Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

Resumo

Este ensaio de matança de opsonophagocytic é usado para comparar a capacidade de células fagocíticas de imunes a responder e matar as bactérias com base em diferentes tratamentos e/ou condições. Classicamente, este ensaio serve como o padrão ouro para avaliar funções efetoras dos anticorpos produzidos contra uma bactéria como opsoninas.

Resumo

Um aspecto fundamental da resposta imune a colonização bacteriana do host é fagocitose. Um ensaio de matança de opsonophagocytic (OPKA) é um procedimento experimental em que células fagocíticas são co cultivadas com unidades bacterianas. As células do sistema imunológico irão fagocitar e matar as culturas bacterianas de forma dependente de complemento. A eficiência da matança imune mediada por células é dependente de uma série de fatores e pode ser usada para determinar bacteriano como diferente culturas comparam no que diz respeito a resistência à morte celular. Desta forma, a eficácia da terapêutica potencial imunológico-baseado pode ser avaliada contra estirpes de bactérias específicas e/ou serótipos. Neste protocolo, descrevemos um OPKA simplificado que utiliza condições de cultura de base e célula contando determinar a viabilidade celular bacteriana após co-cultura com condições de tratamento e HL-60 células do sistema imunológico. Este método tem sido utilizado com sucesso com um número de diferentes sorotipos de pneumococo, capsulares e estirpes de acapsular e outras espécies bacterianas. As vantagens deste protocolo OPKA são sua simplicidade, versatilidade (como este ensaio não é limitado aos tratamentos de anticorpo como opsoninas) e a minimização do tempo e reagentes para avaliar grupos experimentais básicos.

Introdução

O opsonophagocytic matar o ensaio (OPKA) é uma ferramenta fundamental para vinculação de alterações na estrutura bacteriana ou função alterações posteriores na resposta imune e na função. Como tal, é frequentemente usado como um ensaio complementar para determinar baseados em imune a eficácia de tratamentos anticorpo candidatos vacinais, otimização de enzimas, etc. Enquanto os ensaios in vivo são necessários para determinar o espaço livre efetivo ou proteção em um modelo de infecção bacteriana, o OPKA pode ser usado para avaliar a contribuição imune à morte da célula bacteriana componentes mais básicos: bactérias, células do sistema imunológico e experimental tratamentos. Estudos anteriores mostraram que os OPKAs podem ser modificados e utilizados para uma variedade de bactérias e sorotipos, incluindo Streptococcus pneumoniae¹, Staphylococcus aureus², Pseudomonas aeruginosa³. Além disso, estes ensaios otimizados podem ser usados para avaliar diferentes tratamentos experimentais, incluindo a capacidade de uma enzima para tornar a bactéria mais acessíveis aos tratamentos⁴ e anticorpo de células do sistema imune mediada por complemento para melhorar opsonização⁵. Classicamente, ensaio OPKA tem sido utilizado com sucesso na investigação básica e clínica configurações como um indicador poderoso para proteção induzida por anticorpos específicos do patógeno^6,7,8,9 .

Diferentes tipos de células do sistema imunológico podem ser utilizados para avaliação de matar opsonophagocytic. Uma população fagocítica comumente usada é a linha de células leucêmicas humanas HL-60. Esta linha de celular pode ser mantida como promielócitos inactivados em cultura; no entanto, eles podem ser diferenciados em vários Estados ativados via drogas diferentes tratamentos^10,11. Tratamento de HL60 com N, N-dimetilformamida diferencia a linha celular em neutrófilos ativados com forte atividade fagocítica¹¹. Enquanto as células HL-60 foram otimizadas e são frequentemente utilizadas para estes ensaios de fagocitose¹⁰, outros leucócitos polimorfonucleares primários podem ser usados como o braço imune do experimento¹².

Além disso, estes ensaios podem ser simplificados¹³ ou multiplexagem¹⁴ olhar para várias estirpes resistentes aos antibióticos das bactérias a ser testado. O método multiplexado tornou-se mais viável através do desenvolvimento de software que pode eficientemente contar bactérias formadoras de unidades (CFUs) por ponto sobre uma placa de ágar¹⁵. Aqui, descrevemos um método simplificado usando uma estirpe bacteriana, células HL-60, complemento de coelho bebê e placas de ágar sangue. Com este método, vários tratamentos podem ser avaliados rapidamente, para abordar questões específicas de investigação sobre como a resposta imune inata a infecção bacteriana pode ser modulada.

Protocolo

1. cultura, diferenciação e validação de células HL-60

1. Prepare meios de cultura celular HL-60, composto de 500 mL RPMI com L-glutamina e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino. Não adicione antibióticos como isso pode afetar a diferenciação das células HL-60.
2. Para propagação/manutenção de células HL-60,⁶ células de cultura 5 x 10 em 10 mL de meios de cultura de células HL-60 em 75 cm² exalados frascos em 37 ° C e 5% de CO₂. Passagem células todos os dias 3−4 para manter as concentrações de célula ideal.
   Nota: A concentração de célula não deve exceder 5 x 10⁶/mL.
3. Gere ações de trabalho de células HL-60 por alíquotas aproximadamente 1 x 10⁶ células/mL em meios de cultura HL60 com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) para tubos criogênicos de 1 mL.
   Nota: Estoques de trabalho podem ser armazenados a-80 ° C. O estoque de mestre deve ser armazenado a-120 ° C.
4. Diferencie células HL-60 pelo cultivo de 1,5 x 10⁷ células em 15 mL de meios de cultura de células HL-60 com 0,6% N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C e 5% CO₂ em frascos de² estéril 75cm filtro tampado por 3 dias antes da OPKA.
5. Validar que as células HL-60 tem sido diferenciadas com êxito e são apropriadas para uso no ensaio de OPKA através do teste de viabilidade e marcadores de superfície celular de acordo com o estabelecido fluxo cytometry protocolos^{16,17, 18,19}. Após a diferenciação, colher células HL-60 e mancha de aproximadamente 1 x 10⁴ células com anticorpos conjugados a fluorescente/manchas para CD71, CD35, anexina V e iodeto de propidium.
   Nota: Células diferenciadas devem ser ≥55 viável, ≥65% % CD35⁺e ≤20% CD71⁺ , conforme determinado pela estabeleceu protocolos de validação¹⁴ (Figura 1).

2. preparação de reagentes e Buffers OPKA

1. Prepare 50 mL de tampão estéril opsonização B (OBB) misturando 42,5 mL de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS) com Ca^{2 +}/ mg^{2 +}, 5 mL de soro bovino fetal inactivadas pelo calor e 2,5 mL de 0.1% gelatina estéril. Loja a 4 ° C.
2. Obter coelho bebê complemento e armazenar a-80 ° C.
3. Obter ou preparar pratos de cultura bacteriana (ou seja, placas de ágar sangue de 15 x 100 mm² 5% ovelha).

3. preparação de amostras bacterianas de estoque

1. Obter um estoque de uma estirpe bacteriana a ser testado.
   Nota: Para este protocolo, sorotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornecidos pelo Dr. Moon Nahm) é usado.
2. Crescer a estirpe bacteriana em um caldo apropriado (ou seja, caldo Todd-Hewitt + extrato de levedura 0,5% para esta estirpe WU2) para aproximadamente 2−4 h a 37 ° C.
   Nota: A densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) da cultura deve estar entre 0,6 e 0,8.
3. As bactérias de pelotas por centrifugação a 6.000 x g por 2 min e ressuspender as células em 10−30 mL de glicerol de 15% do caldo apropriado. Alíquota a cultura bacteriana (500 µ l por alíquota) em tubos de centrífuga estéril 1,5 mL e loja a-80 ° C.
4. Descongele um frasco de estoque bacteriana em banho maria a 37 ° C. As células bacterianas de pelotas e Resuspenda em 500 µ l de OBB sob condições estéreis.
5. Prepare diluições diferentes das ações bacterianas no OBB (i.e., 10 µ l da diluição não, 10 µ l de 01:10, 10 µ l de 1: 100, etc.). Realize o ensaio OPKA (seções 4-6, incluindo co-cultura HL-60/complemento) conforme descrito abaixo, utilizando várias diluições do estoque bacteriana não tratada. Cultura as placas durante a noite a 30 ° C (não CO₂).
   Nota: A temperatura de 30 ° C é específica para WU2 prevenir o crescimento excessivo; outros cepas/serótipos podem crescer otimamente a 37 ° C.
6. Conte as colônias para cada diluição do estoque de bacteriana não tratada co cultivada com complemento e células HL-60. Determine qual diluição de bactérias produz o número ideal de colônias contáveis (aproximadamente 80−120 CFUs por bactérias não tratadas co cultivadas com células HL-60). Observe esta diluição para OPKAs futuras envolvendo este estoque bacteriana.

4. cultura e tratamento bacteriano

1. Descongele um tubo de estoque bacteriana preparado no passo 3.3. Bactérias (6.000 x g por 2 min) de pelotas e resuspenda o pellet celular em OBB a diluição ideal conforme determinado na etapa 3.6.
2. Pipete 10 µ l da diluição bacteriana ressuspensa por alvéolo em uma placa de cultura de células 96 poços de fundo redondo.
3. Adicione 20 µ l de tratamento adequado de anticorpos ou drogas a cada poço experimental em duplicado.
   Nota: Neste protocolo, um anticorpo sorotipo específico gerado em camundongos é adicionado como tratamento X e uma enzima de glicosídeo hidrolase conhecida para degradar a cápsula de polissacarídeo 3 sorotipo é adicionada como tratamento de^4,Y (Figura 2)²⁰. Para poços de controle, use 1X PBS ou OBB, dependendo o buffer usado para poços de tratamento.
4. Agite a placa de amostra em cerca de 90 rpm por 1h à temperatura ambiente. Ajuste a estas condições, dependendo da temperatura ideal ou agitação condições dos tratamentos sendo testados.

5. HL-60 cultura bacteriana de co

1. Prepare células HL-60 por colheita de células HL-60 diferenciados que são tratadas com DMF três dias antes (consulte a etapa 1.4) para tubos cônico de 15 mL. As células (500 x g, 3 min) de Pelotas, desprezar o sobrenadante e lavar pelo menos 10 mL de 1X PBS.
2. As células lavadas (500 x g, 3 min) de Pelotas, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em OBB (começa com 1 mL OBB e ajustar para uma concentração final de 1 x 10⁷/mL após a contagem de células).
3. Adicione complemento de coelho bebê (soro de coelho bebê estéril, não diluído, semanas de idade 3−4) em um volume final de 1:5.
   Nota: A concentração final da mistura HL-60-complemento deve ser 1 x 10⁷/mL. Se o teste de complemento de dependência, uma segunda solução contendo células HL-60 ativas com complemento inactivadas pelo calor pode ser utilizada (complemento pode ser inactivado por incubar em banho-maria em > 55 ° C, durante pelo menos 30 min).
4. Após cultura bacteriana de 1h é completo (passo 4.4), divida cada amostra (ou seja, 10 µ l de cada 30 µ l da amostra em dois novos poços) em poços de duplicados para os dois grupos (ou seja, uso somente 20 µ l de cultura co original de 30 µ l a conta para pipetagem erro) : um conjunto será co cultivado com HL-60-complemento e um incluirá apenas bactérias. Adicionar 50 µ l da mistura HL-60-complemento (da etapa 5.3) para cada conjunto experimental de poços (delegada + HL-60); Adicione 50 µ l de OBB sozinho aos poços de bactérias única (delegada -HL-60).
   Nota: Para este exemplo, aproximadamente 800 CFUs bacterianas são usados para a inicial co-cultura com células de HL-60 5 x 10⁵50 µ l. Se essa multiplicidade de infecção é muito alta ou muito baixa, como indicado pelos números do final da colônia, ajuste a diluição inicial bacteriana em oposição a contagem de células HL-60.
5. Agite a placa de 96 poços a 37 ° C por 1 h (não CO₂).

6. amostra chapeamento e incubação durante a noite

1. Dilua cada poço 1:5 com OBB, para que cada amostra possui um volume de pelo menos 50 µ l.
2. Pipete 50 µ l de cada amostra diretamente sobre uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo o espaçamento adequado entre as amostras. Para 15 x 100 mm² rodada placas de ágar, amostras de pipeta aproximadamente 4 em um prato.
3. Cobrir e deixar amostras secar por aproximadamente 15 min à temperatura ambiente.
4. Inverta as placas e cultura durante a noite a 30 ° C (não CO₂). Alternativamente, placas em frascos anaeróbios para testar se anóxica condições afetam o crescimento bacteriano ou de controle para a morfologia da cultura.
5. Depois da cultura durante a noite, conte as colônias em cada área de amostra designado. Analisar dados, comparando o número de células vivas em cada conjunto para o controle correspondente e/ou amostras que não recebem co-cultura de células HL-60 (indicativo de sobrevivência da pilha de 100%, 0% célula matar).

Resultados

Validação de HL-60 diferenciação deve ser executada antes de iniciar o OPKA. Isso pode ser feito usando citometria de fluxo para determinar a expressão extracelular de CD11b, CD35, CD71 e anexina V (Figura 1). Iodeto de propidium também pode ser usado como um marcador da viabilidade. Após o tratamento com DMF durante 3 dias, a expressão de CD35 deve ser aumentada (≥55% de todas as células) e expressão de CD71 deve ser diminuída (≤20% de todas as células). Deve ser a porcentag...

Discussão

OPKAs servir papéis essenciais na avaliação de respostas imunes de anticorpo mediada induzidas pela vacinação^6,8. O principal significado deste OPKA simplificado é a capacidade de adaptação nas condições a serem testadas (ou seja, anticorpos, enzimas tratamentos, etc.). Neste sentido, este ensaio pode ser usado para testar a contribuição de opsoninas (ou seja, anticorpos) na fagocitose, mas pode também ser usado para avaliar maneiras de superar os fa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV