Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Özet

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Özet

Crypt temel kök hücrelerden elde edilen insan 3 boyutlu (3D) enteroid veya colonoid kültürler şu anda bağırsak epitel en gelişmiş ex vivo modeli vardır. Onların kapalı yapılar ve önemli destek hücre dışı matriks nedeniyle, 3D kültürlerin ana bilgisayar-patojen çalışmaları için ideal değildir. Enteroids veya colonoids-ebilmek var olmak her ikisi de manipülasyon luminal izin vermek için geçirgen doku kültürü membranlar üzerinde epitel monolayers olarak yetiştirilen ve demiri hücre yüzeyleri ve eşlik eden sıvı. Bu gelişmiş luminal yüzey erişilebilirlik enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolon epiteli üzerinde mukus aşağılayıcı yeteneği gibi bakteriyel konak epitel etkileşimleri modelleme kolaylaştırır. 3D kültür parçalanma, monolayer tohum ve confluency ve farklılaşma doğru ilerlemesini izlemek için transepithelial elektriksel direnç (TER) ölçümleri için bir yöntemi açıklanmıştır. Colonoid monolayer farklılaşma tarafından ayirt veya immunoblotting teknikleri eğitimi salgılanan mukus verir. Daha genel olarak, enteroid veya colonoid monolayers tarafından patojen veya komensal microbiota hedefleyebilir belirli hücre popülasyonlarının değerlendirmek fizyolojik ilgili bir platform sağlar.

Giriş

Bağırsak organoids, enteroids ve colonoids kök hücre davranış, bağırsak geliştirme, bariyer/Aktarım işlevi ve hücresel başkalaşım anlamada birçok gelişmeler yol açmıştır. ¹ ancak, 3D kültür ana bilgisayar epitel patojen etkileşim çalışma çünkü Lümen bakteri için doğrudan erişilebilir değil ya da kapalı yapılar için mikroenjeksiyon tabi olan sürece virülans faktörleri sınırlar. ^{2 , 3} Ayrıca, küçük moleküller, proteinler, gibi malzemeler salgılanan veya mukus kolayca aşağı akım analizi için 3D kültüründen örnek olamaz. Epitel bariyer fonksiyonu⁴ ve iyon taşıma⁵ Patojen ajanlara etkisini floresan boyalar ve hızlandırılmış mikroskobu kullanarak 3D kültüründe değerlendirilmiştir ama geçirgen doku kültürü destekler üzerinde yetiştirilen monolayers için mükellef bulunmaktadır TER ölçüm ve Ussing odası/gerilim kelepçe yazmak gibi ek teknikleri. ^{6 , 7}

Çok sayıda yayın iletişim kuralları için enteroids/colonoids 2D veya monolayer kültürünü anlatmıştık. Epitel hücre eki tanıtmak için bulunan malzemeler dahil kollajen hydrogels,^8,%9 0,1 jelatin,¹⁰ ince katmanlı fare sarkomu kaynaklı membran matris (BMM),^{11,12, 13} ve insan kollajen IV. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17} tohumlama yaklaşım mekanik parçalanma^6,14,15 ve/veya ayrılma Tripsin,^10,11 kullanarak hücre adezyon faktörlerin pipetting tarafından içerir dispase,¹³ veya EDTA. ⁹ tohum için gözenekli olmayan doku kültürü plasticware birkaç protokolleri kullanır, ancak çoğu uygulamalar geçirgen doku kültürü ekler üzerinde bağlıdır bu yüzden bu demiri erişimi kısıtlar. İstikrarlı Konfluent monolayer oluşumu ve bakım belgelerine yaygın yayınları arasında değişir. Ayrıca, insan kültürler için büyüme ve farklılaşma medya besteleri ve çeşitli gruplar arasında farklı olarak daha fazla araştırmacılar kabul ve onların uygulama ve kullanılabilir kaynakları uygun yöntemi ayarlamak gelişmeye devam.

Ana bilgisayar-patojen etkileşim çalışmaları 3D bağırsak epitel kültürünün sınırlamaları gidermek için biz 3D insan enteroids veya colonoids bir monolayer dönüştürmek için değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Confluency bir mezar odası gibi olgunlaşmamış devlet elde sonra büyüme faktörleri WNT3A, RSPO1 ve A-83-01 ve SB 202190 inhibitörleri geri çekilmesi farklılaşma küçük bağırsak villus veya yüzey kolon epiteli temsilcisi yol açar. Biz tanımlamak ideal matrix, insan kollajen tip IV, ekler ceket ve üniforma enteroid veya colonoid parçaları için kaplama elde etmek için. Bu iletişim kuralı Konfluent monolayer bir yüksek TER. Colonoid monolayers kalın apikal mukus tabakası salgılar üreten ex vivo çalışmalar patojen-mukus etkileşim yolu ile immunoblotting ya da immunostaining için izin göstermektedir. İmmunostaining kolon mukus tabakası korumak için değiştirilmiş fiksasyon yordam Ayrıca açıklanmıştır. Bu yöntem en erken bağırsak ana bilgisayar-patojen etkileşimleri enfeksiyon üzerine çalışmaya uysal bir modeli sunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Bu protokol çalışmaları önceden yazarlar tarafından yayınlanan dayanmaktadır. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16} aşağıdaki adımları uygun aseptik teknikler kullanarak bir steril Biyogüvenlik dolapta yürütülmesi gereken. Tüm yöntemleri insan örnekler içeren kurumsal inceleme kurulu, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından (IRB NA_00038329) onaylanmış olması.

1. kat hücre kültür ekler hücre dışı matriks ile

1. 5 mL stok kollajen IV çözeltisi (1 mg/mL) 100 mM Asetik asit hazırlayın. 4 ° C'de yaklaşık 4 h için tam hidrat/erime bekletin.
2. Aliquot kollajen IV çözüm stok ve stok 4 ° c (≤ 1 ay) ya da -20 ° C (> 1 ay).
3. Hemen önce kaplama, kollajen IV hisse senedi çözüm son konsantrasyonu olarak 34 μg/mL steril doku kültürü sınıf suda sulandırmak. 24-şey plaka için hücre kültürü ekler, kat 10 μg/cm²' ye karşılık gelen çözüm 100 μL ile yerleştirin.
4. Plaka bir standart CO₂ doku kültürü kuluçka 37 ° C'de ≥ 2 h, için kuluçkaya veya parafin film ile plaka kenarları kolaylık sağlamak için mühür ve 4 ° C gece veya en çok 1 hafta kuluçkaya.

2. enteroids/colonoids 3D kültüründen izole

Not: Enteroids veya colonoids donör biyopsi kurulan ve daha önce açıklanan standart protokolleri göre 3D kültür saklanır. ^{14 , 18} kısaca, bağırsak biyopsisi veya kısaltma şelasyon ve mekanik ajitasyon üzerinden kriptalarının hasat. Kriptalarının yıkanmış, hasat ve BMM içinde kaplama. Genişletme Ortam (4.2. adımda açıklanan) kültür için eklendi ve 2 günde yerine. 3D kültür oluşumu kaplama sonraki saat içinde görünür.

1. 24-şey plaka kültür ortamından Aspire edin ve 1 mL buz gibi hasat çözümü ile değiştirin ( Tablo malzemelerigörmek) iyi başına.
2. Çıkarmak ve iyi kenarlarına yakın herhangi bir malzeme için özel önem membran matris Pelet ayrılık için bir mini cep kazıyıcı kullanın.
3. Plaka bir orbital Çalkalayıcı yaklaşık 200 devirde, 30-45 dk 4 ° C üzerinde tahrik.

3. ayırmak 3D enteroids/colonoids

1. Hücre süspansiyon triturate için P200 tek kanallı pipet veya steril filtre ipuçları ile donatılmış bir çok kanallı pipet kullanın.
2. Hücre suspension(s) 15 mL konik şişe içinde havuz. Toplam süspansiyon birim > 6 mL ise birden fazla şişeleri kullanın.
3. 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptid (1 x) ve penisilin-streptomisin (1 x) içeren gelişmiş DMEM/F12 orta eşit bir birim eklemek (yıkama orta). Tüp 3 - 4 kez ters karıştırmak için. Santrifüj vasıl 300 x g, 10 min, 4 ° C.
   1. İsteğe bağlı olarak, yıkama orta Aspire edin ve 0.5 mL/iyi tripsin ile değiştirin ( Tablo malzemelerigörmek). P200 pipet ile colonoids resuspend, tüp kap ve yaklaşık 2 dk. hemen tüpü çıkarması, yıkama orta son hacmi 10 mL için eklemek ve Santrifüjü adım 3.3 olduğu gibi tekrar bir 37 ° C su banyosunda yer.
      Not: Bu adımı toz içinde birörnek boyutlu parçaları kaynaklanan değil Eğer daha uygun olabilir.

4. enteroid/colonoid süspansiyon kaplama

1. Kaplamalı ekler 4 ° C'de depolanmış, en az 30 dk önce hücre kaplama için 37 °C/5% CO₂ doku kültürü kuluçka equilibrate.
2. Kaplama, her eklemek için 1 mL (arasında 25-37 ° C) sıcak genişleme orta (EM) hazırlamak ve 10 mikron Y-27632 ve 10 mikron CHIR 99021 ekleyin.
   Not: Gelişmiş DMEM/B27 içeren F12, EM oluşmaktadır (1 x), % 50 WNT3A şartına orta, % 15 şartına RSPO1 orta, % 10 şartına kafa orta, 50 ng/mL insan EGF, 500 nM A-83-01, 10 mikron SB 202190, antibiyotik/antimycotic kokteyl (1 x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptid (1 x) ve penisilin-streptomisin (1 x) ( Tablo malzemelerigörmek).
3. Hücre Pelet içeren tüp yıkama ortamından Aspire edin ve hacmi EM en az 100 μL/INSERT verim için yeterli resuspend.
4. Her ekleme kollajen IV çözümden Aspire edin ve iki kez yıkama orta Ekle başına 150 μL yıkayın.
5. Damlalıklı 600 EM μL her ekleme altında uzaya.
6. Damlalıklı 100 μL hücre süspansiyon her ekleme içine.
7. Plaka için doku kültürü kuluçka dönün ve en az 12 h için rahatsız bekletin.
   Not: sallayarak veya keskin colonoid parçaları Ekle membran üzerinde düzensiz dağılımı önlemek için plaka devirme kaçının.
8. Hücre eki izlemek ve Konfluent monolayer 2.5 faz kontrast ışık mikroskobunda plaka yerleştirerek oluşturmak için yayılan x objektif lens x-10.
9. 1-2 gün sonra çoğu parçaları kollajen matris için uygun olmalıdır. Kültür orta yenileyin ve Y-27632 ve CHIR 99021 ile tedavi kaldırabiliriz. Her 2-3 gün öncesine kadar birleşmesi orta yenilemeye devam. Confluency genellikle 7-10 gün içinde ulaşılır.

5. ölçü transepithelial elektriksel direnç

1. Elektrot yol açar ve açık epitel voltohmmeter (EVOM) olarak ekleyin. Ölçüm işlevi Ohm için ayarlandığını doğrulayın.
2. Elektrot ipuçlarında kısaca %70 etanol daldırma ve laboratuvar doku ile kuru silin. Elektrot yıkama orta yaklaşık 5 min için 5 ml equilibrate.
3. INSERT orta kısa elektrot uç bırakın ve daha uzun elektrot ucunu alt iyi plaka yönlendirmek. Elektrot EVOM okuma nispeten istikrarlı olana tam dikey yönde veya için artık 60'dan korumak s.
   Not: elektrot derleme uzak dikey hareket ettirildiğinde veya uç yükseklik uygun olmayan şekilde ayarlanır, daha kısa ipucu temas ve hücre monolayer bozabilir.
4. Kültür confluency veya farklılaşma ilerlemeyi değerlendirmek için orta batık bir boş hücre eklemek elde edilen değere EVOM ölçümlerin karşılaştırıldığında.

6. farklılaşma Konfluent enteroid/colonoid monolayers

1. EM farklılaşma orta (DM) döviz ve iki günde 5 gün kadar medya yenilemeye devam etmek. DM's WNT3A, RSPO1, yoksun EM A-83-01 ve SB 202190.
2. TER farklılaşma beklendiği gibi devam etmeden olduğunu doğrulamak için izlemeye devam edin. TER farklılaşma 1-5 günlerde artmaya devam edecektir. Monolayers TER artırmak ve canlılık gün 5-6 ötesinde korur ancak gün 5-6'kullanıldığında maksimal ve en tekrarlanabilir sonuçlar sergi devam edebilir.

7. komensal veya patojenik E. coli ile bakteriyel enfeksiyon

1. Enfeksiyonu, taşıma öncesinde bir gün yıkama ve monolayers antibiyotik-Alerjik EM veya DM ile beslemek.
2. Steril Mikrobiyoloji döngü yavaşça bir donmuş bakteriyel gliserol hisse senedi yüzeyini kazımak ve 2 mL LB suyu aşılamak için kullanın. 12-16 h 37 ° C'de kuluçka sallayarak bir standart tüp aktarın.
3. Starter kültür 50 μL 5 mL taze LB suyu (1: 100) sulandırmak ve kuluçka için 90 dk sallayarak ile devam edin. Bu bir günlük faz kültür 10⁵-10⁶ koloni oluşturan birim (cfu) yoğunluğu ile verim / mL.
   1. İsteğe bağlı olarak, 600 optik yoğunluk ölçüm tarafından bakteri konsantrasyonu onaylamak nm (OD600) bir Spektrofotometre içinde.
4. Spin aşağı 12.000 x g 10 dk de bakteri kültürü, süpernatant kaldırmak ve 10⁷ cfu/mL nihai bir konsantrasyon için antibiyotik-Alerjik EM veya DM bakteri resuspend.
5. Bakteriyel süspansiyon 10 μL Ekle (son konsantrasyonu 10⁶ cfu/mL) Ekle. Damlalıklı yavaş yavaş karıştırın ve ekstraselüler mukus tabakası rahatsız edici önlemek için.
6. Plaka için doku kültürü kuluçka istenen enfeksiyon dönemi için dönmek.

8. fiksasyon için koru ve immunostain mukus

1. 24-şey plaka, hücre kültürü ekler Asansör dikkatle apikal orta kaldırıp Ekle'nin üzerine yapışan uzak dış sıvı temizlemek için bir laboratuvar doku kağıt üzerinde tersine çevirin.
2. Yeni bir 24-şey tabak içinde 1:3 çözüm buzul Asetik asit mutlak etanol (Clarke'nın çözüm) oda sıcaklığında 10 dakika için INSERT bırakın.
3. Sabitleştirici kaldırmak ve 1 x PBS için 10 dk. Proceed standart immunostaining protokollerle hücrelerde rehydrate Ekle tersine çevirin.
4. Bir tıraş bıçağı Ekle membran çevresini kesmek için kullanın. Membran forseps kullanarak bir cam mikroskop kaymak için aktarmak ve montaj orta ile bir coverglass yapıştırmayın.

9. immunoblotting için hücre lysates hazırlanması

Not: buz veya soğuk bir odada aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

1. Orta ve yıkama INSERT bir kez PBS ile Aspire edin.
2. (Bkz: malzemeler tablo) 150 μL lizis arabellek içeren proteaz inhibitörleri eklemek için Ekle ve 5-10 dakika bekletin lizis arabellek içeriyor 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, %1 IGEPAL CA-630, % 0.5 sodyum deoxycholate, % 0,1 SDS, 1: 100 proteaz inhibitörü kokteyl.
3. Hücreleri gelen Ekle kaldırmak için bir mini cep kazıyıcı kullanın, sonra kısa bir süre askıya alınması ve bir microcentrifuge tüp transferi triturate için P200 pipet kullanın.
4. 5 x 1 ile süspansiyon solüsyon içeren temizleyicide s bakliyat % 20 genlik bir microtip kullanarak, araştırma ( Tablo malzemelerigörmek).
5. Hemen Elektroforez veya aliquot performans SDS-sayfa yükleme arabellek ekleyin ve lysates-20 ° C'de depolayın

Sonuçlar

İnsan enteroid ve colonoid kültür 3D yapılar yetiştirilen sonra ayrışmış ve insan kollajen IV kaplı hücre kültür ekler üzerine kaplama için parçalanmış. Monolayer oluşumu ilerlemesini kolayca yansıtan transepithelial elektrik direnci (TER) (Resim 2), parlak alan mikroskobu, ayirt (şekil 1), boyama yoluyla ve sürekli bir artış tarafından günlük olarak izlenir iyonları ve ilişkilendirir monolayer confluency ile sıkı kavşak geçirgenliği. Boş bir 24-şey ekleme TER yaklaşık 50-100 Ω·cm²ve confluency ulaşan üzerine yaklaşık 400-500 Ω·cm²için artırır. Konfluent monolayers tüm epitel hücreleri bileske kompleksleri tarafından elde hücre çevre F-aktin yüzüğe bağlı (Şekil 1). Monolayers tam büyüme faktörü medyada temsil öncelikle aktif nükleozit dahil hücre bölünmesi ile oluşan proliferatif crypt benzeri epitel analog EdU (Şekil 2). Büyüme faktörleri WNT3A ve RSPO1 geri çekilmesi Proliferasyona hücreleri eksikliği villus benzeri kültürler için önde gelen farklılaşma, teşvik etmektedir. Farklılaşmış monolayers enterositler (enteroids) veya colonocytes (colonoids) içeren ve 3D kültürlerde, kadehi ve enteroendocrine hücreleri de dahil olmak üzere¹⁸ gösterildiği gibi özel bağırsak epitel hücreleri geliştirmek. ¹⁵ Differentiated monolayers da TER (> 1000 Ω·cm²) önemli bir artış göstermektedir (Resim 2), olgun sıkı kavşak gösteren.

İçinde normal insan fizyolojisi, bağırsak epitel tabakası steril serozal ortamından besin ve mikrop zenginleştirilmiş luminal alanı ayırır. Epitel çapraz-hadis bu iki bölmeleri arasında sıkı bir şekilde düzenler. Enteroid ve colonoid monolayers proteomik analizinde görüldüğü gibi bu önemli Bölünebilme özelliğini korumak Tablo 1. Apikal protein bileşiminde arasında önemli farklılıklar vardır ve demiri farklılaşmış enteroid monolayers toplanan medya şartına. Erişim apikal ve demiri iki taraf için de her iki supernatants koleksiyonu için başka moleküllerin sitokinler ve kemokinler fark salgılanmasını ölçüm için bir zaman bağımlı şekilde sağlar. ^{15 , 17}

Monolayers protein ifade immunoblotting ve immunostaining kullanarak değişiklikleri algılamak için rahat ve son derece tekrarlanabilir modellerdir. Böylece, değiştirir müsin 2 (MUC2) her iki teknikleri (şekil 3) kullanarak ifade shRNA nakavt (KD) tarafından algılanabilir. ShRNA iletim 3D colonoids üzerinde gerçekleştirilen ve antibiyotik seçimi medyada bakımı. KD doğruladıktan sonra colonoids sürekli 3D kültürleri yapılmaktadır ve/veya monolayers deneysel amaçlar için kaplama. Ayrıca, MUC2 KD monolayer oluşumu vahşi türü ebeveyn colonoid hattına göre verimliliğini etkilemez. Monolayers immunoblotting için basit ve benzer insan epitel adenokarsinom türetilmiş hücre hatlarında açıklanan protokollere oluşur. Genellikle, yaklaşık 50 µg veya daha fazla toplam protein bir tek 0,33 cm² Ekle-yetiştirilen monolayer ayıklanır. Şekil 3' te gösterildiği gibi MUC2 farklılaşmamış (UD) WT colonoid monolayers ancak algılanabilir ama son derece farklılaşmış (DF) WT monolayers ifade edilir. MUC2 MUC2 shRNA ile transduced UD ve DF colonoid monolayers algılama düzeyi altında.

Önemlisi, monolayers ana bilgisayar-mikrobiyal etkileşimlerin epiteli apikal yüzeyde çalışmaya uygun bir model vardır. Colonoid monolayers şeklinde bir kalın ekli MUC2 pozitif mukus tabaka kolayca komensal tarafından nüfuz değil farklılaşma üzerine E. coli HS bakteri (şekil 4), normal insan kolonda sürülmüştür için benzer. ¹⁹ ancak, enterohemorrhagic E. coli (EHEC), insan bir kolon patojen apikal yüzey epitel (şekil 4) ulaşmak için ekli mukus MUC2 zenginleştirilmiş katman yok yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. ^{14 , 20} kalan MUC2 sadece goblet hücreleri içinde mevcuttur.

Şekil 1: İnsan enteroid/colonoid monolayers kurulması. (A) colonoid örneği BMM ve toz dağılmasından sonra parçaları. (B) örneği hemen sonra colonoid parçaları kaplama ekle. Ölçek (bar A-B) = 200 mikron. Colonoid parçaları birden fazla monolayer Adaları insan kollajen IV kaplı filtreleri form üzerine numaralı seribaşı temsilcisi (C) en fazla yoğunluk projeksiyon ve (D) confocal optik Z-bölümle ilgili orthogonal projeksiyonlar göster 2-4 gün sonrası tohum. Boş hücre alanları (yıldız işareti) her iki nükleer devamsızlık (Höchst 33342, mavi) tarafından tanımlanabilen ve apikal F-aktin (phalloidin, yeşil) Boyama C ve d temsilcisi (E) maksimum yoğunluk projeksiyon ve (F) confocal optik bölümle ilgili orthogonal projeksiyonlar F-aktin immunostaining yaklaşık 1 hafta sonrası tohum tarafından algılanan sürekli apikal yüzeyli Konfluent colonoid monolayer göster. (G) bir temsilci maksimum yoğunluk projeksiyon ve karşılık gelen orthogonal projeksiyonlar (H) confocal optik bölümle yüksek büyütme göstermek Konfluent colonoid monolayers hücrelerde F-aktin perijunctional formu Yüzük (beyaz ok ucu) ve bir olgunlaşmamış apikal fırça sınır (sarı ok uçları). Ölçek (bar C-H) = 20 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: enteroid/colonoid monolayer farklılaşma değerlendirilmesi. (A) EdU (kırmızı) birleşme yayılması sırasında jejunal monolayer farklılaşma ilerici kaybı gösterir. (B) ortalama TER Konfluent jejunal monolayers genişleme veya farklılaşma orta ölçümlerde. Hata çubukları SEM farklılaşmamış UD, temsil; DF, ayrıştırılan. Numaraları belirtilen koşulu altında gün karşılık gelir; UD1 confluency, ilk gün tohum sonra yaklaşık 1 hafta oldu. (C) geniş, daha kısa hücreleri ve DF 5 gün jejunal monolayers daha az olgun apikal aktin esaslı fırça sınır UD jejunal monolayers sahiptir. Ölçek (A, C) = 50 mikron. Tüm monolayers vardı en az 1 hafta sonrası tohum tasvir ve farklılaşma başlamadan önce Konfluent. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Vahşi türü colonoids ve shRNA transduced nakavt (KD) colonoids her form Konfluent monolayers. (A) vahşi türü (WT) insan Konfluent colonoid monolayer temsilcisi görüntülerini 5 gün için ayrıştırılan ve (B) monolayers benzer şekilde yetiştirilen MUC2 KD colonoid kültürler türetilmiş. Ölçek (bar A-B) = 50 mikron (C) temsilcisi immunoblot şifreli shRNA veya MUC2 shRNA ile transduced colonoid kültürlerin gösterir KD nedeniyle protein ifadesindeki değişiklik immunoblot tarafından quantitated. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Enteroid/colonoid monolayers modellerdir luminal mikrop-ana etkileşimler çalışmaya uygun. (A) temsilcisi maksimum yoğunluk projeksiyon ve colonoid monolayer ortogonal optik bölümünü gösterir E. coli için HS (siyah ok uçları) geçirgen değil kalın apikal MUC2 pozitif mukus tabakası apikal mukus oturan yüzey. Monolayer 6 saat 10⁶ cfu/mL HS ile enfekte oldu. (B) apically (10⁶ cfu/mL, 6 saat) EHEC ile enfekte insan colonoid monolayer temsilcisi maksimum yoğunluk projeksiyon. Ölçek (bar A-B) = 50 mikron. (C) MUC2 ayirt yoğunluk ölçümleri bulaşmamış kontrollere göre EHEC enfekte colonoid monolayers MUC2 önemli bir azalma gösterir. Hata çubukları temsil SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protein	Üyelik numarası	Peptid bereket
Demiri medya
yağ asidi bağlayıcı protein, karaciğer [Homo sapiens]	NP_001434.1	1299
profilin-1 [Homo sapiens]	NP_005013.1	797
apolipoprotein A-IV habercisi [Homo sapiens]	NP_000473.2	744
Ecto-ADP-ribosyltransferase 4 habercisi [Homo sapiens]	NP_066549.2	633
gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz izoformu 1 [Homo sapiens]	NP_002037.2 (+ 1)	616
serotransferrin habercisi [Homo sapiens]	NP_001054.1 (+ 1)	572
D vitamini bağlayıcı protein izoformu 3 habercisi [Homo sapiens]	NP_001191236.1 (+ 2)	567
katalaz [Homo sapiens]	NP_001743.1	427
Agrin izoformu 1 habercisi [Homo sapiens]	NP_940978.2 (+ 1)	377
lactotransferrin izoformu 1 habercisi [Homo sapiens]	NP_002334.2 (+ 1)	262
Apikal medya
Trefoil faktör 3 habercisi [Homo sapiens]	NP_003217.3	326
Trefoil faktör 1 habercisi [Homo sapiens]	NP_003216.1	304
membran özel heparan sülfat proteoglikan çekirdek protein izoformu habercisi [Homo sapiens]	NP_001278789.1 (+ 3)	303
filamin-B izoformu 1 [Homo sapiens]	NP_001157789.1 (+ 2)	240
Trefoil faktör 2 habercisi [Homo sapiens]	NP_005414.1	182
kötü huylu beyin tümörü 1 protein izoformu b habercisi [Homo sapiens] silindi	NP_015568.2 (+ 3)	169
keratin, tip II hücre iskeleti 1 [Homo sapiens]	NP_006112.3	157
myosin-9 [Homo sapiens]	NP_002464.1	150
aminopeptidaz N habercisi [Homo sapiens]	NP_001141.2 (+ 1)	145
Agrin habercisi [Homo sapiens]	NP_940978.2 (+ 1)	112

Tablo 1. Apikal içinde sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi ile tanımlanan peptidler ve demiri sıvıları örneklemeyi kısmi bir listesi jejunal monolayers farklı.

Tartışmalar

Enteroid/colonoid monolayers başarılı oluşumu için kritik parametreleri içerir 1) sağlıklı, Proliferasyona 3D olarak başlangıç materyali kültürler 2) monolayer tohum önce insan kollajen IV ile hücre kültür Ekle yüzey kaplama; 3) parçalanma 3D kültürlerin mekanik veya enzimatik, tek hücre düzeyi için değil.

Sırasında yalıtım 3D enteroids/colonoids, optimum sallama hızını verilen shaker manken Dönme çapı bağlı olarak değişebilir. Niyet olduğu için sadece tahrik plaka verimli bir karıştırma için ama aynı zamanda hücre süspansiyon plaka kapak veya sıçramasına önlemek için bitişik kuyu içine. < 30 dk kuluçka dönemleri kalan BMM eki ve ekler üzerinde kaplama zaman tek tip hücre monolayers oluşumu engelleyebilir hücreleri, sıkı bir verim. Geniş kuluçka (≥ 1 h) önemli ölçüde azalma hücre canlılığı ortaya çıkarır.

Toz 3D enteroids/colonoids ayırmak için gerekli ölçüde piston sertlik ve kullanıcı el becerisi ile değişebilir. Bir faz kontrast ışık mikroskobu üzerinde iyi içindekiler periyodik muayene sırasında toz, parça başına yaklaşık 30 hücre amacı ile parçası tekdüzelik belirlemek için önerilir. Pazarlanabilirlik ve veya toz yanı sıra, süspansiyon kısaca tripsin ile daha küçük üniforma parçaları elde etmek için sindirmek. Tripsin Özet monolayers 3D benzeri yapıları aksi takdirde tek bir epitel tabaka arasında büyük bir kısmı içeriyorsa istenebilir. Ancak, bu önemli ölçüde hücre canlılığı azaldıkça ayrılma tek hücrelere arzu değil. Enteroids/colonoids 35 μL BMM damlacık içinde kültürlü bir kuyu genellikle 2-3 ekler doldurmak için yeterli olacaktır ancak bu faktör sayısı ve ortalama boyutu enteroids/colonoids bağlı olarak değişebilir.

Onlar ayırt etmek gibi Colonoid monolayers önemli bir birim apikal orta absorbe. Kısmi üst TMMOB kurutma monolayer canlılığı veya aşağı akım deneyleri işlevinde olumsuz etkileyen için görünmüyor olsa da bu üst Ekle Odası (150-200 μL), ek DM uygulayarak atlatılabilir. Farklılaşma yaklaşık 4-5 gün sonra colonoid monolayers DM dikkatli aspirasyon sonra hücre yüzeyinde kalın/jelatinimsi malzemesi olarak görülebilir ekstraselüler mukus geliştirmek.

EHEC dış mukus katman etkileşim için düzenli olarak iletişim kuralında belirtilen bakteriyel titresi ve kuluçka dönemi kullanın. Ancak, benzersiz bakteri suşları başlangıçta birden çok konsantrasyonları ve istenen etkiyi uygun parametrelerini belirlemek için kuluçka dönemleri denetlesinler.

Mukus fiksasyon sırasında apikal orta aspirating ekstrasellüler bekâr mukus tabakasının en büyük olasılıkla kaldırır. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde orta dökmek önemlidir. Orta INSERT tarafından yüzey gerilimi korunur, yüzey gerilimi kırmak ve Dış saha orta çoğunu fitil katlanmış laboratuvar mendil köşesine kullanın. Fiksasyon boyama sonra mukus tabakası istemeden yerinden ve INSERT filtre bir coverglass montaj sırasında basık. Mukus yükseklik korumak için filtre ortam takma bir damla üzerinde yerleştirin ve dikkatle üzerinde filtre coverglass yer. Dokunun veya bu önemli ölçüde mukus tabakası dümdüz gibi coverglass üzerinde bastırın değil.

Polarize monolayer 3D kültüründe hücreleri oluşturmak için demiri membran integrinler bağırsak epitel hücre ve hücre dışı Matriks (ECM) proteinler arasındaki etkileşimi yeniden oluşturmak gereklidir. Laminin, kollajen IV, fibronektin ve Proteoglikanlar dizisi bağırsak epitel ECM oluşturmaktadır. ^{21 , 22} biz insan hücre kaynaklı laminin, fibronektin, kollajen IV ve BMM antikorundan kaynaklı Ekle kaplamalar göre. Sadece kollajen IV istikrarlı, uzun vadeli (4 hafta) oluşumu desteklenen Konfluent enteroid/colonoid monolayers (şekil 1-2). Küçük yamalar monolayer benzeri büyüme her diğer test matrisler üzerinde elde edildi, ama bu bölgeler confluency için ilerleme başarısız oldu. ECM vekil birçok avantajı olduğu gibi insan kollajen IV kullanın. Oysa insan kollajen IV piyasada bulunan ve genellikle daha düşük maliyetli BMM Engelbreth-Holm-Swarm (EHS üzerinden fare sarkomu hücreler insan kökenli, değildir) türetilmiş. Ayrıca, BMM proteinler doğasında değişkenliği ile karmaşık bir karışımı ve büyüme sarkomu tarafından salgılanan gen ekspresyonu etkileyen faktörleri içerebilir. ²³

Bağırsak epitel hücreleri ve bağırsak epitel iadesi temel ECM arasındaki etkileşimler hala eksik olarak anlaşılmaktadır. Kollajen IV ancak değil laminin, önemini bir yapışma ligand insan colonocytes²⁴ ve bağırsak crypt epitel hücre iadesi²⁵ artırıcı olarak kollajen eki engelledi IV karşı antikor kullanmayı önerdi . Epitel ifade β1-integrin β1-integrin için belirli bir antikor önemli ölçüde colonocytes IV kollajen yazın yapışma engellenmiş olarak ECM etkileşim için önemli gibi görünüyor. ²⁴ kollajen IV güvenilir ECM sağlarken enteroid/colonoid monolayer için ekler, ECM zaman içinde remodeling epitel oluşumu henüz bu modelde değerlendirilmemiştir, ne de daha karmaşık ve tanımlanmış ECM karışımları etkisi vardır kollajen IV, laminin ve fibronektin.

İnsan enteroids/colonoids (şekil 1-4) monolayer biçiminde manipülasyonlar etkinleştirmek ve bu örnekleme hantal veya 3D matris gömülü kültürler kullanarak elde etmek mümkün olacaktır. 3D enteroids/colonoids boyutu, yapısal karmaşıklık ve luminal birim değişir ve böylece mikroplar veya küçük moleküller mikroenjeksiyon doğru bir şekilde quantitate zor. Ayrıca, monolayers (Tablo 1) aksine, iyonlar, besin, sitokinler veya salgılanan faktörler fizyolojik veya Etyopatogenezi işlemlerle ilişkili ölçmek için her iki luminal ve demiri yüzeyler için doğrudan erişim 3D kültürler önlemek . Confluency (şekil 1-2) enteroid/colonoid monolayer kurulması sadece besin fizyolojik degradeler, iyonlar ve diğer oluştururlar,¹⁶ ama aynı zamanda uygun bariyer oluşturmak için gerekli ana özelliklerini biridir luminal microbiota ve steril Mezenkimal/bağışıklık hücre doldurulan serozal ortamları arasında. Bu kısıtlamalar dahil enteroid/colonoid monolayers daha karmaşık fizyolojik modelleri oluşturmak için Mezenkimal, bağışıklık veya nöronal hücre tipleri ile gelecekteki çalışmaları için dikkate almak önemlidir.

Sıvı kesme stres ve mekanik streç/sıkıştırma (peristaltizm) gibi fiziksel güçleri eksikliği ve normalde bağırsak tarafından deneyimli bir anaerobik apikal ortam yokluğunda burada açıklanan hücre kültür Ekle modelinin kaydetti sınırlamaları içerir epiteli içinde vivo. Bu öğeleri daha sofistike microphysiological platformları,²⁶ ile ele alınması için potansiyel var ama onlar da ek masraf, ekipman ve uygulamak için uzmanlık gerektirir. Bu bileşenler kasıtlı girmediğiniz sürece hem 3D hem monolayer kültürleri ile etkileşimleri veya bağırsak microbiome, stromal hücre popülasyonlarının ve bağışıklık sistemi olmadan da vardır.

Enteroid/colonoid monolayer kollajen IV kaplı hücre kültür ekler üzerinde gelecekteki uygulamalar diğer çalışmalar patojen veya komensal mikrobiyal etkileşim, uyuşturucu ya da besin alımı, toksisite, metabolizma, bariyer fonksiyonu, içerebilir ve fonksiyonel ek bağırsak hücre tipleri ile ortak kültür tarafından katalize ayný ölçüde geçerlidir. İçinde vivo fenotipleri ex vivo enteroid/colonoid kültür korunmuş gibi kurulan sağlanan değil sadece epiteli sağlıklı bağış aynı zamanda bireylerin Genetik mutasyonlar veya bağırsak bozuklukları, içinde değerlendirme yapılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01	Tocris	2939	ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin	Life Technologies	A12379	Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail	Invivogen	ant-pm-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Life Technologies	17504-044	Component of growth medium
Cell culture inserts	Corning	3470	Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life Technologies	C10639
Collagen IV, from human placenta	Sigma	C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution	Trevigen	3700-100-01	Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)	Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments	EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode	World Precision Instruments	STX3
Escherichia coli strain HS	Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute	Pharmco	111000200
FluorSave mounting medium	Millipore	345789	For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line	van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research		For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line	Trevigen	3710-001-K	For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M	Life Technologies	15630-080	Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004250
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-01M	Component of growth medium
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896	Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope	Olympus	CKX51
LB broth	EMD Millipore	1.10285.0500
L-WNT3A cell line	ATCC	CRL-2647	For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356231	Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper	United BioSystems	MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal	Abcam	ab11197	Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker	Grant Instruments	PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x	Life Technologies	15140-122	Component of growth medium
Phosphate buffered saline	Corning	21-031
Probe sonicator with microtip	Branson Ultrasonics	450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells	Sigma	P8340	Component of lysis buffer
SB 202190	Tocris	1264	p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride	Sigma	S3014	Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate	Sigma	D6750	Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L3771	Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x	Life Technologies	12605-010	Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab129002	Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	RhoA/ROCK inhibitor