שלאחר המוות תוכנית מקיפה עבור אנשים עם טרשת נפוצה

Summary

טרשת נפוצה היא מחלה. בלתי מיאלואידית דלקתית ללא מרפא ניתוח רקמת המוח מספק רמזים חשובים כדי להבין את הפתוגנזה של המחלה. כאן אנו דנים מתודולוגיה וניתוח במורד הזרם של רקמת המוח של MS שנאספו באמצעות תוכנית מהירה ניתוח מהיר ייחודי במבצע במרפאת קליבלנד.

Abstract

אנו מתארים תוכנית תרומת רקמה מהירה עבור אנשים עם טרשת נפוצה (MS) כי דורש מדענים וטכנאים להיות על-שיחה 24/7, 365 ימים בשנה. המשתתפים מסכימים לתרום את המוח שלהם ואת חוט השדרה. רוב המטופלים עקבו אחר הנוירולוגים במרכז הרפואי של קליבלנד קליניק לטיפול ולמחקר של MS. הקורסים הקליניים שלהם והלקויות הנוירולוגיות מאופיינים היטב. זמן קצר לאחר המוות, הגוף מועבר אל מרכז הדמיה MS, שבו המוח נסרק באתרו על ידי 3 T תהודה מגנטית דימות (MRI). הגוף מועבר לחדר הנתיחה שלאחר המוות, שם מוסרים המוח וחוט השדרה. המוח מחולק לשתי אונות. האונה האחת מונחת מיד בתיבת חיתוך ופרוסות 1 ס מ בעובי של לסירוגין הם קבועים 4% פאראפורמלדהיד במשך יומיים או קפוא במהירות בקרח יבש ו 2-מתילבוטאן. פרוסות המוח קצר קבוע מאוחסנים בתמיסה הקפאה ומשמש ניתוח היסטולוגית וזיהוי האימונוציטוטוכימיה של אנטיגנים רגישים. פרוסות קפואות מאוחסנות ב-80 ° c ומשמשות עבור מולקולרית, אימונוציטוטוכימיה, ובחקר טווח היברידיזציה/רנ א באתרו. חצי הכדור השני ממוקם 4% פאראפורמלדהיד במשך מספר חודשים, ממוקם בתיבת הפרוסות, נסרק מחדש ב 3 T תהודה מגנטית (MR) סורק ופרוסות לתוך סנטימטר-חתיכות עבות. לאחר המוות באתרו תמונות MR (MRIs) הם שיתוף הרשום עם פרוסות המוח 1 ס מ כדי להקל על היחסים של MRI-פתולוגיה. כל פרוסות המוח מצולמות ונגעים במוח הלבן מזוהים. חוט השדרה נחתך למקטעים של 2 ס מ. מקטעים חלופיים הם קבועים 4% פאראפורמלדהיד או קפוא במהירות. הרכש המהיר של רקמות MS שלאחר המוות מאפשר ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים של מוחות ומיתרי השדרה של MS ויחסי שדרה פתולוגית של מומים MRI המוח. האיכות של אלה מעובד במהירות רקמות שלאחר המוות (בדרך כלל בתוך 6 h של מוות) הוא בעל ערך רב למחקר MS והביא תגליות רבות השפעה גבוהה.

Introduction

אחת הדרכים הטובות ביותר לחקר מחלה היא לבחון את הרקמה החולה עצמה. זה מציג אתגרים לאלה הלומדים מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CN). ביופסיות של המוח החולה וחוט השדרה הם נדירים מאוד ובדרך כלל כרוכים במקרים חריגים. שיעורי הנתיחה שלאחר המוות עבור אנשים עם מחלות האבל ירדו באופן דרמטי בשנים האחרונות, וכאשר מבוצע, הם לעתים קרובות לא מספקים רכש מהיר של רקמות. אתגרים אלה הביאו להקמת בנקים מבוססי מחלות במוח, כולל מספר התמקדו באיסוף רקמות מאנשים עם טרשת נפוצה (MS). MS היא מחלה דלקתית בתיווך של ה-CN שהורס המיאלין, oligodendrocytes הפוך (תאים ויוצרים המיאלין), נוירונים, ו axons. רוב המטופלים MS יש קורס bi-phasic מחלה המתחיל עם התקפי נכות נוירולוגית עם התאוששות משתנה, כי בסופו של דבר מתפתחת לתוך מחלה מתקדמת בהדרגה, כי הוא סביר נוירוניווניות בטבע¹. עבור רוב מוחות MS שנתרמו, מרווחי לאחר המוות (PMI) בין מוות עיבוד רקמות עולה 24 h. בעוד רקמות אלה סיפקו מידע חשוב על שינויים פתולוגיים במוח MS, הם לא מתאימים למחקרים מולקולריים מתקדמים יותר שיכולים לספק תובנות חזקות לתוך פתופסולוגיה המחלה. זה במיוחד המקרה עבור מחקרים גנים הפרופילים, אשר דורשים RNA שלם.

כדי להתגבר על המגבלות שנדונו לעיל, פיתחנו תוכנית תרומת רקמות מהירה המאפשרת לקשרי MRI/פתולוגיים. פרוטוקול זה מספק רקמות שהשתמרו היטב מתאים למחקרים מולקולאריים מודרניים ומאפשר השוואה ישירה של מחלות מוח ומומים MRI ב-MS המוחות. המרפאה בקליבלנד טרשת נפוצה רקמת התרומה התוכנית כבר בקיום מעל 20 שנים. זו התוכנית תרומת רקמה מהירה רכש את המוח ואת חוטי השדרה מאנשים עם MS ואחרים הקשורים בתנאים נוירולוגיים אוטואימוניות. התוכנית שואפת להשיג באתרו MRIs בתוך 6 h של מוות, ואחריו הסרת המוח חוט השדרה לעיבוד רקמות.

גיוס
תרומות מתקבלות באמצעות הסכמה לאחר המוות שהתקבל ישירות מחולים (מוכנות מראש) או מקרובי משפחה לאחר המוות. חולים טרום הסכימו מזוהים בדרך כלל מן האוכלוסייה הקלינית במרכז Mellen לטיפול טרשת נפוצה ומחקר בקליבלנד, אוהיו. למרות העדפה בגיוס בתוכנית תרומת רקמה מהירה ניתנת לחולים שבאו בעקבות לימודי האורך, הוא פתוח לכל המטופלים שנראו במרכז. משתתפים שנרשמים לפני המוות מקבלים הוראות לבני משפחה או לנותני טיפול ליצור קשר עם צוות המחקר, בזמן המוות או כאשר המוות נחשב לקרוב. השיטה השנייה להיכנס לתוכנית תרומת הרקמה היא בזמן המוות באמצעות הסכמה של קרובי משפחה. מדינת אוהיו דורש מקרי מוות להתייחס לארגון רכש הנהוגה על ידי האיברים המנדט הפדרלי בשם LifeBanc, אשר פועל 20 מחוזות של צפון מזרח אוהיו. LifeBanc מסכי כל מקרי המוות עבור אבחנה של MS, שהיא הדרה עבור תרומת איברים. סידורים נעשו עבור LifeBanc להודיע לחוקרים מתוכנית התרומה לרקמות MS עבור כל מקרי המוות עם אבחנה משויכת של MS המתרחשים ברדיוס של 75 ק מ מהמרפאה בקליבלנד. קרובי משפחה וצוות בית החולים הם יצרו קשר על ידי צוות התוכנית תרומת רקמה והסכמה מתקבלת לתרומה של רקמות המוח וחוט השדרה. אלה שתי שיטות של גיוס לאחר המוות לאחר לאחר המוות באמצעות LifeBanc התוצאה היא כ 10-12 תרומות המוח בשנה. התאמות מבוצעו למגבלת הגיל העליון של המוות כדי לנהל את מספר ההפניות הנגזרות LifeBanc.

רכישת תרומות
התוכנית דורשת 24 שעות כיסוי, 365 ימים בשנה על ידי חברים בתוכנית תרומת רקמה לרכישת רקמות. מרכזי הודעה תרומת רקמה דוא ל/זימונית/טלפון נייד המכשיר מערכת משמש את הצוות הקליני כיסוי תרומות רקמות. LifeBanc מסופק מספרים כדי ליצור קשר עם צוות הקריאה עבור תוכנית תרומת רקמות. חברים מקבלים הודעה על מוות על ידי ספקי בית החולים/קרובי משפחה (טרום הסכימו) או על ידי LifeBanc ומקורות הפניה אחרים. ראשית, קביעת זמן מוות והיתכנות לתרומת רקמות נעשתה. מקרי המוות מוקרנים אז לתנאים שעלולים לגרום לרקמה באיכות ירודה, כולל היפוקסיה ממושכת שלפני המוות, רקמת מוח הרסנית מסיבית (למשל, דימום תוך-גולגולתי גדול, משיכות דו-מיזיות נרחבות, גידול נרחב נטל), תמיכה ממושכת במכונת ההנשמה (> 3 ימים) ושימוש ממושך בסוכני vasoactive (> 3 ימים) לפני המוות. כאשר בוחן רפואי מעורב במוות, נוירולוג המחקר יכול לדבר עם הבודק הרפואי לחקור דרך לקבל רקמות בזמן מבלי להתפשר על האחריות של הבוחן הרפואי. אם הרקמה בר קיימא הוא הרגיש להיות נוכח, אז הסכמה בכתב מתקבל (אם לא התקבל טרום לאחר המוות) וההכנות נעשים עבור תחבורה הגוף. לאחר מכן נוצר קשר עם שירות הסעות בשירות ההסעות הקודם למתקני MRI במרפאת קליבלנד. הטיפול נלקח כדי להבטיח כי הגוף נשאר בטמפרטורת החדר והוא לא ממוקם לתוך קירור, כמו טמפרטורות הגוף התחתון משויכים שינויים במאפייני האות MRI.

היסטוריה קלינית
ההיסטוריה הקלינית כוללת פרטים על האבחנה של MS, התפרצות של סימפטומים, טיפולים בשימוש, תוצאות של בדיקות קליני פרה קליני (מעורר פוטנציאל, התוצאות נוזל שדרתי, טומוגרפיה אופטית קוהרנטית), טרשת נפוצה פונקציונלי מרוכבים , ולהרחיב את היקף מצב הנכות (EDSS; בפועל או מוערך), אשר נאספים מהרשומה הרפואית (היכן שזמין), וראיון ישיר של קרובי משפחה. MRI מלפני המוות נאספים גם כן.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי המועצה לסקירה מוסדית של קליבלנד קליניק ובעקבות ההנחיות של ועדת האתיקה של המרפאה האנושית של קליבלנד קליניק.

1. MRI באתרו

1. קח את גוף התורם לחבילת MRI ולנהל פרוטוקול mri 2 h הדמיה במתקן הדמיה MS. . לנהל את האמ. אר. איי. ב -3 או 7 לא
   הערה: עדיפות ניתנת 3T כמו רוב הנתונים מדור קודם בוצע על 3 T, אבל כאשר לא זמין, הדמיה מבוצעת עם 7T. רצפי הליבה המיועדים מבוצעים עבור כל המקרים (טבלה 1) ורצפים נוספים התלויים באינטרסים המחקר הנוכחי מבוצעים אם הזמן היתרים (מוגבל על ידי השגת קיבוע רקמות פחות מ 12 h לאחר המוות). טבלה 1 מתארת את רצפי הליבה.

2. נתיחה שלאחר המוות

הערה: בעקבות ה-MRI באתרו, הגוף מועבר לחדר המתים עבור המוח והפקת חוט השדרה על ידי מעבד ורקמות על ידי חברי המעבדה.

1. בצע את השלבים הבאים לפני ההגעה הגוף בחדר המתים. שעתיים לפני, להכין 3 L של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ותווית מכולות ותיקים עבור אחסון רקמות. להכין 3 L של 8% בתחתית ולדלל 1.5 L של 8% כלפי מע ל 4% בתחתית. מניחים את הנותרים 8% בכיוון השני ב -4 ° צ' ליום 2.
2. לפני נסיעה לחדר המתים, למלא 2 מקררי נסיעה כדי 50% קיבולת עם קרח יבש (בלוקים גדולים שבורים כדי להתאים וכדורי קטן).
3. בחדר המתים, ממלאים מכולה מפלדת אל-חלד בחצי הדרך עם 2-מתילבוטאן וקרח יבש ומכסים במכסה לקראת הקפאת הרקמה.
4. שקול וצלם את המוח. שהוסר פעם על ידי הדינר
5. הניחו את כל השכבה הצמודה במיכל המלא בחצי הכלל.
6. הפרד את המוח ואת גזע המוח מן המוח ולצלם את המוח.
7. יש לזהות את עצבי הראייה, את הצ, ולהפריד ביניהם באמצעות בדיקה ופינצטה. . לכרות את המבנה עם אזמל
   הערה: החלק המרוחק של צד אחד של עצב הראייה מסומן באמצעות דיו היגינס לזיהוי.
8. הפרד בין האונות המוחית longitudinally וצלם כל כמחצית האונה בנפרד.
9. דיו את קליפת המנוע העיקרית (PMC) עבור האונה השמאלית, לצלם אותו מחדש, ולמקם אותו במיכל 3.3 L עבור קיבעון ארוך. תעד את שעת ההתחלה . של קיבוע המוח
10. PMC עבור חצי הכדור הנכון עשוי להיות כדיו או מגורש.
    1. , אם מדובר בלהיות מגורש. הסר תחילה את מניכי הכיסוי
    2. צילום מחדש בדיו או באמצעות PMC.
    3. , אם PMC מגורש. חתוך ל -6 סעיפים בגודל שווה
    4. דיו ההיבט הrostral של כל מקטע.
    5. מקם מקטעים אי-זוגיים בתוך מכולות בעלות מילוי מלא לקיבוע קצר.
    6. הקפא מקטעים זוגיים ומניחים בשקיות מקפיא אטום ל1 קריר יותר.
11. חותכים את האונה הימנית קדמי לאחורי לתוך 1 ס מ סעיפים ילתית.
    1. מסמך חריגות ברוטו (למשל, חיתוך חפץ, דימום ונגעים).
    2. מניחים מקטעים אי-זוגיים למכלים המלאים בחלק הטוב ביותר של החלק הנמוך.
    3. הקפא מקטעים זוגיים ומניחים בשקיות מקפיא אטומות.
    4. . המסמך מסתיים בזמן הקיבעון המוחי
12. הפרידו את המוח מהמוח הקטן והניחו. במיכל מלא בחצי הכיוון לקיבוע קצר
    1. . מlongitudinally המוח הנפרד
    2. חותכים את כל האונה לתוך 4 חלקים משונן עבה באותה מידה.
    3. צילום האמצעי והשקפות לרוחב.
    4. הניחו את הפרוסות המיוערות לתוך מיכל מלא בחצי השביל לקיבוע קצר.
    5. הקפא את המוח בפרוסות האונה הימנית והמקום בשקיות מקפיא אטום ל1 קריר יותר.
13. השג את חוט השדרה עם שורשי העצבים מן הדינר.
    1. להסיר את חוט השדרה דורא מאטר ולאחסן דורא במיכל עם השדרה.
    2. הפרד בין שורשי העצבים האחוריים והימניים חותכים את השורשים הקדמי שמאל העצבים האחוריים לחתוך מן חוט השדרה ומקום בתוך מכולה ממולא בחצי השביל של קיבעון קצר.
    3. חותכים את שורשי העצב הקדמי והאחורי הימני מחוט השדרה, הקפאת ההקפאה, מקום בשקיות מקפיא אטום, ולאחר מכן המקום קריר יותר2.
    4. צילום caudal-רוב 20 ס מ של חוט השדרה. תעד את מיקום. ההתרחבות המותני
    5. גזור 2 ס מ חלקים רוחבי של הליך חוט מ caudal אל rostral.
    6. דיו ההיבט הrostral של כל חתך חתוך.
    7. מניחים מקטעים אי-זוגיים למכלים המלאים בחלק הטוב ביותר של החלק הנמוך.
    8. הקפא מקטעים זוגיים ממוספרים, מניחים בשקיות מקפיא אטומות ולאחר מכן מניחים2 קריר יותר.
    9. תעד את שעת ההתחלה של קיבוע חוט השדרה ואת כל העיוותים הדוחים.
    10. לצלם את החלק הנותר rostral של חוט השדרה.
    11. תעד את מיקום. ההתרחבות הצווארי בצע את השלבים 2.13.5 – 2.13.8 עבור חוט השדרה הנותרים.
14. בעקבות המקום מחדר המתים רקמת קפוא בקופסאות מתויג ב-80 מקפיאים ° c. מאחסנים רקמה קבועה ב -4 ° c.
15. ב 24 ה לאחר הנתיחה שלאחר המוות (יום 2) לדלל את הנותרים 8% בכיוון השני עד 4%.
16. החלף 4% בכיוון הכיתה במכולות קיבוע עם מדולל באמצעות 4% בלבד.
17. ב 60 h פוסט נתיחה שלאחר המוות להכין פתרונות של 2.5% גלוראלדהיד ב 4% בתחתית מגלוטאלדהיד, התחתית, dH₂O ו סורנסון של המאגר (מוכן על ידי ערבוב ברצף: 0.2 M פוספט מאגר pH 7.4, pvc 1% w/v, סוכרוז 30% w/v, ו אתילן גליקול 30% v/v).
18. הסרת השימוש ב-4% בלבד ממכולות בקיבוע קצר.
19. לשטוף את הרקמה במאגר של sorenson ומניחים אותו בתמיסה הקפאה (הגליצרול 20%, 0.4 מאגר המאגור של מ. כ 20%, ו 0.02% נתרן אזיד ב-dH₂O).
20. צילום קצר-קבוע פרוסות מוח, מוח קטן, גזע המוח וקליפת המנוע (אם רלוונטי).
21. עם להב אזמל לחתוך 2 מ"מ מקטעים רוחבי עובי של כל 2 ס מ חצי חוט השדרה בסעיף קצר.
22. מחלקים מקטעים ב 2 מ ל מבחנות ומילוי עם הפתרון של 2.5% גלוטרלדהיד ב 4% כלפי התחתית.
23. החזר את המקטע הנותר ל-20 מ ל המקורי במבחנה. לשטוף את החלק עם המאגר של סורנסון ולהחליף עם פתרון הקפאת הזיהום.

3. פתולוגיה

הערה: קצר קבוע פרוסות של האונה הימנית, כמו גם את האונה השמאלית קבוע לטווח (ממוקם 4% התחתית במשך כמה חודשים) הם או לחתוך לתוך 30 יקרומטר סעיפים (המכונה חופשי צף) או מוטבע פרפין ו גזור כמו 12 – 14 יקרומטר סעיפים (המכונה פרפין-מוטבע). מקטעים אלה מעובדים בדרך כלל עם חלבון פרוטאוליפיד (PLP) לזיהוי נגעים deמיאלואידית ומורכבים היסטוליתיים הגדול קומפלקס II (MHC-II) עבור פעילות החיסונית באמצעות שיטת diaminobenzidine. פרוטוקולים אלה היו סטנדרטיים ובשימוש במספר פרסומים^{2,3,4,5,6,7,8,9 ,} מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ^{11 ,} . ^{שתיים עשרה}

1. Free-צפה (30 μm) בתוספת מורכבת-Biotin מורכב (ABC) רקמה מכתים
   1. הסרת מקטעים מפתרון ההקפאה, מקטעי העברה לצלחת שש-היטב, ולשטוף אותם 3x עבור 5 דקות כל אחד 2 מ ל של 1x פוספט מלוחים באגירה pH 7.0 (PBS). כאשר העברת לבאר הבאה באמצעות שישה היטב צלחת להשתמש לטפל לא לקרוע את הרקמה. במהלך כל לשטוף ולשלב דגירה, להניח את הצלחת שש-הבאר על שייקר ולאפשר רקמה לרעוד בעדינות.
      הערה: מקטעי רקמות מודרכים בנפחים קטנים יותר ובצלחות גדולות יותר (כלומר, 12-ו -24-הצלחות) נוטות להציג את המשטח ואת הקצוות.
   2. לבצע אחזור אנטיגן על ידי מקטעי המיקרוגל בגביע זכוכית המכיל בערך 30 מ מ של 10 מ"מ מאגר ציטראט (pH 6.0). ודא שרקמות אינן מקופלים על-ידי שינוי באמצעות מברשת צבע ומיקרוגל עבור 2 – 3 דקות או עד שחוצץ ציטראט מגיע מתחיל לרתוח. אפשר למקטעים להתקרר לטמפרטורת החדר (~ 20 דקות).
   3. העבר מקטעים בחזרה לצלחת שש-באר ולשטוף סעיפים 3 X עבור 5 דקות כל אחד ב 2 מ ל של PBS/0.3% טריטון X-100. בלוק אנדוגני peroxidases על ידי מקטעים דגירה ב 2 מ ל 3% H₂O₂/0.3% טריטון X-100/PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. לשטוף סעיפים 3 X עבור 5 דקות כל אחד 2 מ ל של PBS/0.3% טריטון X-100. בלוק סעיפים 2 מ ל 3% סרום עז רגיל/0.3% טריטון X-100/1x PBS עבור 1 h ב RT.
   5. מקטעים דגירה לילה עד 5 ימים (בהתאם לנוגדן) בנוגדנים העיקרי בבימויו של מיקרוגלייה ואפיסקופים המיאלין לזהות דלקת (mhcii) ו deמיאלונציה (plp) (לראות את הטבלה של חומרים) ב 4 ° c.
      הערה: ודא שמקטעים אינם מקופלים בעת הדגירה בשלב זה או בשלבים הבאים, כיוון שפעולה זו תוביל לאזורים בתוך המקטעים הריקים מכתמים.
   6. לשטוף סעיפים 3 x עבור 5 דקות כל אחד 2 מ ל של 1x PBS. לאחר מכן הדגירה מקטעים של נוגדנים biotinylated משני (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 1 h ב RT. הכינו את מתחם avidin-biotin (ABC) פתרון במהלך דגירה בערך 45 דקות לפני שלב השטיפה הבא כדי לאפשר מכלולי ABC לטופס.
   7. לשטוף סעיפים 3 x עבור 5 דקות כל אחד 2 מ ל של 1x PBS. לאחר מכן הדגירה סעיפים ב-ABC עבור 1 h ב RT.
   8. שטוף סעיפים ב 2 מ ל של 1 x PBS שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד. מקטעי הדגירה בתוך החלק המסונן (2 מ ל/טוב/סעיף) המכיל H₂o₂ (1:500 דילול של 30% H₂או₂ בתוך הדקה) עד שהצבע מתפתח כראוי (~ 3 – 8 דקות).
   9. לשטוף סעיפים 3 x עבור 5 דקות כל אחד 2 מ ל של 1x PBS. כדי לשפר את האות (אופציונלי), osmicate באמצעות 0.04% OsO₄ (~ 30 s).
   10. שטוף מקטעים שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד ב-1x PBS. בנפרד, להעביר כל קטע מלוחית שש הבאר למיכל קטן מלא של 1x PBS ולמקם את מקטע הרקמה על שקופית זכוכית שטוח ככל האפשר.
   11. הרם בעדינות את השקופית מתוך ה-PBS תוך הקפדה על מקטע הרקמה השטוח ככל האפשר. באמצעות שני מברשות צבע, לשטח בעדינות למתוח את הרקמה על השקופית ולחלק את עודפי המים עם מגבת נייר. מחתכי רקמה עם גליצרול (או מדיה הרכבה שוות ערך) וחותם את הכיסויים עם לק ברור.

4. פרפין-סעיפים המיספרה מוטבעת: מכתים את התוספת

1. ממיסים את הפרפין מהשקופיות בתנור של 60 ° c במשך 5 – 10 דקות.
2. מקטעים דה-פרקטייז על-ידי דגירה ב-קסילן 3x עבור 5 דקות כל אחד.
3. מימה רקמות באתנול מדורגת ב 100% (2x עבור 5 דקות כל אחד), 95% (2x עבור 5 דקות), 70% (2x עבור 5 דקות כל אחד), ו 50% (1x עבור 5 דקות כל אחד). . כסו את השקופיות בערוץ הPBS
4. אנטיגן לאחזר על ידי למיקרוגל שקופיות בגביע של 10 מ"מ מאגר ציטראט (pH 6.0).
5. לשטוף את השקופיות ב-1x PBS (3x עבור 5 דקות כל אחד) מקורר פעם לטמפרטורת החדר. בלוק אנדוגני peroxidases על ידי רקמת דגירה ב 3% H₂O₂/1% טריטון-X 100/PBS עבור 30 דקות.
6. רוחצים את הרקמה ב-1x PBS שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד. לחסום את רקמת עם 6% סרום עז רגיל ב-PBS עבור 1 h.
7. מקטעי הדגירה של הנוגדן העיקרי (לראות את הטבלה של חומרים) ב-PBS בטמפרטורת החדר (RT) לילה (מקסימום 20 h).
8. לשטוף סעיפים 3 x עבור 5 דקות כל אחד ב-1x PBS. ואז הדגירה סעיפים בנוגדן המשני המקביל (לראות את הטבלה של חומרים) ב-PBS עבור 1 h ב RT.
9. הכינו פתרון ABC בערך 45 דקות לפני שלב השטיפה הבא במהלך הדגירה.
10. לשטוף סעיפים 3 x עבור 5 דקות כל אחד ב-1x PBS ולאחר מכן דגירה ב-ABC עבור 1 h ב RT.
11. לשטוף את סעיף 3 x עבור 5 דקות כל אחד ב-1x PBS.
12. מקטעים ב-דגירה מסוננים (0.45 יקרומטר מסנן גודל) החלק המכיל H₂o₂ (1:500 דילול של 30 % H₂o 2 בתוך הגובה) עד צבע מתפתח כראוי (~ 3-8 דקות).
13. שטוף מקטעים (3x 5 דקות) ב-1x PBS. כדי לשפר את האות, osmicate באמצעות 0.04% אוסמיום tetroxide (OsO₄; כ 30 s).
14. שוטפים סעיפים (3x 5min) ב 1x PBS.
15. מייבשים רקמות בסדרה מדורגת של אתנול 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 דקות), ו-100% קסילן (1x 5min). . הניחו לגרד להתאדות
16. מקטעים עם מדיה מהירה המבוססת על הרכבה יבש באמצעות toluene. ניסוחים המכילים נוגדי חמצון מומלצים כדי למנוע הלבנת כתמים. הסר מדיה הרכבה עודפת מקצות שקופית עם תער עבור האחסון העוקב.

5. מערכת היחסים MRI/פתולוגיה

הערה: עבור הקשורות MRI עם פתולוגיה, אנחנו הראשון לבצע vivo לשעבר MRI של האונה הארוך קבוע שלמים של המוח (שלב 2.9 לעיל) בתיבה מתכווננת עם סמנים MRI-גלוי המציין חריצי פרוסות. לאחר מכן פורסים את המוח ומצלמים את הפרוסות 1 ס מ כדי לאפשר רישום משותף של באתרו לפרוסות המוח הבודדות. לאחר מכן נוכל לבצע ניתוחים מונחי-MRI, היכן שאזורים מעניינים (ROIs) מזוהים ב-MRI כדי לאפשר ניתוח רקמות ישיר. אנחנו יכולים גם לבצע histopathology-ניתוחים מודרכים, כאשר ROIs מזוהים על הרקמה (למשל, נגעים בחומר לבן, חומר לבן ללא deמיאלואידית, וכו ') ולאחר מכן מאופיין על ידי שיתוף ה-MRI אמצעים (שולחן 1).

1. זיהוי של ROIs מבוסס MRI
   הערה: במחקרים קודמים, זיהינו rois בחומר לבן^{11,12,13,14,15} ואפור חומר^{16,17 , 18}. הדוגמה שלהלן היא לניתוח החומר הלבן.
   1. מקטע של נגעים היפרעזים היתר T2 ב-MRIs באתרו (משלב 1.1), מעובד בתחילה על ידי אלגוריתם אוטומטי, ולאחר מכן תוקן באופן ידני על-ידי משתמשים מנוסים.
   2. קטע T1 הניקוד מתוח בתוך נגעים T2 כמו voxels עם עוצמת אות פחות או שווה 80% מעוצמת האות של רקמת המוח שמסביב הופעת.
   3. פלח אזורים מתוחים ביחס העברת מגנטיזציה (MTR) עם מפות 80% מסף.
   4. ליצור שלושה סיווגים באמצעות segmentations לעיל: (a) הנגעים T2 בלבד אשר אינם תקינים ב-T2 משוקלל/כשרון סריקות אבל נורמלי בסריקות T1-משוקלל או ה-MTR, (ב) T2T1MTR נגעים, אשר הם חריגים על כל T2-משוקלל/כשרון, T1-משוקלל, ו-MTR סריקות; ו (ג) נורמלי להופיע בחומר לבן (NAWM), אשר נורמליים על כל משוקלל T2/כשרון, T1-משוקלל, ו-MTR סריקות.
      הערה: מבחר הפרוסות שלנו מבוסס על קיומם של כל שלושת האזורים המעניינים ביותר (T2 בלבד, T2T1MTR ו-NAWM) באותה פרוסות.
   5. חשב עוצמות מנורמלות עבור כל ROI כדי למזער את השונות הנובעות ממוחות שונים וממיקומים שונים במוח.
2. רישום משותף של MRI באתרו לפרוסות מוח
   1. סרוק את האונה הקבועה של המוח בתיבת פריסה מותאמת אישית עם ארבע שורות של סמנים רגישים MRI לוקליזציה את החריצים שבו סכין ניתן להוסיף לחתוך את המוח. בצע רכישה משוקלל משקל T1 תלת-ממדי עם רזולוציה 1 מ"מ isotropic המכסה את המוח קבוע ואת כל הסמנים.
      הערה: זה נקרא MRI post-קיבוע והוא משמש רק כצעד ביניים עבור הרישום המשותף של ה-MRIs באתרו לפרוסות המוח.
   2. מיד לאחר סריקת, לחתוך את האונה המוח בחריצים הממוקמים 1 ס מ בנפרד, וכתוצאה מכך כ 15 פרוסות.
   3. מצלמים את פרוסות המוח בשני הצדדים הקדמי והאחורי.
   4. לרשום את ה-MRI באתרו ותמונות של פרוסות מוח עם הצעדים הבאים.
      1. עבור פילוח של שלאחר קיבעון ו-MPRAGE באתרו, טרום תהליך הן לאחר הקיבעון באתרו MPRAGE MRIs עבור עוצמה שאינה אחידות¹⁹.
         1. פלח את המוח וארבע שורות של סמנים מתוך מעובד מראש לאחר קיבוע MPRAGE.
         2. פלח את חצי הכדור המתאים ל-MRI שלאחר הקיבעון^20,21 מתוך עיבוד מוקדם של זעם באתרו.
      2. שיתוף רישום המוח מופק באתרו ו post-קיבעון MRIs באמצעות סדרה של תהליכי רישום ליניארי עד 12 מעלות של חופש (רישום affine) באמצעות FSL לפלרטט²². שינוי קנה המידה ורכיבי ההטיה של האפקט של הצטמקות הקיבעון.
      3. מצא את הכיוון הרגיל של המישור החותך על-ידי מזעור הסכום של עוצמות הצפוי המרבי באמצעות סמנים מקוטע. זוויות התמצאות מחדש אלה משולבות במטריצה הטרנספורמציה שמתקבלת מהשלב הקודם.
      4. התאמת חזותית תמונות MRI לתמונות של פרוסות המוח קבוע האחורי באמצעות מציג תמונה בתוך הבית המאפשר לשנות את העומק ואת האוריינטציה של וקטורים נורמלי. יש צורך בשינויים קטנים כי המוח חותך הוא לא מושלם.
      5. החל המרת תמונה AFFINE¹³ עבור כל פרוסה להפוך את באתרו mris לאותו מיקומים לחתוך כמו תמונות של פרוסות המוח.

תוצאות

כפי שהוזכר לעיל, כמעט מחצית האונה המוחית הוא קפוא וזמין למחקרים מולקולריים באמצעות DNA, RNA, או חלבון. מבחינה היסטורית, מחקרים המשתמשים ברקמות המוח שלאחר המוות הוכחו להיות מושפעים מתנאי טרום לאחר המוות, גיל, מין, רקמת pH, שלמות mRNA (RIN), מרווח לאחר המוות (PMI), ודאות אבחון, שימוש בחומר התחלואה, וטיפול תרופתי מוקדם . מצב²³ מבוסס על מחקרים באמצעות רקמות המוח, DNA ו חלבון נראה מושפע במידה פחותה לעומת RNA. בהתבסס על הניסיון שלנו, בידוד RNA וניתוח במורד הזרם יש, עם זאת, נמצא מושפע ביותר על ידי התנאים טרום לאחר המוות ומרווח לאחר המוות של רקמת המוח. לפיכך, אנו דנים בכמה מהתנאים שאחריהם מתנהל ניתוח מבוסס RNA באמצעות רקמות MS שלאחר המוות.

עבור כל המחקרים שלנו, לאחר שהמוח נאסף בנתיחה שלאחר המוות, הוא פרוס (1 ס מ עבה) ולאחר מכן קבוע ב 4% פאראפורמלדהיד למחקרים מורפולוגיים או קפוא במהירות לניתוח ביוכימיים. כל גושי הרקמה מאופיינים לדמימינציה על-ידי השימוש ב-PLP כמתואר לעיל. ערכת ניתוח מייצגים מוצגת באיור 1. מקטעי רקמות נבדקים לנוכחות של נגעים לבנים (איור 1A). האזורים שנבחרו מוכתמים בפעילות החיסונית (איור 1B) ובדמימינציה (איור 1b). הרקמה הקפואה היא רכוב על קריוסטט (איור 1d) ו מוקפא 30 יקרומטר סעיפים חתוכים. לאחר מכן אוסף של 3-4 סעיפים שלאחר מכן, הפרדה מרקמות סמוכות, אחסון עבור DNA, RNA, או חלבון בידוד. באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו בהצלחה מבודדים DNA^24,25, RNA^5,6,7,8,9 וכן חלבונים²⁶. בעוד ממצאים עיקריים מכמה מחקרים לנתח RNA מ-MS מוחות נדונים, הנה כמה בעיות הקשורות לניתוח של RNA בעקבות המוח MS.

איור 1: אוסף דוגמאות עבור ניתוח mRNA. (א) רקמת הנתיחה נבחרה לניתוח. שטחים של רקמה נבחרים וחלק של רקמה הוא התנצל. כל הסעיפים מוכתמים (ב) MHC-II (מורכבת מרכזית היסטורידית (mhc) מחלקה ii HLA-DR CR3/43) נוגדן כדי לזהות פעילות דלקתית עם (C) פרוטאוליפיד חלבון (plp) כדי לקבוע סטטוס המיאלין באמצעות פרוטוקולים שפורסמו. בהתבסס על מצב המיאלין, הבלוק הוא הבקיע על ידי אזמל (D). סעיפים (60 μm) הם חתוכים (E) והאזורים שכבר הבקיע בעבר יוסרו, מופרדים בצינורות, ומתויג (F). כתמי PLP ו-MHC-II חוזרים אחרי כל 5 סעיפים כדי להבטיח אוסף הנכון של רקמות. הופעה נורמלית החומר הלבן (NAWM) הוא ציין נגעים בחומר הלבן (WML) מתוארים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בנגעים של MS¹⁰. המוקד המדעי הראשוני של תוכנית זו היה על אפיון של רכיבים סלולריים של נגעים לבנים המכילים חומר לבן. בין האנטיגנים הללו הייתה מקומית שאינה זרחתה (NFs). רוב מרבית הNFs ממופחת. באקקיות מיאלואידית , עם הדמימידינציה. האקטונים ממופחת גילינו את הביטוי הצפוי של NFs לא-מנוכה באקמידיקיות. בנגעים בטרשת נפוצה, רבים מהאקמיטיות הללו הסתיימו כנורות הנסיגה אקסונים (איור 2a), אשר משקפים את הקצוות האבוסיים של האקסון. האקסון הטרנס עולה 11,000 מ"מ³ ב נגעים אקוטי בהשוואה לאזורים נורמליים סמוכים¹⁰. תצפיות אלה סייעו לזרז שינוי פרדיגמה במחקר MS כי העביר את השדה לכיוון אפיון נוירוניוון כמו הגורם העיקרי של נכות נוירולוגית קבועה אצל אנשים עם MS.

איור 2: הטרנס-מחלקה במהלך הדמידינציה הדלקתית. ההמרה האקונלית מתרחשת במהלך deמיאלונציה דלקתית (a, ראשי חץ) ומעורר היווצרות של מסוף סיבי (a, חיצים). כאשר כימות (ב), אקסונים האקסון הם שופע בנגעים MS ומופיעים לתאם עם פעילות דלקתית של הנגע. פאנל A מועתק מטראפ ואח '¹⁰ באישור. אדום: חלבון פרוטאוליפיד, ירוק: נוירופילמנט אנטי זרחתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. מוחות מיאלואידית כרונית³ מיאלונציה יכולה להיות חזקה במהלך השלבים המוקדמים של MS. הרבה נגעים MS כרונית, עם זאת, אינם מיאלואידית מחדש. חקרנו אם הנוכחות של תאים אוליגודנדרוציטים הקדמון (OPCs) או הדור של oligodendrocytes הפוך החדש מגביל מחדש של נגעים לבנים החומר הלבן מיאלואידית כרוניות. בעוד צפיפות OPC הצטמצמה לעתים קרובות, הם היו נוכחים כל נגעים כרוניים מיאלואידית³. Oligodendrocytes הפוך שנוצר לאחרונה היו גם הנוכחים בנגעים MS כרונית רבים. תהליכים אוליגודנדרוציטים הקשורים, אך לא היו מיאלולים מיאלואידית מיאלואידית (איור 3). מחקרים אלה מצביעים על כך OPCs ויכולתם לייצר oligodendrocytes הפוך חדשים אינם מגבילים מיאלואידית של נגעים לבנים כרוניים. אנו שיערו כי האקסונים כרוניים, אשר לעתים קרובות הופיעו הדיסטרומכולה, לא היו פתוחים מחדש על ידי המיוצר לאחרונה oligodendrocytes הפוך.

איור 3: תהליכים של oligodendrocytes הפוך טרום מיאלואידית המשויכים לאקסונים. מיקרוגרפים קונקטוביים של נגעים MS מוכתם בנוגדנים PLP (אדום ב פאנלים a, b) ונוגדנים נוירופילמנט (ירוק בפאנלים a, b) מוצגים. האוליגודנדרוציטים הטרום מיאלואידית (אדום ב פאנל A) באזור תת-המוח (SVZ) המורחבת לתוך האזור של אקמידיטונים מיאלואידית (ירוק פאנל A) בנגע MS כרונית. רבים מתהליכים אלה (חיצים בלוח A) מסתובבים סביב axons, כפי שמוצג בהגדלה גבוהה (פאנל ב'). סרגלי קנה מידה מייצגים 20 יקרומטר (A) ו-5 יקרומטר (B). מועתק מצ ואח '³ באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תפקוד מיטוכונדריאלי ב-MS⁶. ביצעת חיפוש משוחדת עבור שינויים גנים עצביים במהירות קפואה מנוע מוטורי השיגה מטופלים כרוניים MS (איור 4A). חיפוש בלתי משוחדת של ערכת נתונים זו זיהה הפחתה משמעותית ב -23 מיטוכונדריאלי גרעיני mRNAs ב-MS (איור 4B). מחקרים Credentialing באמצעות אימונוציטוכימיה ו היברידיזציה באתרו הראו כי גנים אלה היו מועשר מאוד הקרנה נוירונים (איור 4C) והמיטו, מבודדים ההקרנה הקרנה להציג גליקוליזיס מופחת ( איור 4D). נייר זה מזרז את ההתמקדות על תפקוד מיטוכונדריאלי מופחת הייצור ATP כתורם העיקרי לניוון סיבי ב-MS.

איור 4: נתוני Microarray ושיטות אימות מטה המתבצעות בקליפת מנוע של MS. (א) באשכולות הירארכיים של תעתיקים ששונו באופן משמעותי משליטה (C1-C6) ו-SPMS (MS1-MS6) דגימות קליפת המנוע של המחלה, בנפרד הקשורים למחלות גנים דפוסי ביטוי. בין התעתיקים הירדו בקליפת המנוע של MS, 26 שייכות לשרשרת התחבורה האלקטרונים (B). קומפלקס מיטוכונדריאלי (NDUFA6) mRNA ירד בנוירונים (n = 55-130) בקליפת מנוע MS (CII) לעומת שליטה (CI), ואילו צפיפויות plp mrna היו דומות בין שליטה (CIII) ו-MS (CIV) קליפת המוח. פעילות של מתחמי הובלה אלקטרונים I ו-III ירדו בשברים מיטוכונדריאלי מועשר מקליפת המנוע של MS חולים (n = 3) (D). הודפסה מודפס מ-Dutta et al.⁶ עם הרשאה. קווי שגיאה מייצגים את SEM; סרגל בקנה מידה של CI-IV הם 25 μm. * p < 0.05 מבחן tשל הסטודנטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פתוגנזה של תפקוד קוגניטיבי ב MS⁸. 40 כדי 60% מהחולים MS יש ירידה קוגניטיבית תפקוד ההנהלה מופחתת. זיהינו את ההיפוקמפוס, שהוא אתר פונקציונלי של זיכרון/למידה, כאתר משותף עבור deמיאלונציה ב-MS. אנחנו הבא לעומת הביטוי הגנטי העצבי בהיפוקמפוס מיאלואידית מיאלואידית היפומ, ומצא הנחות משמעותיות ב-mRNAs הנוירואליות קידוד חלבונים המעורבים זיכרון/למידה. הרחבנו את הנתונים הללו על ידי הוכחת כי בחירת microRNAs הם גדלו בהיפוקמפוס deמיאלואידית וכי אלה microRNAs יכול להקטין את הביטוי של קולטני גלוטמט. יש לנו לשכפל והרחיב אלה תצפיות מודלים מכרסמים. אנחנו הבא לעומת הביטוי הגנטי העצבי בהיפוקמפוס מיאלואידית מיאלואידית היפומ, ומצא הנחות משמעותיות ב-mRNA הצפנה חלבונים המעורבים בזיכרון/למידה.

איור 5: אוסף רקמות, ניתוח היסטולוגית ולימודי גנים בהיפוקמפוס של MS. פרוסות מוח המכילות ההיפוקמפוס נבחרו במהלך נתיחת הגופה (א) ואת ההיפוקמפוס האזור הסמוך יוסר (תיבת אדום) לניתוח נוסף. חיסוני עבור PLP הראה שימור של המיאלין בכל שליטה (ב) ו 40% של MS היפוקמאני (C). Deמיאלונציה נרחבת זוהה ב ~ 60% של היפוקמאני MS (D). כאשר לעומת שליטה היפוקמורים (E, G, I), אובדן עצבי משמעותי לא זוהה ב CA1, CA3, או CA4 אזורים של היפוקמורים MS deמיאלואידית (F, H, J) כפי שמוצג על ידי חור אימונוהיסטוכימיה. כפול תיוג אימונוללואומיאלין (חלבון בסיסי מיאלין (mbp), ירוק) ו אקסונים (SMI32, אדום) הראה אובדן של מיאלין (L) עם שימור יחסי של אקסונים (N) בהיפוקמפוס MS deמיאלואידית לעומת שליטה ההיפוקמפוס ( MBP, K; SMI32, M). אשכול כפול של רמות ביטוי mRNA מסודרים דגימות לאשכולות נפרדים מבוסס על סטטוס המיאלין (מיאלואידית ומלא מיאלואידית) ומיקום (היפוקמפוס נגד קליפת המנוע) (O). רמות mRNA גבוהות מצוינות על-ידי אדום וכחול מציין רמות ביטוי נמוכות. פאנלים C-O הותאמו מ-Dutta et al.⁸ עם הרשאה. B-D: 2 מ"מ, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

האפקטים הפתולוגיים של MRI משתנים¹². בעוד MRI הוא מחוון מוערך של אבחון MS ותגובה לטיפול, והוא גם מנבא של התקדמות המחלה MS, ההשפעה הפתולוגית של שינויי MRI מובנים בצורה גרועה. מחקרי ה-MRI שלאחר המוות. התמקדו בשני אמ. אר. איי מוחין ROIs החומר הלבן כי היו רק T2 היפראינטנסיבי (T2 בלבד) ו ROIs כי היה שילוב של T1 הפוינטסיטה, היפרעצימות T2, ויחס העברת מגנטוטיזציה (ה-MTR) (T2T1MTR). כ 45% של מוחין החומר הלבן T2-רק ROIs היו מיאלואידית, המאשרת את האופי הלא ספציפי שלהם. לעומת זאת, 83% של T2T1MTR ROIs היו באופן כרוני deמיאלואידית והופיעו כחורים שחורים. T1 וערכי ה-MTR הם חצי כמותיים וערכיהם מגוונים בהרחבה ב-T2T1MTR ROIs. אם אובדן של מיאלין הוא התורם היחיד לשינויים אלה MRI, אז הערכים צריכים להיות קבועים. מתואם לערכי ה-T1 והערכים של ה-MTR.

איור 6: יחס העברת מגנטיזציה (MTR) ויחס ניגודיות של T1 בצורה לינארית בהתאם לאחוז Na⁺/K⁺ atpase-חיוביים בנגעים MS כרונית. באופן כרוני-הנגעים deמיאלואידית ויטראז עבור Na⁺/K⁺ atpase (ירוק) מגוון כמעט 100% (א) לאפס (ב) ב נוירופילמנט (אדום). מספר רב של אקסונים ללא Na⁺/k⁺ atpase הגדילו את הקטרים (ב). השוואה בין אחוז Na⁺/K⁺ atpase-חיוביים בנגעים MS-deמיאלואידית כרוניות בקורלציה עם שלאחר המוות בעקבות ה-MTR (p < 0.0001, C) ו-T1 יחס ניגודיות (p < 0.0006, D). כל נקודת נתונים היא מנגע יחיד וכל צירוף ייחודי סמל הצבע מציין אחד המוחות למדו. מאזניים ברים = 5 μm. הועתק מצעיר ואח '¹² באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניוון מוחי בלתי תלוי. בדמימינציה¹¹ מבחינה היסטורית, ניוון מוחי ב-MS כבר נחשב כתוצאה deמיאלונציה. לימודי הדמיה של המוח, עם זאת, העלו את האפשרות כי ניוון נוירולוגי ו deמיאלונציה יכולים להיות אירועים עצמאיים. לאחרונה זיהינו אוכלוסיית משנה של מטופלים MS כי יש deמיאלונציה של חוט השדרה ואת קליפת המוח, אבל לא של החומר הלבן מוחין. אנו נטבע זה תת סוג של MS בתור MS מיאלוקורטיטי (MCMS). מקרי MCMS סיפקו פלטפורמה לחקור את הקשר בין מוחין לבין החומר הלבן לאיבוד המוח הנוירואליות. בהשוואה למיפתני השליטה, הפסד עצבי בקליפת הקווקז היה גדול יותר באופן משמעותי ביותר מאשר בטרשת נפוצה טיפוסית. בקרת רקמת המוח הושגה מהמחלקה לפתולוגיה במרפאת קליבלנד. מחקר זה מספק את הראיה הפתולוגית הראשונה עבור ניוון נוירואני בהעדר deמיאלונציה.

איור 7: הפסד עצבי בהיעדר חוסר מוחין החומר הלבן. מוכתם בכתמים סגולים באזור מסווג בודד כמו MS טיפוסית (A). הצפיפות העצבית הושוו ברבדים הקורטיקליים III, V ו-VI בכל אחד מחמשת האזורים המוצגים. נוירונים עם שטח גדול יותר מ 60 יקרומטר² (צהוב) מוצגים בתמונה מייצגת מקליפת הרקה הראשית (ב). התוויות עבור PLP והפצה של נגעים deמיאלואידית (החומר הלבן מודגש מודגשת בכחול; subpial deמאלונציה מודגשת בוורוד) בסעיפים המיספרה של אנשים עם MS אופייני (C) ו ms myeloקורטיטי (D ) מוצגים. מתאם משמעותי בין צפיפות עצבית מופחתת ומוגברת מוחית הנגע של המוח לבנה החומר היה נמצא MS אופייני, אבל לא ב-MS myeloקורטיטי (E); קווים מקווקווים מציינים 95% מרווח ביטחון (CI). IFG = הפיתול הקדמי הנחות. STG = פיתול הרקה העליון. INi = מבודדים נחותים. INs = מבודדים מעולים. CG = cingulate gyrus. מועתק מטראפ ואח '¹¹ באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משך רצף	תאור הרצף	שימוש ברצף
0:09	וקליזציה	לוקליזציה לרצפים הבאים
9:14	מגנטוטיזציה תלת ממדית הכינה הד מהיר (MPRAGE)	מבנה הדמיה מבנית להערכת מבנה המוח
5:14	שחזור נוזלים תלת-ממדי של נוזל היפוך (פלייר)	מערכת הזדהות עם נגעים בהערכת נגעים מרחבית
2:35	משוקלל 2D T2	מערכת הזדהות עם נגעים בהערכת נגעים מרחבית
5:12	מעבר הצבע התלת-ממדי של הד עם העברת מגנטיזציה לפני הדופק, (MT-ON)	לכאורה מידה של תוכן המיאלין ברקמת הופעה רגילה ומלא.
5:12	הד תלת-ממדי מעבר-הדרגתי מנזכר ללא העברת מגנטיזציה לפני הדופק, (MT-OFF)
0:27	מיפוי שדה של דיפוזיה זנסור (DTI)	מידה של דיפוזיה מים ברקמת המוח מחשבה לשקף את שלמות רקמת המוח.
10:27	דיפוזיה זנסור הדמיה (DTI) רב מעטפת
1:18	דיפוזיה זנסור הדמיה (DTI) רב מעטפת
39:48:00	סכום ביניים: CORE

טבלה 1: פרוטוקול הדמיה. בעקבות הנתיחה

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול ששימש להשיג ולעבד במהירות רקמות מ 150 אנשים עם MS. תכונה חשובה של פרוטוקול זה היא כי המדענים לנצל את הרקמה הם גם אחראי על הקמת הפרוטוקול וביצוע אוסף הרקמה. הדבר מספק גמישות בעמידה בצרכים המדעיים של פרוייקטי מחקר בודדים. כמה היבטים של פרוטוקול זה לשפר את השירות שלה. המטופלים בדרך כלל מאופיינים היטב לפני המוות, כפי שרבים מהם הופעלו על ידי נוירולוגים במרכז שלנו. צעד קריטי הוא עיבוד תרומות רקמות זמן קצר לאחר המוות, אשר מגביר את איכות הרקמה הקפואה לעומת כמה בנקים מוח אחרים. הדבר מאפשר מחקרים מולקולריים בעלי ערך רב בתיאור שינויים במוצרי הגנים הטרנסג והטרנסלקליים, החיוניים למתן תצפיות היסטולוגיות ואימונוטוקוכימיקלים. מינוף של נתונים מורפולוגיים/אימונולוציקליים ומולקולריים על פני מספר מקרים מגביר את האמינות של המסקנות. זה מומחש הטוב ביותר על ידי התיאור שלנו של שינויי גנים מיטוכונדריאלי בקליפת מוחין ושינויי גנים עצביים בהיפוקמפוס מיאלואידית. הרומן פרופילים גנים מפותחים בקצב מהיר את הרקמה הקפואה בבנק שלנו צריך לספק RNA באיכות גבוהה עבור רקמות וניתוח תא בודד.

היבט מוערך נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא פרוסות המוח הקצרות והקבועות. רקמות אלה חותכים לתוך 30 μm-עבה, מקטעים צף חינם. סעיפים אלה אידיאליים לשימוש במיקרוסקופיה מיקרוקלית כדי לנתח שני אנטיגנים או יותר בשלושה מימדים. דוגמאות טובות כוללות את האינטראקציה של תהליכים אוליגודנדרוציטים טרום מיאלואידית עם אקסונים הדיסטרודים בנגעים MS כרונית, כמו גם זיהוי של חיבורי אקסונים בודד כדי להיות נורות הנסיגה אקסונים. זה בניגוד לשימוש שגרתי של 7 μm-עבה מקטעים פרפין, שבו תמונות 3D אינם ריאלי. פרפין-רקמות מוטבעות יש ערך רב עבור כמה שאלות, במיוחד את הקוונפיקציה של צפיפות עצבית במיספרה 7 μm-מקטעים עבים. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו לעיבוד רקמות מגוונים ומספקים גמישות כדי להבטיח רקמות קבועות וקפואות במהירות.

מאפיין ייחודי נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא ה-MRI של המוח באתרו. המוח MRIs הם ביואריקר. חסר תחליף של מחלת הטרשת נפוצה לכן חיוני לבסס את האפקטים הפתולוגיים של אותות MRI חריגים. המחקרים שלנו הקימו כי הן T2 בלבד ו T2T1MTR ROIs הן לעתים קרובות מיאלואידית. ממצא זה תומך בצורך ביותר שיטות דימות ספציפיות יותר, אשר מבחינים באופן מהימן בין החומר הלבן של המוח המיאלואידית והמיאלואידית. MRI נראה רגיש לזיהוי של מיאלין, אבל המחקרים שלנו מדגימים כי אפילו שילוב של T1/T2/MTR אינו ספציפי לזיהוי מיאלונציה. הפרוטוקול שלנו לאחר המוות מספק פלטפורמה אידיאלית לבדיקת היכולת של שיטות דימות חדשות כדי להבחין בין החומר הלבן המוח המנטול והמיאלואידית. MRI מספק גם את הרכב האידיאלי לתרגום של תוצאות המדע הבסיסי לתוך הפרקטיקה הקלינית, בהינתן השימוש ב-MRI במחקר הטרנסלאליות שלנו והשימוש הקליני הנרחב שלה בחולים חיים.

בעוד חיתוך קצר, ארוך קבוע, כמו גם פרוסות קפואות מציע יתרון לעיבוד רקמות במצבים מרובים עבור מחקרים שונים, יש כמה מגבלות עם שיטה זו. ייתכן שהערכת כולו של מבנה עשויה להיות מוגבלת כאשר חלקים ממנו עשויים להיות מעובדים באופן שונה בפרוסות סמוכות. הנפח הגדול של קופת הרקמה, עם זאת, מציע את היכולת לחקור מבנה של עניין בנושאים מרובים כדי לשפר את הדגימה. מגבלה כללית נוספת למחקרים ניצול רקמות שלאחר המוות היא שהם חוצים את החתך. מסקנות בנוגע לתזמון והתקדמות של שינויים צריכים להתפרש בהקשר זה. ייתכנו הטיית בחירה לחולים שתורמים את הרקמות שלהם, אשר עשויים להגביל את הכללה של נתונים לכל המטופלים עם MS. מכיוון שרוב התורמים מתים מסיבוכים של MS מתקדמת, זה לא יכול להיות מתאים להסיק ממצאים מהחולים האלה לאלה בשלבים המוקדמים של MS. עם זאת, קיבלנו רקמות מחולים צעירים שמתו מתנאים שאינם הקשורים ל-MS (כלומר, אוטם שריר הלב חריפה, מנת יתר של התרופה, התאבדות). היקף הפרוטוקול שלנו אינו כולל דגימת איברים אחרים (למשל, מח עצם ומערכת העיכול) אשר היו מעורבים ב-MS. אנו מאמינים כי העוצמות של התוכנית עולה במידה רבה על מגבלותיו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Biotinylated goat anti-mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200	1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	BA-1000	1:500 dilution.
Biotinylated goat anti-rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400	1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208
Glial fibrillary acid protein (GFAP)	Dako	Z0334	1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382
HuR, mouse IgG, 3A2 clone	Santa Cruz	SC-5261	1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43	Dako	Mo746	1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating. RRID: AB_2313661
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)	Biolegend	801701	1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating. RRID: AB_2564642
Phosphorylated neurofilament (SMI31)	Biolegend	801601	1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating. RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP)	Gift from Wendy Macklin		1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.
Reagents
125 mm filter paper	Whatman	1452-125	For filtering PFA.
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320	Electron microscopy grade.
Cytoseal	ThermoScientific	8310-16
Ethylene glycol	Fisher Chemical	BP230-4
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	400 mL/2 L Cryoprotection solution.
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore-Sigma	SLHV033RB
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19200	Prills form.
Polyvinylpyrolidone (PVP-40)	Fisher Chemical	BP220-212
Sodium azide	Fisher Chemical	S227I	2 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S0876	98.8 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate mono basic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	14.352 g/2 L Sorenson's buffer.
Sucrose	Sigma-Aldrich	PVP40-500G
VectaStain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100	1:1,000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819
Waterproof drawing black ink	Higgins	44201
Xylene	Fisher Chemical	X3S	Histological grade.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma	Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS	Siemens Healthineers