Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

요약

이 opsonophagocytic 죽이 분석 결과 응답 하 고 다른 치료 조건에 기반 하는 박테리아를 죽 일 phagocytic 면역 세포의 기능을 비교 하는 데 사용 됩니다. 고아 하 게,이 분석 결과 opsonin로 박테리아에 대하여 제기 하는 항 체의 효과 기 기능을 평가 하기 위한 황금 표준 역할을 합니다.

초록

호스트의 세균성 식민지에 면역 반응의 중요 한 부분은 이다 식 균 작용. Opsonophagocytic 살해 분석 결과 (OPKA) phagocytic 세포는 세균 대 공동 교양 있는 실험적인 절차 이다.입니다. 면역 세포 phagocytose 하 고 보완 종속 방식에서 세균성 문화를 죽 일 것 이다. 중재 하는 면역 세포 살해의 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다 효율과 어떻게 다른 박테리아를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다 세포 죽음에 관하여 문화 비교. 이 방법에서는, 특정 세균성 긴장 또는 serotypes에 대 한 잠재적인 면역 기반 치료제의 효능을 평가 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 문화 조건 및 셀 세 치료 조건 및 HL-60 면역 세포 공동 문화 후 세균 세포 생존 능력을 결정 하는 단순화 된 OPKA를 설명 합니다. 이 메서드는 다른 폐 렴 serotypes, capsular와 acapsular 긴장, 및 다른 세균 종 수와 성공적으로 이용 되어. 이 OPKA 프로토콜의 이점은 그것의 간명, 다양성 (로이 분석 결과 opsonins로 항 체 치료에 국한 되지 않습니다), 그리고 시간과 기본 실험 그룹을 평가 하기 위해 시 약의 최소화.

서문

Opsonophagocytic 분석 결과 (OPKA)를 죽이 세균성 구조 또는 기능 변경 이후의 변화 면역 반응 및 기능에 연결 하기 위한 중요 한 도구입니다. 이와 같이, 그것 자주 면역 기반 항 체 치료, 백신 후보자, 효소 최적화 등의 효능을 결정 하기 위해 분석 결과 보완으로 사용 됩니다. Vivo에서 분석 실험 공간이 세균 감염 모델에 보호를 결정 하는 데 필요한 반면는 OPKA 평가 세균성 세포 죽음에 면역 기여 가장 기본적인 구성 요소를 사용할 수 있습니다: 박테리아, 면역 세포, 및 실험 치료입니다. 이전 연구는 OPKAs 수정 하 고 다양 한 박테리아와 serotypes, 연쇄 상 구 균 균¹,² 포도 상 구 균, 녹 농 균³를 포함 하 여 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 또한, 이러한 최적화 된 분석 실험 박테리아를 더 개선 보완-중재 면역 세포⁴ 및 항 체 치료에 액세스할 수 있도록 하는 효소의 기능을 포함 하 여 다른 실험적 치료를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. opsonization⁵. 고전적인, OPKA 분석 결과 성공적으로 사용 되었다 기초 및 임상 연구에서 병원 체 특정 항 체^{6,,78,9에 의해 유도 된 보호에 대 한 강력한 표시기로 설정} .

Opsonophagocytic 살해의 평가 대 한 면역 세포의 다른 종류를 사용할 수 있습니다. 1 일반적으로 사용 되 phagocytic 인구는 HL-60 인간 leukemic 세포 라인. 이 셀 라인 배양에서 사 promyelocytes로 유지 될 수 있다 그러나, 그들은 다른 약물 치료^10,11을 통해 다양 한 활성화 상태에 분화 될 수 있다. HL60 n의 처리, N dimethylformamide 강한 phagocytic 활동¹¹활성화 된 호 중구에 셀 라인을 차별화합니다. HL-60 셀 최적화 되어¹⁰이 먹어서 분석 실험 위해 자주 사용 하는 동안 다른 기본 polymorphonuclear 백혈구 면역 실험¹²팔으로 사용할 수 있습니다.

또한, 이러한 분석 실험 또는 단순화 된¹³ 수 다중화¹⁴ 테스트할 박테리아의 여러 항생제 내성 변종에 보고. 멀티플렉스 메서드는 더 효율적으로 한 접시¹⁵자리 당 단위 (CFUs)를 형성 하는 세균성 식민지를 셀 수 있는 소프트웨어의 개발을 통해 실현 하였습니다. 여기, 하나의 세균, HL-60 셀, 아기 토끼 보완, 긴장과 혈액 한 천 배지를 사용 하 여 효율적인된 방안을 설명 합니다. 이 방법으로 여러 치료 세균성 감염에 타고 난 면역 반응 수 변조 하는 방법에 대 한 특정 연구 질문을 해결 하기 위해 신속 하 게 평가 될 수 있다.

프로토콜

1. 문화, 차별화, 및 HL-60 셀의 유효성 검사

1. 500 mL와 L-글루타민 및 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 RPMI의 HL-60 세포 배양을 준비 합니다. HL-60 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있습니다이 항생제를 추가 하지 마십시오.
2. 전파/HL-60 세포의 유지 보수에 대 한 문화 5 x 10⁶ 셀 75 cm² HL-60 세포 배양의 10 mL에 37 ° C, 5% CO₂플라스 크 통풍. 최적의 세포 농도 유지 하기 위해 셀 3−4 일 마다 통로.
   참고: 세포 농도 5 x 10⁶/mL을 넘지 말아야 한다.
3. 1 mL 극저온 튜브 aliquoting 약 1 x 10⁶ 셀/mL 10% 디 메 틸 ⁚ (DMSO)와 HL60 배양에 의해 HL-60 셀의 일 주식을 생성 합니다.
   참고: 작업 주식-80 ° c.에 저장 될 수 있습니다. 마스터 주식-120 ° c.에 저장 한다
4. OPKA 이전 3 일 동안 살 균 필터 출장 75 c m² 플라스 크에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 자란 1.5 0.6 %N, N-dimethylformamide (DMF) HL-60 세포 배양의 15 ml에서 10⁷ 셀 x 여 HL-60 세포 분화.
5. HL-60 셀 성공적으로 분화는 OPKA 분석 결과에 사용할 적절 한 생존 및 설립된 흐름 cytometry 프로토콜^{16,17에 따르면 세포 표면 마커를 테스트 하 여 확인 18,19}. 차별화, 후 HL-60 세포를 수확 하 고 CD71, CD35, annexin V, 및 propidium 요오드 화물에 대 한 약 1 × 10⁴ 셀 붙일 활용 된 항 체/얼룩 얼룩.
   참고: 차별화 된 셀 ≥65% 가능한, ≥55 %CD35 이어야 한다⁺, 및 ≤20 %CD71⁺ 통해 결정으로 설립 유효성 검사 프로토콜¹⁴ (그림 1).

2입니다. OPKA 버퍼 및 시 약의 준비

1. 살 균 젤라틴와 Ca^{2 +}/Mg^{2 +}, 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청의 5 mL 2.5 mL 0.1%의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1의 42.5 mL를 혼합 하 여 살 균 opsonization 버퍼 B (OBB) 50 mL를 준비 합니다. 4 ° c.에 게
2. 아기 토끼를 보완 가져오고-80 ° c.에 저장
3. 얻거나 세균성 문화 접시 (즉, 15 x 100 m m² 5% 양 혈액 한 천 배지)을 준비.

3입니다. 세균 재고 샘플의 준비

1. 시험 될 세균성 strain(s)의 재고를 얻을.
   참고: 이 프로토콜, serotype 3 구 균 (WU2, 박사 문 남 아낌없이 제공) 사용 됩니다에 대 한.
2. 약 2−4 h 37 ° c.에 대 한 적절 한 국물 (즉, 토 드-휴이 트 국물 + 0.5% 효 모 추출 물이 WU2 긴장에 대 한)에서 세균성 긴장을 성장
   참고: 광학 밀도 600 nm (OD₆₀₀) 문화의 0.6과 0.8 사이 여야 합니다.
3. 2 분 동안 6000 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은 하 고 적절 한 국물에 15% 글리세롤의 10−30 ml에서 셀 resuspend. 약 수 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브와-80 ° c.에 게 세균성 문화 (약 수 당 500 µ L)
4. 37 ° C 물 욕조에 세균 주식의 한 유리병 밖으로 해 동. 세균성 세포를 작은 하 고 메 마른 조건 하에서 OBB의 500 µ L에서 resuspend.
5. OBB (즉, 아무 희석의 10 µ L, 1시 10분의 10 µ L, 10 µ L 1: 100, 등등)에서 세균의 다른 희석을 준비 합니다. 치료 되지 않는 세균의 다양 한 희석을 사용 하 여 아래 설명 된 대로 OPKA 분석 결과 (섹션 4-6, 포함 HL-60/보완 공동 문화)를 수행 합니다. 30 ° C (아무 CO₂)에서 하룻밤 격판덮개 문화.
   참고: 온도 30 ° C는 자라 난;을 방지 하기 위해 WU2에 대 한 특정 다른 변종/serotypes 37 ° c.에서 최적의 성장 수 있습니다.
6. 치료 세균성 주식 HL-60 세포와 보완 공동 경작의 각 희석에 대 한 식민지를 계산 합니다. 박테리아의 어떤 희석 생성 수 식민지 (약 치료 박테리아 공동 HL-60 세포 배양에 대 한 80−120 CFUs)의 최적의 수를 결정 합니다. 이 희석이 세균성 주식을 포함 하는 미래 OPKAs에 대 한 note

4. 세균 치료 및 문화

1. 세균성 주식 단계 3.3에서에서 준비의 1 개의 관 동 펠 릿 박테리아 (6000 x g 2 분)과 최적의 희석 단계 3.6에서에서 결정에 셀 펠 릿 OBB에서 resuspend.
2. 라운드-하단 96 잘 셀 문화 접시에 잘 당 resuspended 세균 희석의 10 µ L 플라스틱
3. 중복에서 각 실험 잘에 적절 한 항 체 또는 약물 치료의 20 µ L를 추가 합니다.
   참고: 이 프로토콜에서 쥐에서 생성 serotype 특정 항 체 치료 X로 추가 됩니다 고 serotype 3 다 당 류 캡슐을 저하 알려진 glycoside 가수분해 효소 효소 치료로 Y (그림 2)^4,20추가 됩니다. 제어 웰 스에 대 한 치료 우물 사용 되는 버퍼에 따라 PBS 또는 OBB, x 1을 사용 합니다.
4. 실 온에서 1 시간에 약 90 rpm에서 샘플 접시를 흔들어. 이러한 조건에 따라 최적의 온도 또는 테스트 되 고 치료의 동요 상태를 조정 합니다.

5. HL-60 세균성 공동 문화

1. HL-60 세포와 함께 처리 됩니다 DMF 3 일 이전 (단계 1.4 참조) 15 mL 원뿔 튜브에 HL-60 분화 세포를 수확 하 여 준비 합니다. 작은 셀 (500 x g, 3 분), 상쾌한, 삭제 및 1 x PBS의 적어도 10 mL로 씻어.
2. 씻어 셀 (500 x g, 3 분) 펠 렛, 상쾌한, 폐기 및 OBB 셀 resuspend (1 mL OBB와 함께 시작 하 고 셀 계산 후 1 x 10⁷/mL의 최종 농도 대 한 조정).
3. 1:5 마지막 볼륨에 아기 토끼 보완 (살 균, undiluted 아기 토끼 혈 청, 나이 3−4 주)를 추가 합니다.
   참고: HL-60-보완 혼합물의 최종 농도 1 x 10⁷/mL 이어야 한다. 경우 보완 종속성 테스트, 열 비활성화 보완 활성 HL-60 셀을 포함 하는 두 번째 솔루션을 사용할 수 있습니다 (보완에 물 욕조에 배양 하 여 비활성화 될 수 있습니다 > 적어도 30 분 동안 55 ° C).
4. 1 h 세균성 문화 완료 (4.4 단계) 인 후에, 분할 각 샘플 (즉, 10 µ L의 두 개의 새로운 우물에 각 30 µ L 샘플) 두 그룹 (즉, 사용 20 µ L pipetting 오류에 대 한 계정이 원래 30 µ L 공동 문화)에 대 한 중복 웰 스 : 한 세트 HL-60-보완 공동 경작 되며 하나 박테리아만 포함 됩니다. 50 µ L을 우물의 각 실험 세트 (단계 5.3)에서 HL-60-보완 혼합물의 추가 (위임 + HL-60); 박테리아만 (위임된-HL-60)의 우물에 혼자 OBB의 50 µ L를 추가 합니다.
   참고: 이 예제에서는 약 800 세균 CFUs 5 x 10⁵/50 µ L HL-60 셀 초기 공동 문화에 사용 됩니다. 감염의이 다양성은 너무 높거나 너무 낮은 최종 식민지 숫자에 표시 된 대로, HL-60 세포 수 반대로 초기 세균 희석을 조정 합니다.
5. 1 h (아무 CO₂) 37 ° C에서 96 잘 접시를 흔들어.

6. 샘플 도금 및 야간 보육

1. 각 샘플에 적어도 50 µ L의 볼륨, OBB와 1:5 각 잘 희석.
2. 50 µ L 세균성 문화 접시, 샘플 사이의 적절 한 간격이 확보의 지정 된 영역에 직접 각 샘플의 플라스틱 15 x 100 m m² 에 대 한 한 접시, 한 접시에 피펫으로 약 4 샘플 라운드.
3. 커버 하 고 샘플을 실 온에서 약 15 분 동안 건조를 허용 합니다.
4. 반전 접시와 문화 30 ° C (아무 CO₂)에서 하룻밤. 또는, 접시 형태에 대 한 제어 또는 무산 소 조건 세균성 성장 영향을 주는지 여부를 테스트 하는 혐 기성 항아리에 문화.
5. 야간 문화, 후 각 지정 된 샘플 지역에 식민지를 계산 합니다. 해당 컨트롤 및 HL-60 셀 공동 문화에 영향을 받지 않는 샘플 각 세트에서 라이브 셀의 수를 비교 하 여 데이터를 분석 (100% 세포 생존, 0%의 지표 세포 살해).

결과

HL-60 차별화의 유효성 검사는 OPKA를 시작 하기 전에 수행 되어야 합니다. 이 CD11b, CD35, CD71, 및 annexin V (그림 1)의 세포 외 식을 결정 하려면 cytometry 사용 하 여 수행할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물은 또한 생존의 표식으로 사용할 수 있습니다. 치료를 받고 이후 DMF와 3 일, CD35의 식을 증가 한다 (모든 셀의 ≥55%) CD71의 표현을 감소 한다 (모든 셀의 ≤20%). Annexin V +와 함께 propi...

토론

OPKAs 예방 접종^6,8에 의해 유도 된 항 체 중재 면역 반응 평가에 필수적인 역할을 제공 합니다. 이 단순화 된 OPKA의 주요 중요성은 테스트할 조건에 (즉, 항 체, 효소 치료, 등.). 이런이 의미에서이 분석 결과에 먹어서, opsonins (즉, 항 체)의 기여를 테스트를 사용할 수 있는 동안 그것은 또한 사용할 수 있습니다 일반적으로 phagocytic 경로 억제 하는 독성 요소...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV