי חץ צהוב). קנה המידה של בר (C-H) = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הערכה של בידול חד שכבתי enteroid/colonoid. (א) אדו (אדום) התאגדות מדגים אובדן הדרגתי של התפשטות במהלך jejunal חד שכבתי בידול. מידות TER הממוצע (B) confluent jejunal monolayers במדיום הרחבה או בידול. קווי שגיאה מייצגים ב- SEM אוד, מובחן; DF, הבדיל. המספרים תואמים ימים תחת התנאי שצוין; UD1 היה היום הראשון של confluency, כ 1 שבוע לאחר זריעה. (ג) monolayers jejunal אוד יש רחבה, קצר יותר תאים גבול מבוגרים פחות המברשת מבוססת-אקטין הפסגה מאשר DF יום 5 jejunal monolayers. קנה המידה של בר (א, ג) = 50 μm. כל monolayers היו מתוארים לפחות שבוע אחד לאחר זריעה והיו confluent לפני תחילת בידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: פראי סוג colonoids ו shRNA transduced נוקאאוט (KD) colonoids monolayers confluent בכל טופס. (א) להחליפן בתמונות של פראי סוג (WT) colonoid confluent האנושי טפט הבדיל במשך 5 ימים, (B) גדל באופן דומה monolayers נגזר MUC2 KD colonoid תרבויות. קנה המידה של בר (A-B) = 50 μm (ג) נציג immunoblot של תרבויות colonoid transduced עם shRNA מקושקשות או MUC2 shRNA מדגים כי השינויים בביטוי חלבונים עקב KD יכולה להיות quantitated על ידי immunoblot. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: Enteroid/colonoid monolayers הם מודלים מתאימים ללמוד אינטראקציות מארח חיידק luminal. הטלה בעוצמה מרבית נציג (א) וסעיף אופטי אורתוגונלית של טפט colonoid מציגה את הפסגה MUC2-חיוביות ריר שכבת עבה שאינו חדיר ל e. coli HS (חץ שחור) בישיבה הליחה הפסגה השטח. טפט היה נגוע למשך 6 שעות עם⁶ 10 cfu/mL HS. (B) הטלה בעוצמה מרבית נציג של טפט colonoid האנושית נגוע apically EHEC (10⁶ cfu/mL, 6 שעות). קנה המידה של בר (A-B) = 50 μm. (ג) MUC2 immunofluorescence בעוצמה מדידות מראים ירידה משמעותית MUC2 monolayers colonoid נגועה EHEC לעומת שולט נגוע. קווי שגיאה מייצגים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חלבון	מספר גישה	פפטיד שפע
Basolateral מדיה
חומצת שומן מחייב חלבון, הכבד [הומו ספיינס]	NP_001434.1	1299
profilin-1 [הומו ספיינס]	NP_005013.1	797
קודמן אפוליפופרוטאין A-IV [הומו ספיינס]	NP_000473.2	744
קודמן טפיל חוץ-ADP-ribosyltransferase 4 [הומו ספיינס]	NP_066549.2	633
גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז isoform 1 [הומו ספיינס]	NP_002037.2 (+1)	616
serotransferrin קודמן [הומו ספיינס]	NP_001054.1 (+1)	572
ויטמין D-איגוד חלבון isoform 3 קודמן [הומו ספיינס]	NP_001191236.1 (+2)	567
קטלאז [הומו ספיינס]	NP_001743.1	427
קודמן isoform 1 אגרין [הומו ספיינס]	NP_940978.2 (+1)	377
lactotransferrin isoform 1 קודמן [הומו ספיינס]	NP_002334.2 (+1)	262
מדיה הפסגה
trefoil פקטור 3 קודמן [הומו ספיינס]	NP_003217.3	326
trefoil פקטור 1 קודמן [הומו ספיינס]	NP_003216.1	304
קרום המרתף ספציפיים הפאראן גופרתי פרוטאוגליקן הליבה חלבון isoform הקדמה [הומו ספיינס]	NP_001278789.1 (+3)	303
isoform filamin-B 1 [הומו ספיינס]	NP_001157789.1 (+2)	240
trefoil פקטור 2 קודמן [הומו ספיינס]	NP_005414.1	182
שנמחקו ממאיר במוחו גידולים חלבון 1 isoform b קודמן [הומו ספיינס]	NP_015568.2 (+3)	169
קרטין, סוג II 1 cytoskeletal [הומו ספיינס]	NP_006112.3	157
צולבות הקישור חוטים שרירן-9 [הומו ספיינס]	NP_002464.1	150
aminopeptidase N קודמן [הומו ספיינס]	NP_001141.2 (+1)	145
קודמן אגרין [הומו ספיינס]	NP_940978.2 (+1)	112

טבלה 1. רשימה חלקית של פפטידים המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית ב הפסגה ונוזלים basolateral לטעום מן הבדיל jejunal monolayers.

Discussion

פרמטרים קריטיים עבור מוצלחת היווצרות enteroid/colonoid monolayers כוללים 1) בריא, מתרבים 3D תרבויות חומר המוצא כמו; 2) ציפוי המשטח הוספה תא תרבות קולגן אנושי הרביעי לפני טפט זריעה; 3) פיצול של תלת-ממד תרבויות או מכנית או enzymatically, אך לא את רמת תא בודד.

במהלך בידוד של תלת-ממד enteroids/colonoids, מהירות אופטימלית חזק יכול להשתנות בהתאם קוטר הסיבוב של מודל שאכר נתון. הכוונה היא לא רק להתסיס את הצלחת של ערבוב יעיל, אבל גם למנוע מתיז התליה תא בשער צלחת או לתוך בארות סמוכים. פרקי זמן דגירה של < 30 דקות, תניב BMM שיורית נצמדים תאים, אשר יכול לעכב מצורף ועל היווצרות monolayers תא אחיד כאשר מצופה במוסיף. הדגירה נרחב (≥ 1 h) תניב הכדאיות תא ירד משמעותית.

היקף trituration נדרש מביצועם enteroids תלת-ממד/colonoids יכול להשתנות עם בוכנה קשיחות ומשתמש מיומנות. בדיקה תקופתית של תוכן טוב על מיקרוסקופ אור ניגודיות שלב מומלץ לקבוע אחידות פרגמנט במהלך trituration, עם מטרה של תאים כ-30 לכל קטע. במקום, או בנוסף trituration, ההשעיה יכול להיות מתעכל בקצרה עם טריפסין להשיג שברים קטנים יותר אחיד. תקציר טריפסין עשוי להיות רצוי אם monolayers מכילים אחוז גדול של מבנים דמויי תלת-ממד בין שכבת האפיתל יחידה אחרת. עם זאת, דיסוציאציה לתאים יחיד אינו רצוי כמו פעולה זו מפחיתה באופן משמעותי תא הכדאיות. אחד טוב של enteroids/colonoids תרבותי ב- droplet BMM 35 μL בדרך כלל יהיה מספיק כדי לאכלס מוסיף 2-3, אך גורם זה יכול להשתנות בהתאם המספר ואת גודל ממוצע של enteroids/colonoids.

Colonoid monolayers עלול לספוג נפח משמעותי של המדיום הפסגה כפי שהם להבדיל. זה יכול להיות עקפו על-ידי החלת מיט נוספים אל התא העליון הוספה (150-200 μL), למרות ייבוש של התא העליון אינו מופיע להשפיע לרעה על הכדאיות טפט או פונקציה במבחני במורד הזרם. לאחר כ 4-5 ימים של בידול, לפתח colonoid monolayers ריר חוץ-תאית, שעשויים להיות גלוי כמו חומר ג'לטיני/עבה על פני התא לאחר השאיפה זהיר של DM.

עבור EHEC אינטראקציה עם השכבה החיצונית ריר, אנו משתמשים באופן שגרתי כייל נוגדנים ותקופת הדגירה חיידקי שבהם צוין בפרוטוקול. עם זאת, כדאי בתחילה לבדיקה זני חיידקים ייחודי-מספר ריכוזים ותקופות הדגירה כדי לקבוע את הפרמטרים המתאימים עבור האפקט הרצוי.

במהלך קיבוע ריר, כ רפה בעברית המדיום הפסגה סביר יסיר רוב השכבה ריר כעיגולים בצבע חוץ-תאית. לכן, חשוב שופכים בזהירות את המדיום. אם המדיום נשמר ב- תותב על ידי מתח פנים, להשתמש בפינת ממחטה מקופלת מעבדה כדי לשבור את המתח משטח לפתיל רוב המדיום. לאחר קיבוע מכתים, בשכבת ריר שניתן מבלי משים יצא ממקומו או שיטוח בזמן הרכבה של coverglass מעל המסנן ' הוספה '. כדי לשמר את גובה ריר, למקם את המסנן על טיפה של הרכבה מדיה ומניחים בזהירות את coverglass על המסנן. אין הקש או לחץ כלפי מטה coverglass כמו זה ייתכן לשטח באופן משמעותי את שכבת הריר.

כדי ליצור של טפט מקוטב מתאי בתרבות 3D, זה הכרחי לשחזר את האינטראקציה בין basolateral אינטגרינים קרום תאי אפיתל המעי וחלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM). Laminin, קולגן הרביעי, fibronectin, מערך proteoglycans מהווים את ECM אפיתל המעי. ^{21 , 22} . אנחנו לעומת laminin נגזר התא האנושי, fibronectin, קולגן IV ו מאתר נגזר BMM כמו ציפוי הוספה. רק קולגן הרביעי נתמך היווצרות של יציבה, לטווח ארוך (עד 4 שבועות) enteroid/colonoid confluent monolayers (דמויות 1-2). כתמים קטנים של גדילה דמוי טפט התקבלו על כל אחד מטריצות אחרים שנבדקו, אולם אזורים אלה נכשל להתקדם confluency. השתמש של קולגן אנושי הרביעי פונדקאית ECM יש מספר יתרונות. BMM נגזר מן Engelbreth-הולם-נחיל ועובדיו סרקומה מאתר התאים אינם ממקור אנושי, ואילו קולגן אנושי הרביעי הוא זמין מסחרית, בדרך כלל חסכונית יותר. בנוסף, BMM היא תערובת מורכבת של חלבונים עם השתנות הטבועה, עשויים להכיל גורמי גדילה מופרש על ידי סרקומה להשפיע על ביטוי גנים. ²³

אינטראקציות בין תאי אפיתל המעי ECM הבסיסית בפיצוי אפיתל המעי עדיין שהיישום מובנת. המשמעות של קולגן הרביעי, אבל לא laminin, כמו ליגנד אדהזיה colonocytes אנושי²⁴ , וריח של קריפטה מעיים תאים אפיתל פיצוי²⁵ כבר הציע באמצעות נוגדנים נגד קולגן הרביעי שמנעה קובץ מצורף . הביע בשחלה אפיתל β1-אינטגרין מופיע להיות חשובה עבור אינטראקציה ECM, כפי נוגדן ספציפי β1-אינטגרין חסם משמעותי הידבקות של colonocytes להקליד הרביעי קולגן. ²⁴ בעוד קולגן הרביעי מספק ECM אמין עבור enteroid/colonoid טפט היווצרות על מוסיף, אפיתל שיפוץ של ECM לאורך זמן לא עדיין הוערך במודל זה, וגם יש את ההשפעה של תערובות ECM יותר מורכב ויותר מוגדרים של קולגן הרביעי, laminin ו- fibronectin.

Enteroids/colonoids האנושי בתבנית חד שכבתי (דמויות 1-4) להפעיל מניפולציות, דיגום זה יהיה מסורבל או בלתי אפשרי להשיג באמצעות תרביות 3D matrix-מוטבע. Enteroids תלת-ממד/colonoids משתנים בגודלם, מבנה, נפח luminal, ובכך microinjection של חיידקים או מולקולות קטנות קשים במדויק quantitate. בנוסף, בניגוד monolayers (טבלה 1), תרבויות 3D למנוע גישה ישירה שני luminal ו- basolateral למשטחים למדוד יונים, חומרים מזינים, ציטוקינים או על ידי גורמים הקשורים תהליכים הפיזיולוגיות או pathophysiologic . Confluency (ספרות 1-2) הוא אחד המאפיינים העיקריים של enteroid/colonoid חד שכבתי הכרחי עבור הקמת לא רק מעברי הצבע הפיזיולוגיות של חומרים מזינים, יונים, אחרים מקרומולקולות,¹⁶ אבל גם יוצר המכשול נכונה בין luminal microbiota mesenchymal/החיסון סטרילי מאוכלס תא סביבות serosal. אלו היבטים חשובים לשקול עבור מחקרים עתידיים המשלבים monolayers enteroid/colonoid עם סוגי תאים mesenchymal, המערכת החיסונית או עצביים לבנות מודלים פיזיולוגי מורכב יותר.

ציין מגבלות של תרבות תא הוספה המודל המתואר כאן כוללים חוסר כוחות פיזיים כגון גזירה נוזלים ודחיסת מכני מתיחה / (הפריסטלטיקה), היעדר סביבה אנאירובית הפסגה מנוסים בדרך כלל על ידי מעיים epithelia ויוו. רכיבים אלה יש פוטנציאל יטופל עם פלטפורמות microphysiological מתוחכמים יותר,²⁶ , אבל הם גם לדרוש הוצאות נוספות, ציוד ומומחיות ליישם. תרבויות 3D והן חד שכבתי הם גם ללא אינטראקציות עם או תרומות microbiome מעיים של אוכלוסיית תאי סטרומה, המערכת החיסונית אלא אם רכיבים אלה מתווספים בכוונה.

יישומים עתידיים של טפט enteroid/colonoid על קולגן תאים מצופים הרביעי תרבות מוסיף עשויים לכלול מחקרים אחרים של אינטראקציה חיידקים פתוגניים או commensal, ספיגת תרופה או חומר מזין, רעילות, חילוף החומרים, הפונקציה מכשול, פונקציונלי שיפור על ידי תרבות משותפת עם סוגי תאים מעיים נוספים. הערכות יכולה להיעשות לא רק בתוך epithelia של תורמים בריא, אלא גם מאנשים עם מוטציות גנטיות או הפרעות במעיים, בתנאי הפנוטיפים ויוו נקבעו יישמרו ב- ex-vivo enteroid/colonoid תרבות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01	Tocris	2939	ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin	Life Technologies	A12379	Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail	Invivogen	ant-pm-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Life Technologies	17504-044	Component of growth medium
Cell culture inserts	Corning	3470	Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life Technologies	C10639
Collagen IV, from human placenta	Sigma	C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution	Trevigen	3700-100-01	Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)	Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments	EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode	World Precision Instruments	STX3
Escherichia coli strain HS	Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute	Pharmco	111000200
FluorSave mounting medium	Millipore	345789	For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line	van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research		For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line	Trevigen	3710-001-K	For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M	Life Technologies	15630-080	Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004250
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-01M	Component of growth medium
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896	Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope	Olympus	CKX51
LB broth	EMD Millipore	1.10285.0500
L-WNT3A cell line	ATCC	CRL-2647	For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356231	Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper	United BioSystems	MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal	Abcam	ab11197	Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker	Grant Instruments	PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x	Life Technologies	15140-122	Component of growth medium
Phosphate buffered saline	Corning	21-031
Probe sonicator with microtip	Branson Ultrasonics	450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells	Sigma	P8340	Component of lysis buffer
SB 202190	Tocris	1264	p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride	Sigma	S3014	Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate	Sigma	D6750	Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L3771	Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x	Life Technologies	12605-010	Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab129002	Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	RhoA/ROCK inhibitor