Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

Résumé

Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.

Résumé

Un aspect clé de la réponse immunitaire à une colonisation bactérienne de l’hôte est la phagocytose. Un test de mise à mort d’opsonophagocytic (OPKA) est une procédure expérimentale dans laquelle les cellules phagocytaires sont conjointement cultivés avec unités bactériennes. Les cellules immunitaires vont phagocyter et tuer les cultures bactériennes d’une manière dépendante du complément. L’efficacité de l’assassinat de cellule immunitaire dépend de plusieurs facteurs et peut être utilisée pour déterminer comment les différentes bactéries comparer les cultures en ce qui concerne la résistance à la mort cellulaire. De cette façon, l’efficacité du potentiel immunitaire base thérapeutique peut être évaluée contre les souches bactériennes spécifiques et/ou des sérotypes. Dans ce protocole, nous décrivons une OPKA simplifiée qui utilise des conditions de culture de base et de la cellule de comptage pour déterminer la viabilité cellulaire bactérienne après co-culture avec des conditions de traitement et HL-60 cellules immunitaires. Cette méthode a été utilisée avec succès avec un certain nombre de différents sérotypes pneumococciques, capsulaires et capsulée souches et d’autres espèces bactériennes. Les avantages du présent protocole OPKA sont sa simplicité, polyvalence (comme ce test n’est pas limité aux traitements d’anticorps comme opsonines) et la minimisation du temps et de réactifs pour évaluer les groupes expérimentaux de base.

Introduction

L’opsonophagocytic tuant assay (OPKA) est un outil essentiel permettant de relier des altérations de la structure bactérienne ou une fonction aux modifications ultérieures dans la réponse immunitaire et la fonction. À ce titre, il sert souvent une analyse complémentaire afin de déterminer l’efficacité immunitaire basé sur des traitements d’anticorps, vaccins expérimentaux, optimisation de l’enzyme, etc.. Alors que les essais in vivo sont nécessaires pour déterminer la clairance apparente ou protection dans un modèle d’infection bactérienne, le OPKA peut être utilisé pour évaluer la contribution immunisée à la mort de la cellule bactérienne composants à la base : les bactéries, les cellules immunitaires et expérimentale traitements. Des études antérieures ont montré que OPKAs peuvent être modifiées et utilisés pour une variété de bactéries et sérotypes, dont Streptococcus pneumoniae¹, Staphylococcus aureus,²,³de la Pseudomonas aeruginosa. En outre, ces dosages optimisés peuvent servir à évaluer différents traitements expérimentaux, y compris la capacité d’une enzyme pour faciliter l’accès aux cellules immunitaires médiée par le complément⁴ anticorps traitements et pour améliorer la bactérie opsonisation⁵. Classiquement, le dosage OPKA a été utilisée avec succès dans la recherche fondamentale et clinique paramètres comme un puissant indicateur de protection induite par des anticorps spécifiques^6,7,8,9 .

Différents types de cellules immunitaires peuvent servir pour l’évaluation de l’assassinat d’opsonophagocytic. Une population phagocytaire couramment utilisée est la ligne de cellules leucémiques humaines HL-60. Cette lignée cellulaire peut être gardée comme promyélocytes inactivé en culture ; Toutefois, ils peuvent être différenciés dans divers États activés par l’intermédiaire de différents médicaments traitements^10,11. Traitement des HL60 avec N, N-diméthylformamide différencie de la lignée cellulaire en neutrophiles activés avec forte activité phagocytaire¹¹. Tandis que les cellules HL-60 ont été optimisés et sont fréquemment utilisés pour ces essais de phagocytose¹⁰, autres leucocytes polymorphonucléaires primaires peuvent être utilisés comme le bras immunitaire de l' expérience¹².

En outre, ces tests peuvent être simplifiées¹³ ou multiplexés¹⁴ à regarder de nombreuses souches résistantes aux antibiotiques des bactéries à tester. La méthode multiplexée ont été réalisée en plus faisable grâce à l’élaboration d’un logiciel qui peut compter efficacement la colonie bactérienne formant des unités (UFC) par endroit sur une plaque de gélose¹⁵. Nous décrivons ici une méthode simplifiée utilisant une souche bactérienne, les cellules HL-60, complément de bébé lapin et géloses au sang. Avec cette méthode, plusieurs traitements peuvent être évalués rapidement pour répondre à des questions de recherche spécifiques sur la façon dont la réponse immunitaire innée à l’infection bactérienne peut être modulée.

Protocole

1. culture, différenciation et la Validation des cellules HL-60

1. Préparation des milieux de culture de cellules HL-60 composée de 500 mL RPMI avec la L-glutamine et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal. N’ajoutez pas d’antibiotiques car cela peut affecter la différenciation des cellules HL-60.
2. Pour propagation/maintenance des cellules HL-60, la culture 5 x 10⁶ cellules dans 10 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 à 75 cm² ventilés flacons à 37 ° C et 5 % de CO₂. Le passage des cellules tous les jours 3−4 pour maintenir la concentration cellulaire optimal.
   Remarque : La concentration cellulaire ne devrait pas dépasser 5 x 106/ml.
3. Produire des stocks de travail des cellules HL-60 par aliquotage environ 1 x 10⁶ cellules/mL dans les milieux de culture HL60 avec 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) dans des tubes cryogéniques de 1 mL.
   Remarque : Les stocks de travail peuvent être conservés à-80 ° C. Le stock principal doit être conservé à-120 ° C.
4. Différencier les cellules HL-60 par culture 1,5 x 10⁷ cellules dans 15 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 avec 0,6 % N, N-diméthylformamide (DMF) à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans des flacons stériles diablotin filtre 75 cm² pendant 3 jours avant OPKA.
5. Valider que les cellules HL-60 ont été différenciés avec succès et sont appropriés pour une utilisation dans l’essai OPKA par des tests de viabilité et marqueurs de surface cellulaire selon débit établi cytometry protocoles^{16,17, 18,19}. Après différenciation, récolter les cellules HL-60 et tache environ 1 x 10⁴ cellules avec anticorps/taches conjugué fluorescent pour CD71, CD35, annexin V et l’iodure de propidium.
   Remarque : Les cellules différenciées devraient être ≥65 viable, ≥55 % CD35⁺et ≤ 20 % CD71⁺ tel que déterminé par mis en place de protocoles de validation¹⁴ (Figure 1).

2. Elaboration d’OPKA tampons et réactifs

1. Préparer 50 mL de tampon stérile opsonisation B (OBB) en mélangeant 42,5 mL stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca^{2 +}/Mg^{2 +}5 mL de sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur et 2,5 mL de 0,1 % de gélatine stérile. Conserver à 4 ° C.
2. Obtenir le lapin bébé complément et conserver à-80 ° C.
3. Obtenir ou préparer des plats de culture bactérienne (c.-à-d., 15 x 100 mm² 5 % brebis géloses au sang).

3. préparation des échantillons de Stock bactériennes

1. Obtenir un stock de la souche bactérienne (s) à tester.
   Remarque : Pour ce protocole, sérotype 3 Streptococcus pneumoniae (automatismes WU2, généreusement fournis par Dr Moon Nahm) est utilisé.
2. Cultiver la souche bactérienne dans un bouillon approprié (bouillon de Todd-Hewitt + 0,5 % d’extrait de levure pour cette souche automatismes WU2) pour environ 2−4 h à 37 ° C.
   Remarque : La densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) de la culture doit être comprise entre 0,6 et 0,8.
3. Les bactéries de granule par centrifugation à 6 000 x g pendant 2 min et remettre en suspension les cellules de 10−30 mL de 15 % de glycérol dans le bouillon approprié. Aliquote la culture bactérienne (500 µL par aliquote) dans des tubes à centrifuger stérile de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.
4. Dégeler un flacon de stock bactérienne dans un bain-marie à 37 ° C. Les cellules bactériennes de granule et remettre en suspension dans 500 µL de OBB dans des conditions stériles.
5. Préparer des dilutions différentes du stock bactérienne dans OBB (10 µL d’aucune dilution, 10 µL de 01:10, 10 µL de 1/100, etc..). Effectuez le test OPKA (art. 4-6, y compris co-culture HL-60/complément) tel que décrit ci-dessous à l’aide de diverses dilutions du stock bactérienne non traitée. Culture les plaques pendant la nuit à 30 ° C (pas de CO₂).
   Remarque : La température de 30 ° C est spécifique pour les automatismes WU2 empêcher la prolifération ; autres souches/sérotypes peuvent croître optimale à 37 ° C.
6. Compter les colonies pour chaque dilution du stock de bactérienne non traitée conjointement mis en culture avec complément et cellules HL-60. Déterminer quelle dilution des bactéries donne le nombre optimal de colonies dénombrables (environ 80−120 UFC pour les bactéries non traitées conjointement mis en culture avec cellules HL-60). Notez cette dilution pour les futurs OPKAs impliquant ce stock bactérien.

4. culture et traitement contre les bactéries

1. Décongeler un tube de stock bactérienne préparée à l’étape 3.3. Bactéries (6 000 x g pendant 2 min) de granule et resuspendre le culot dans OBB à une dilution optimale tel que déterminé à l’étape 3.6.
2. Distribuer 10 µL de suspension bactérienne dilution / puits dans une plaque de culture de cellules de 96 puits fond rond.
3. Ajouter 20 µL du traitement approprié d’anticorps ou de la drogue dans chaque puits expérimental en double exemplaire.
   Remarque : Dans le présent protocole, un anticorps spécifique au sérotype généré chez la souris est ajouté comme traitement X et une enzyme de glycoside hydrolase connue pour dégrader la capsule de polysaccharide 3 sérotypes est ajoutée comme traitement Y (Figure 2)^4,20. Pour les puits de contrôle, utiliser 1 x PBS ou OBB, fonction de la mémoire tampon utilisée pour les puits de traitement.
4. Secouez la plaque d’échantillon à environ 90 tr/min pendant 1 h à température ambiante. Réglez ces conditions selon la température optimale ou agitation des traitements à l’essai.

5. HL-60 co-culture bactérienne

1. Préparer les cellules HL-60 en récoltant les cellules HL-60 différenciés qui sont traités avec DMF trois jours avant (voir l’étape 1.4) dans des tubes coniques 15 mL. Les cellules (500 x g, 3 min) à pellets, éliminer le surnageant et laver au moins 10 ml de PBS 1 x.
2. Les cellules lavées (500 x g, 3 min) à pellets, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules OBB (commencer avec 1 mL OBB et ajuster pour une concentration finale de 1 x 107/ml après comptage de cellules).
3. Ajouter bébé lapin complément (sérum de lapin bébé stérile, non dilué, âge 3−4 semaines) à un volume final de 1:5.
   Remarque : La concentration finale du mélange HL-60-complément devrait être de 1 x 107/ml. Si test complément dépendance, on peut utiliser une seconde solution contenant des cellules actives de HL-60 avec complément inactivés par la chaleur (complément peut-être être inactivée par incubation dans un bain-marie à > 55 ° C pendant au moins 30 min).
4. Après que 1 h culture bactérienne est complet (étape 4.4), diviser chaque échantillon (p. ex., 10 µL de chaque échantillon de 30 µL dans deux nouveaux puits) en puits dédoublés pour deux groupes (c.-à-d. utilisation seulement 20 µL de la co-culture 30 µL original pour tenir compte de l’erreur de pipettage) : un ensemble seront conjointement cultivé avec HL-60-complément et on comprendra seulement les bactéries. Ajouter 50 µL du mélange HL-60-complément (de l’étape 5.3) à chaque jeu expérimental de puits (délégué + HL-60) ; ajouter 50 µL de OBB seul dans les puits de bactéries seulement (déléguée -HL-60).
   Remarque : Pour cet exemple, environ 800 CFU bactériennes est utilisés pour la co-culture initiale avec cellules HL-60 de 5 x 10⁵50 µL. Si cette multiplicité d’infection est trop élevée ou trop basse, comme indiqué par le nombre de colonies final, ajuster la dilution initiale bactérienne plutôt que le nombre de cellules HL-60.
5. Secouer la plaque à 96 puits à 37 ° C pendant 1 h (pas de CO₂).

6. l’échantillon électrodéposition et Incubation durant la nuit

1. Diluer chaque puits 1:5 avec OBB, afin que chaque échantillon a un volume d’au moins 50 µL.
2. Distribuer 50 µL de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, assurer un espacement adéquat entre les échantillons. Pour 15 x 100 mm² ronds plats d’agar, échantillons de pipette environ 4 sur une plaque.
3. Couvrir et laisser sécher pendant environ 15 min à température ambiante, les échantillons.
4. Inverser les plaques et la culture du jour au lendemain à 30 ° C (pas de CO₂). Alternativement, la culture des plaques dans des bocaux anaérobies pour vérifier si des conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou de contrôle pour la morphologie.
5. Après une culture, compter les colonies dans chaque zone désignée. Analyser des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque série pour le contrôle correspondant et/ou des échantillons qui ne reçoivent pas de co-culture de cellules HL-60 (l’indicatif de la survie des cellules de 100 %, 0 % de cellules mise à mort).

Résultats

Validation de la différenciation de la HL-60 doit être exécutée avant de commencer le OPKA. Ceci peut être accompli à l’aide de cytométrie de flux pour déterminer l’expression extracellulaire de CD11b, CD35, CD71 et l’annexin V (Figure 1). L’iodure de Propidium peut aussi servir comme un marqueur de viabilité. Après avoir été traités avec DMF pendant 3 jours, l’expression du CD35 devrait être augmentée (≥55 % de toutes les cellules) et expression du CD71 devrait ê...

Discussion

OPKAs servir un rôle essentiel dans l’évaluation de médiation immunitaire d’anticorps induits par les vaccins^6,8. La signification fondamentale de ce OPKA simplifiée est la capacité d’adaptation dans les conditions à tester (anticorps, traitements enzymatiques, etc..). En ce sens, bien que ce test peut être utilisé pour tester la contribution des opsonines (c.-à-d., anticorps) dans la phagocytose, également utilisable pour évaluer les moyens de s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV