Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

Summary

שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.

Abstract

היבט מרכזי של התגובה החיסונית מושבת חיידקים של הפונדקאי היא phagocytosis. Assay הריגה opsonophagocytic (OPKA) הוא תהליך ניסוי שבו תאים phagocytic הם תרבותי משותף עם יחידות חיידקי. תאים חיסוניים phagocytose ולהרוג את התרבויות חיידקי באופן תלוי-המשלים. היעילות של ההרג בתיווך החיסון התא תלויה במספר גורמים, והוא יכול לשמש כדי לקבוע כמה שונה בקטריאלי תרבויות להשוות מבחינת עמידות בפני מוות של תאים. בדרך זו, וצריך להעריך את היעילות של פוטנציאל הרפוי המבוסס על החיסון נגד זני חיידקים ספציפיים ו/או אשר נגרמו מהזנים אליהם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים OPKA מפושטת אשר מנצל תנאים בסיסיים תרבות ותא לספור כדי לקבוע את הכדאיות תא החיידק אחרי תרבות משותפת עם הטיפול והתנאים תאים חיסוניים HL-60. בשיטה זו יש כבר מנוצל בהצלחה עם מספר שונה pneumococcal אשר נגרמו מהזנים אליהם, הסיבה acapsular זנים, ואת מיני חיידקים אחרים. היתרונות של פרוטוקול זה OPKA הם הפשטות שלה, צדדיות (כמו assay זו אינה מוגבלת נוגדן טיפולים כמו opsonins), ומינימיזציה של ריאגנטים להעריך קבוצות מעבדה בסיסית וזמן.

Introduction

Opsonophagocytic הורגת assay (OPKA) הוא כלי חיוני עבור קישור שינויים במבנה חיידקי או פונקציה לשינויים הבאים התגובה החיסונית ותפקוד. ככזה, הוא משמש לעתים קרובות כמו assay משלימים כדי לקבוע המבוסס על החיסון יעילותם של טיפולים נוגדן, חיסון מועמדים, אנזים אופטימיזציה, וכו '. בזמן מבחני ויוו נחוצים לקבוע סיווג יעיל או הגנה במודל של זיהום חיידקי, OPKA יכול לשמש כדי להעריך את התרומה חסין מוות תאים חיידקיים מרכיבים בסיסיים ביותר: חיידקים, תאי מערכת החיסון, וניסויים טיפולים. מחקרים קודמים הראו כי OPKAs יכול להיות שונה, המשמש למגוון רחב של חיידקים, אשר נגרמו מהזנים אליהם, כולל סטרפטוקוקוס pneumoniae¹, Staphylococcus aureus², Pseudomonas aeruginosa³. יתר על כן, מבחני ממוטבת אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את ניסיוני טיפולים שונים, כולל היכולת של אנזים לגרום החיידק יותר נגיש⁴ תאים חיסוניים בתיווך המשלים וטיפולי נוגדנים כדי לשפר opsonization⁵. באופן קלאסי, OPKA assay בהצלחה שימש במחקר בסיסי וקליני הגדרות כמו מחוון עוצמה להגנה המושרה על ידי נוגדנים ספציפיים הפתוגן^6,7,8,9 .

סוגים שונים של תאים חיסוניים עשוי לשמש להערכה של opsonophagocytic רצח. אוכלוסייה אחת phagocytic נפוץ הוא הקו תאי לוקמיה אדם HL-60. קו תא זה יכול להישמר כמו promyelocytes מוחלש בתרבות; עם זאת, הם יכול להיות מובחן המצבים השונים מופעל באמצעות סמים שונים טיפולים^10,11. טיפול של HL60 עם N, N-dimethylformamide מבדילה את שורת התאים לתוך נויטרופילים הופעל עם פעילות חזקה phagocytic¹¹. בעוד HL-60 תאים מוטבו משמשים לעתים קרובות אלה מבחני phagocytosis¹⁰, לויקוציטים אורך חייהם העיקרית אחרים יכול לשמש כזרוע המערכת החיסונית הניסוי¹².

בנוסף, מבחני אלה יכולה להיות מפושטת¹³ או מרובב¹⁴ להסתכל על מספר זנים עמידים לאנטיביוטיקה של החיידק להיבדק. השיטה מרובבת נעשה יותר ריאלי דרך פיתוח תוכנה יעילה יכולה לסמוך מושבת חיידקים ויוצרים יחידות (CFUs) לכל נקודה על מטוס צלחת אגר¹⁵. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה באמצעות אחד זן חיידקי, HL-60 תאים, המשלים ארנב התינוק פלטות אגר דם. בשיטה זו, טיפולים מרובים יכולים להיות מוערך במהירות כדי לטפל שאלות מחקר ספציפי על איך יכול להיות מאופנן התגובה החיסונית מולדת זיהום חיידקי.

Protocol

1. תרבות, בידול, ובדיקת התאים HL-60

1. להכין HL-60 תא תרבות המדיה המורכבת של 500 מ"ל RPMI עם-גלוטמין ו- 50 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום. אל תוסיף אנטיביוטיקה כמו זה משפיע על התמיינות של התאים HL-60.
2. עבור הפצת/אחזקה של תאים HL-60, פרקו תרבות 5 x 10⁶ תאים 10 מ"ל של HL-60 תא תרבות התקשורת 75 ס מ² מבחנות-CO 37 ° C ו-5%₂. מעבר תאים כל ימים 3−4 לשמור על ריכוזים תא אופטימלית.
   הערה: ריכוז תא לא יעלה על 5 x 10⁶/mL.
3. ליצור עבודה מניות של תאים HL-60 על ידי aliquoting כ עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל בתקשורת התרבות HL60 עם 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לתוך צינורות קריוגני 1 מ"ל.
   הערה: ניתן לאחסן עבודה מניות ב- 80 ° c מאסטר המניה צריך להיות מאוחסן ב-120 ° c
4. להבדיל תאים HL-60 על ידי culturing 1.5 x 10⁷ תאים ב-15 מיליליטר HL-60 תא תרבות המדיה עם 0.6% N, N-dimethylformamide (DMF)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב סטרילי הכתיר מסנן 75 ס מ² מבחנות במשך 3 ימים לפני OPKA.
5. לאמת כי התאים HL-60 יש כבר הבדיל בהצלחה, מתאימים לשימוש ב וזמינותו OPKA על-ידי בדיקת הכדאיות וסמנים תא השטח על פי זרימת הוקמה cytometry פרוטוקולים^{16,17, 18,19}. לאחר בידול, לקצור תאי HL-60, כתם כ עונה 1 פרק 10 תאים⁴ עם נוגדנים/כתמים מצומדת fluorescently CD71, CD35, annexin V של יודיד propidium.
   הערה: תאים צריך להיות % ≥55% קיימא, ≥65 CD35⁺, ו ≤20% CD71⁺ כפי שנקבע דרך נוסדה פרוטוקולי אימות¹⁴ (איור 1).

2. הכנת OPKA Buffers וראגנטים

1. הכן 50 מ של מאגר opsonization סטרילי B (OBB) על ידי ערבוב 42.5 מ ל 1 סטרילי x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca^{2 +}/Mg^{2 +}5 מ של חום-להשבית את העובר סרום שור, 2.5 מ של 0.1% ג'לטין סטרילי. חנות ב 4 º C.
2. לקבל ארנב התינוק המשלים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
3. להשיג או להכין צלחות התרבות חיידקי (קרי, צלחות אגר דם של כבשים 5%² 15 x 100 מ מ).

3. הכנת דוגמאות מלאי חיידקים

1. להשיג מלאי של strain(s) חיידקי להיבדק.
   הערה: עבור פרוטוקול זה, serotype 3 pneumoniae סטרפטוקוקוס (WU2, בנדיבות שסופקו על-ידי ד ר מון Nahm) משמש.
2. תגדל את זן חיידקי ב מרק המתאים (קרי, טוד יואיט מרק + 0.5% תמצית שמרים לנבג WU2) עבור 2−4 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: הצפיפות האופטית-600 nm (OD₆₀₀) של התרבות צריכה להיות בין 0.6 0.8.
3. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 6,000 g למשך 2 דקות, resuspend תאי 10−30 מ"ל של גליצרול 15% במרק המתאים. Aliquot התרבות חיידקי (500 µL לכל aliquot) לתוך צינורות צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
4. להפשיר בקבוקון אחד של מניות חיידקי באמבט מים 37 º C. גלולה תאי חיידקים, resuspend ב µL 500 של OBB בתנאים סטריליים.
5. להכין דילולים שונים של המניה חיידקי ב- OBB (קרי, µL 10 של לא דילול, 10 µL של 1:10, 10 µL של בטחונות, וכו '). לבצע את הבדיקה OPKA (סעיפים 4-6, כולל HL-60/המשלים תרבות משותפת) כמפורט להלן באמצעות דילולים שונים של המניה חיידקי לא מטופל. תרבות הלוחות ללון ב- 30 מעלות צלזיוס (CO₂).
   הערה: בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס הוא ספציפי WU2 למנוע יתר; אחרים זנים/אשר נגרמו מהזנים אליהם עשויה לגדול בצורה אופטימלית ב 37 º C.
6. לספור את המושבות עבור כל דילול מניות חיידקי לא מטופל תרבותי משותף עם תאים HL-60, המשלים. לקבוע אילו דילול של חיידקים התשואות המספר האופטימלי של אפשר לספור מושבות (כ CFUs 80−120 לחיידקים לא מטופל תרבותי משותף עם תאים HL-60). שימו לב זה דילול עבור OPKAs בעתיד הכרוכים במניה הזו חיידקי.

4. חיידקי טיפול ותרבות

1. הפשרת שפופרת אחת של חיידקי מניות מוכן בשלב 3.3. גלולה חיידקים (6,000 x g למשך 2 דקות), resuspend תא גלולה ב OBB-דילול אופטימלית כפי שנקבע בשלב 3.6.
2. פיפטה 10 µL של דילול חיידקי resuspended לכל טוב בצלחת תרבות תא 96-ובכן סיבוב המדרגה.
3. הוסף 20 µL של הטיפול המתאים נוגדן או סמים מכל קידוח ניסיוני ב כפילויות.
   הערה: פרוטוקול זה, נוגדנים ספציפיים serotype שנוצר בעכברים מתווסף כטיפול X, אנזים ההידרולז גליקוזיד ידוע כדי להשפיל את הקפסולה רב-סוכר 3 serotype נוסף כטיפול Y (איור 2)^4,20. לשימוש שליטה וולס, 1 x PBS או OBB, בהתאם המאגר המשמש עבור טיפול בארות.
4. לנער את הצלחת מדגם כ 90 סל ד לשעה בטמפרטורת החדר. להתאים את התנאים האלה תלוי טמפרטורה אופטימלית או תנאים חזק של טיפולים נבדק.

5. HL-60 התרבות חיידקי שיתוף

1. להכין HL-60 תאים בבציר התאים HL-60 הבדיל מטופלים עם DMF לפני שלושה ימים (ראה שלב 1.4) לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל. גלולה התאים (x 500 g, 3 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף עם פחות 10 מ"ל של PBS 1 x.
2. גלולה התאים שטף (x 500 g, 3 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי OBB (להתחיל עם 1 מ"ל OBB ולהתאים עבור ריכוז הסופי של /mL עונה 1 פרק 10⁷לאחר ספירת תאים).
3. להוסיף המשלים ארנב התינוק (סרום ארנב התינוק סטרילי, לא מדולל, גיל 3−4 שבועות) בכל אמצעי אחסון הסופי של 1:5.
   הערה: הריכוז הסופי של התערובת HL-60-המשלים צריך להיות /mL⁷עונה 1 פרק 10. אם בדיקת תלות המשלים, פתרון השני המכיל תאים פעילים HL-60 עם המשלים להשבית חום יכול לשמש (המשלים עלולה להיות מומת על ידי המקננת באמבט מים-> 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות).
4. לאחר התרבות חיידקי 1 h מלאה (שלב 4.4), לחלק כל דגימה (קרי, 10 µL של כל מדגם µL 30 גם לתוך שתי בארות חדשות) וולס כפולים עבור שתי קבוצות (קרי, שימוש רק 20 µL של התרבות המקורית של שיתוף 30 µL עבור שגיאה pipetting) : קבוצה אחת יהיה תרבותי משותף עם HL-60-המשלים, אחד יכלול חיידקים בלבד. להוסיף 50 µL של תערובת HL-60-המשלים (מתוך שלב 5.3) לכל קבוצה ניסיונית של וולס (משניות + HL-60); להוסיף 50 µL של OBB לבד הבארות של חיידקים בלבד (משניות -HL-60).
   הערה: עבור דוגמה זו, כ- 800 חיידקי CFUs משמשים עבור התרבות שיתוף הראשונית עם 5 x 10⁵/50 µL HL-60 תאים. אם זה ריבוי של זיהום גבוה מדי או נמוך מדי כמצוין על-ידי מספרים המושבה הסופי, להתאים דילול חיידקי ראשוני לעומת ספירת HL-60.
5. לנער את הצלחת 96-ובכן ב 37 ° C עבור h 1 (CO₂).

6. לטעום יופיצ, דגירה לילה

1. לדלל כל טוב 1:5 עם OBB, כך כל מדגם יש נפח של פחות 50 µL.
2. פיפטה 50 µL של כל מדגם ישירות על גבי אזור ייעודי של צלחת התרבות חיידקי, הבטחת ריווח מתאים בין הדגימות. עבור 15 x 100 מ מ עגול² פלטות אגר, pipet כ 4 דוגמאות על גבי לוח אחד.
3. לכסות ולאפשר דגימות לייבוש למשך כ 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. היפוך צלחות ותרבות בין לילה ב 30 מעלות צלזיוס (CO₂). לחלופין, תרבות צלחות בצנצנות אנאירובית כדי לבדוק אם תנאי אנאוקסיים משפיעים על התפתחות חיידקים או לפקד על מורפולוגיה.
5. לאחר לילה תרבות, לספור את המושבות בכל אזור מדגם המיועד. ניתוח נתונים באמצעות השוואת מספר תאים חיים מתוך כל ערכה המתאימה שליטה ו/או מדגמים שאינם מקבלים HL-60 תא תרבות משותפת (מצביע על הישרדות cell 100%, 0% תא הרג).

תוצאות

אימות של בידול HL-60 יש לבצעו לפני שמתחילים את OPKA. זה יכול להתבצע באמצעות cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי חוץ-תאי של CD11b, CD35, CD71, annexin V (איור 1). יודיד Propidium יכול גם לשמש כסמן הכדאיות. לאחר מטופל עם DMF במשך 3 ימים, צריך להיות מוגברת הביטוי של CD35 (≥55% של כל התאים), ביטוי של CD71 צריך להיות י...

Discussion

OPKAs מגישים תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות מתווכת נוגדן המושרה על ידי חיסונים^6,8. המשמעות העיקרית של OPKA פשוטה זו היא הסתגלות, בתנאים להיבדק (קרי, נוגדנים, אנזימים טיפולים, וכו '.). במובן זה, בעוד assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את התרומה של opsonins (קרי, נוגדנים) phag...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV