Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Рассеянный склероз является воспалительным демиелинизирующее заболевание без лечения. Анализ тканей мозга дает важные подсказки для понимания патогенеза болезни. Здесь мы обсуждаем методологию и вниз по течению анализ ms мозговой ткани, собранные через уникальную программу быстрого вскрытия в эксплуатации в клинике Кливленда.
Мы описываем программу быстрого донорства тканей для людей с рассеянным склерозом (MS), которая требует, чтобы ученые и техники были по вызову 24/7, 365 дней в году. Участники соглашаются пожертвовать свой мозг и спинной мозг. Большинство пациентов последовали неврологи в Кливлендской клинике Меллен центр лечения и исследования MS. Их клинические курсы и неврологические нарушения хорошо характеризуются. Вскоре после смерти, тело транспортируется в ЦЕНТР MS Imaging, где мозг сканируется на месте 3 T магнитно-резонансной томографии (МРТ). Затем тело переносится в отделение для вскрытия, где удаляются мозг и спинной мозг. Мозг разделен на два полушария. Одно полушарие сразу же помещается в нарезку и альтернативные ломтики толщиной 1 см либо фиксируются в 4% параформальдегида в течение двух дней или быстро заморожены в сухом льду и 2-метилбутана. Короткие фиксированные ломтики мозга хранятся в растворе криоконсервации и используются для гистологического анализа и иммуноцитохимического обнаружения чувствительных антигенов. Замороженные ломтики хранятся при -80 градусах Цельсия и используются для молекулярных, иммуноцитохимических и на месте гибридизации/РНК-областей исследований. Другое полушарие помещается в 4% параформальдегида в течение нескольких месяцев, помещается в нарезку коробки, повторно сканируется в 3 T магнитно-резонансного (Mr) сканер и нарезанный на сантиметровые ломтики. Посмертные изображения МР-изображения (МРТ) регистрируются с 1 см толщиной ломтиков мозга для облегчения корреляции МРТ-патологии. Все ломтики мозга фотографируются и мозг белых поражений определены. Спинной мозг разрезается на 2 см сегментов. Альтернативные сегменты фиксируются в 4% параформальдегида или быстро замораживаются. Быстрая закупка посмертных тканей MS позволяет патологических и молекулярных анализов мозга ms и спинного мозга и патологических корреляций аномалий МРТ головного мозга. Качество этих быстро обработанных посмертных тканей (обычно в пределах 6 ч смерти) имеет большое значение для исследований MS и привело к многим высокоэффективных открытий.
Один из лучших способов изучения болезни является изучение самой больной ткани. Это создает проблемы для тех, кто изучает заболевания центральной нервной системы (ЦНС). Биопсия больного головного и спинного мозга крайне редки и обычно связаны с нетипичными случаями. Показатели вскрытия лиц с заболеваниями ЦНС резко снизились в последние годы, и при выполнении, они часто не обеспечивают быструю закупку тканей. Эти проблемы привели к созданию заболеваний в центре банков мозга, в том числе несколько сосредоточены на сборе тканей от людей с рассеянным склерозом (MS). MS является воспалительным опосредованным заболеванием ЦНС, которое разрушает миелин, олигодендроциты (миелин формирования клеток), нейронов и аксонов. Большинство пациентов с рассеянным склерозом имеют двух-phasic курс заболевания, который начинается с приступов неврологической инвалидности с переменной восстановления, что в конечном итоге превращается в постепенно прогрессирующее заболевание, которое, вероятно, нейродегенеративных в природе1. Для большинства пожертвованных мозгов MS, посмертные интервалы (PMI) между смертью и обработкой тканей превышают 24 ч. Хотя эти ткани предоставили ценную информацию о патологических изменениях в мозге MS, они не подходят для более продвинутых молекулярных исследований, которые могут обеспечить мощное понимание патофизиологии болезни. Это особенно относится к исследованиям генного профилирования, которые требуют нетронутой РНК.
Чтобы преодолеть ограничения, о которых говорилось выше, мы разработали программу быстрого донорства тканей, которая позволяет проводить МРТ/патологические корреляции. Этот протокол обеспечивает хорошо сохранившиеся ткани, пригодные для современных молекулярных исследований, и позволяет прямое сравнение патологии мозга и аномалий МРТ в мозге MS. Кливлендская клиника Рассеянный склероз Ткань Пожертвование Программа существует уже более 20 лет. Эта программа быстрого донорства тканей закупает мозги и спинной мозг у людей с MS и другими связанными аутоиммунными неврологическими заболеваниями. Программа направлена на получение на месте МРТ в течение 6 ч от смерти, а затем удаление головного и спинного мозга для обработки тканей.
Набора
Пожертвования добываются либо через домортное согласие, полученное непосредственно от пациентов (предварительно согласованных), либо от ближайших родственников после смерти. Предварительно согласованных пациентов, как правило, определены из клинической популяции в Меллен Центр лечения рассеянного склероза и исследований в Кливленде, штат Огайо. Хотя предпочтение в наборе в программе быстрого донорства тканей отдается пациентам, которые были соблюдены в продольных исследованиях, она открыта для всех пациентов, замеченных в центре. Участникам, которые зачисляются до смерти, даются инструкции для членов семьи или медицинских работников связаться с исследовательской группой, либо во время смерти, либо когда смерть считается неизбежной. Второй метод для людей, чтобы войти в программу донорства тканей в момент смерти через согласие ближайших родственников. Штат Огайо требует, чтобы смерть была передана в федеральную организацию по закупкам органов под названием LifeBanc, которая действует в 20 округах северо-восточного Штата Огайо. LifeBanc экраны всех смертей для диагностики MS, который является исключением для донорства органов. Были приняты меры для LifeBanc уведомить следователей из программы пожертвования ms ткани для всех смертей с соответствующим диагнозом MS, происходящих в радиусе 75 миль от клиники Кливленда. Ближайшие родственники и персонал больницы затем связаться с Ткань Пожертвование Программа персонала и согласие получено для донорства тканей головного и спинного мозга. Эти два метода вербовки анте-мортам и посмертно через LifeBanc приводят примерно к 10-12 донорам мозга в год. Корректировки вносятся в верхний возрастной предел смерти для управления числом рефералов, полученных от LifeBanc.
Закупка пожертвований
Программа требует 24 ч охвата, 365 дней в году членами программы донорства тканей для закупок тканей. Централизованная система уведомления о пожертвовании тканей/пейджер/мобильное устройство используется клинической командой, занимающейся пожертвованиями тканей. LifeBanc предоставляется номера для контакта дежурного персонала для программы донорства тканей. Члены Церкви уведомляются о смерти от поставщиков медицинских услуг/ближайших родственников (предварительно согласованных) или LifeBanc и других справочных источников. Во-первых, определение времени смерти и осуществимость донорства тканей производится. Смерти затем проверяются на состояние, которое потенциально приводит к некачественной ткани, включая длительную предсмертную гипоксию, массивную разрушительную ткань мозга (например, большое внутричерепное кровоизлияние, обширные би-полушарические инсульты, обширную опухоль бремя), длительная поддержка аппарата искусственной вентиляции легких (Зтт;3 дня) и длительное применение вазоактивных средств (Зтт;3 дня) до смерти. Когда медицинский эксперт участвует в смерти, исследование невролог может поговорить с медицинским экспертом, чтобы изучить способ получения своевременной ткани без ущерба для ответственности медицинского эксперта. Если жизнеспособная ткань считается присутствующая, то получается письменное согласие (если не получено досмерти) и готовятся к транспортировке тела. Ранее контракт умерших транспортных услуг, то связался для транспортировки на Объекты МРТ в клинике Кливленда. Меры по обеспечению того, чтобы тело оставалось при комнатной температуре и не помещалось в холодильные, так как более низкие температуры тела связаны с изменениями характеристик Сигнала МРТ.
Клиническая история
Клиническая история включает в себя подробную информацию о диагностике РАССЕЯНного см, нашествии симптомов, используемых методах лечения, результатах клинических и параклинических испытаний (вызванные потенциалы, результаты спинномозговой жидкости, оптическая компореная томография), функциональный композит рассеянного склероза , и расширенная шкала статуса инвалидности (EDSS; фактические или оценкам), которые собираются из медицинской документации (там, где это возможно), и прямое интервью ближайших родственников. Также собираются домортизмМ.
Этот протокол был одобрен Кливлендской клиникой Институциональный обзор совета и следует руководящим принципам Кливлендской клиники человеческих исследований этики комитета.
1. На Ситу МРТ
2. Вскрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: После МРТ на месте, тело транспортируется в морг для извлечения мозга и спинного мозга путем динера и обработки тканей членами лаборатории.
3. Патология
ПРИМЕЧАНИЕ: Короткие фиксированные ломтики правого полушария, а также длиннофиксированное левое полушарие (размещенное в 4% ПФА в течение нескольких месяцев) либо разрезаются на 30 мкм разделов (именуемых как свободно плавающие) или встроены в парафин и разрезаются в виде 12-14 мкм (именуемых как парафин-встроенный). Эти разделы обрабатываются обычно с протеолипидным белком (PLP) для обнаружения демиелинизирующих поражений и основных комплексов гистосовместимости II (MHC-II) для иммунной активности с использованием метода диаминобензидина (DAB). Эти протоколы были стандартизированы и использованы в нескольких публикациях2,3,4,5,6,7,8 , 10 Лет , 11 Год , 12.
4. Парафин-встроенных полушария разделы: DAB окрашивания
5. МРТ/патологические корреляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сопоставления МРТ с патологией, мы сначала выполняем ex vivo МРТ давно фиксированного нетронутыми полушария мозга (шаг 2,9 выше) в регулируемой коробке с МРТ-видимых маркеров, указывающих на нарезку слотов. Затем мы нарезаем мозг и фотографируем 1 см ломтики, чтобы обеспечить совместное регистрацию МРТ на месте на отдельные ломтики мозга. Затем мы можем проводить МРТ-анализ, где области, представляющие интерес (ROIs) определяются на МРТ для прямого анализа тканей. Мы также можем выполнять гистопатологические анализы, где ROIs идентифицируются на ткани (например, поражения белого вещества, белое вещество без демиелинизации и т.д.), а затем характеризуется совместно локализованных мер МРТ (Таблица 1).
Как уже упоминалось выше, почти половина полушария головного мозга заморожена и доступна для молекулярных исследований с использованием ДНК, РНК или белка. Исторически сложилось так, что исследования с использованием посмертных тканей мозга, как было показано, влияют на предсмертные условия, возраст, пол, рН ткани, целостность мРНК (RIN), посмертный интервал (PMI), диагностическая определенность, использование сопутствующих веществ, а также предварительное лечение лекарства статус23. На основе исследований с использованием тканей мозга, ДНК и белок, как представляется, зависит от меньшей степени по сравнению с РНК. Основываясь на нашем опыте, РНК изоляции и вниз по течению анализа, однако, было установлено, что в наибольшей степени страдают от предсмертных условиях и посмертного интервала ткани мозга. Поэтому мы обсуждаем некоторые условия, которым следует следовать для проведения анализа на основе РНК с использованием посмертных тканей MS.
Для всех наших исследований, после того, как мозг собирается при вскрытии, он нарезается (1 см толщиной), а затем либо фиксируется в 4% параформальдегида для морфологических исследований или быстро заморожены для биохимического анализа. Все блоки ткани охарактеризованы для демиелинизмирования иммуноспоминаемством используя PLP как описано выше. Схема репрезентативного анализа показана на рисунке 1. Ткань разделы рассматриваются на наличие белого вещества поражений(рисунок 1A). Выбранные области окрашены для иммунной активности(рисунок 1B) и демиелинизм (рисунок1C). Замороженная ткань устанавливается на криостат(рисунок 1D)и замороженные 30 мкм разделы вырезать. За этим следует сбор 3-4 последующих разделов, отделение от прилегающих тканей и хранение для ДНК, РНК или белковой изоляции. Используя этот протокол, мы успешно изолировали ДНК24,25,РНК5,6,7,8,9, а также белки26. Хотя основные выводы из некоторых исследований, анализирующих РНК из мозга MS обсуждаются, вот некоторые из вопросов, связанных с анализом РНК посмертного мозга MS.
Рисунок 1: Сбор образцов для анализа мРНК. (A) Ткань вскрытия выбрана для анализа. Выбираются участки ткани и иссена часть ткани. Все разделы окрашены (B) MHC-II (Основной комплекс гистосовместимости (MHC) класса II HLA-DR CR3/43) антитела для обнаружения воспалительной активности и с (C) протеолипидбелка (PLP) для определения состояния миелина с помощью опубликованных протоколов. Исходя из состояния миелина, блок забиваетсяскальпелем (D ). Разделы (60 мкм)вырезаются (E) и области, которые были ранее забил удаляются, разделены в трубках, и помечены (F). ПЛП и MHC-II пятна повторяются после каждых 5 разделов для обеспечения надлежащего сбора тканей. Отмечается нормальное появление белого вещества (NAWM), а поражения белого вещества (WML) очерчены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Аксональная трансекция при поражениях MS10. Первоначальная научная направленность этой программы была посвящена характеристике клеточных компонентов демиелинизированных поражений белой материи. Среди локализованных антигенов были нефосфорилированные нейрофиламенты (NFs). Большинство NFs фосфорилированы в миелинированных аксонов. При демиелинации аксоны дефосфорилируются. Мы обнаружили ожидаемое выражение нефосфорилированных NFs в демиелинизированных аксонах. В острых поражений MS, многие из этих демиелинированных аксонов закончился как аксональные лампы опрокидкления (Рисунок 2A), которые отражают проксимальные концы трансэктированных аксонов. Трансцектонные аксоны превышают 11000 мм3 в острых поражений по сравнению с соседними нормальными регионами10. Эти наблюдения помогли катализировать сдвиг парадигмы в исследованиях MS, которые переехали области к характеристике нейродегенерации в качестве основной причины постоянной неврологической инвалидности у людей с MS.
Рисунок 2: Аксональная транесекция во время воспалительной демиелинации. Аксональная трансекция возникаетво время воспалительной демиелинации (A, наконечники стрел) и индуцирует образование терминальных аксональных (А, стрел). При количественной оценке (B), трансected аксоны в изобилии в MS поражений и, как представляется, коррелируют с воспалительной активностью поражения. Панель A воспроизведена из Trapp et al.10 с разрешения. Красный: протеолипный белок, зеленый: Антинефосфорилированный нейрофиламент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Ремиелинизм в хронических мозгах MS3. Ремиелинизм может быть надежным на ранних стадиях MS. Многие хронические поражения MS, однако, не remyelinated. Мы исследовали ли наличие клеток-прародителей олигодендроцитов (ОПК) или генерации новых олигодендроцитов ограничивает ремиелинизацию хронически демиелинизированных поражений белой материи. Хотя плотность OPC часто снижалась, они присутствовали во всех хронически-демиелинизированных поражениях3. Новоисжинные олигодендроциты также присутствовали во многих хронических поражениях РАССЕЯНного синдрома. Олигодендроцитные процессы, связанные с, но не миелинат демиелинированных аксонов(рисунок 3). Эти исследования показывают, что ОЗК и их способность производить новые олигодендроциты не ограничивают ремиелинизм хронических поражений белой материи. Мы предположили, что хронически демиелинизированные аксоны, которые часто казались дистрофическими, не были восприимчивы к ремиелинации вновь произведенными олигодендроцитами.
Рисунок 3: Процессы предварительноми миелинизирующих олигодендроцитов, связанных с аксоном. Показаны конфокальные микрографы поражений MS, окрашенные антителами PLP (красные в группах A, B)и антителами нейрофиламента (зеленые в группах A, B). Предварительно миелинизирующая олигодендроцит (красный цвет в панели А) в субвентрикулярной зоне (СВЗ) расширенные процессы в область демиелинизированных аксонов (зеленый в панели А) при хроническом поражении рассеянного склерозом. Многие из этих процессов (стрелки в панели А) вращались вокруг аксонов, как показано при более высоком увеличении (Панель B). Шкала баров представляют 20 мкм (A) и 5 мкм (B). Воспроизводится из Чанг и др.3 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Митохондриальная дисфункция у MS6. Мы провели объективный поиск нейрональных изменений генов в быстро замороженной моторной коре, полученной от хронических пациентов с рассеянным склерозом(рисунок 4A). Непредвзятый поиск этого набора данных выявил значительное сокращение в 23 ядерных кодированных митохондриальных мРНК в MS(рисунок 4B). Credentialing исследования с использованием иммуноцитохимии и на месте гибридизации показали, что эти гены были высоко обогащены в корковых нейронов проекции(Рисунок 4C) и что митохондрии изолированы от проекции аксонов дисплей снижение гликолиза ( Рисунок 4D). Эта статья катализировала акцент на митохондриальной дисфункции и сокращение производства АТС в качестве основного вклада в аксональной дегенерации в MS.
Рисунок 4: Данные Microarray и методы проверки ниже по течению, выполняемые в моторной коре MS. (A) Иерархическая кластеризация значительно измененных транскриптов из контрольного (C1-C6) и SPMS (MS1-MS6) образцов моторной коры, отдельно поддерживающих связанные с болезнью модели экспрессии генов. Среди уменьшенных транскриптов в коре двигателя MS, 26 принадлежали к цепи перехода электрона (B). Митохондриальный комплекс I (NDUFA6) мРНК был уменьшен в нейронах (n No 55-130) в мышечной коре(CII) по сравнению с контролем (CI ), в то время как плотность PLP mRNA были похожи между контролем (CIII ) и MS(CIV ) коры головного мозга. Активность электронных транспортных комплексов I и III была снижена в митохондриальных обогащенныхфракциях из моторной коры пациентов с рассеянным склетом (n No 3) (D). Перепечатано из Dutta et al.6 с разрешения. Бары ошибок представляют SEM; Шкала бар в CI-IV являются 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Патогенез когнитивной дисфункции в MS8. Сорок до 60% пациентов с рассеянным склепом имеют когнитивное снижение и снижение исполнительной функции. Мы определили гиппокамп, который является функциональным сайтом памяти / обучения, как общий сайт для демиелинации в MS. Затем мы сравнили экспрессию нейронов генов в миелинизированных и демиелинизированных гиппокампах и обнаружили значительное снижение нейронных мРНК, кодирующих белки, участвующие в памяти/обучении. Мы расширили эти данные, продемонстрировав, что некоторые микроРНК увеличиваются в демиелинизированном гиппокампе и что эти микроРНК могут уменьшить экспрессию глутамата рецепторов. Мы воспроизвели и расширили эти наблюдения в моделях грызунов. Затем мы сравнили экспрессию нейронов генов в миелинизированных и демиелинизированных гиппокампах и обнаружили значительное сокращение нейрональных белков, кодирующих мРНК, участвующих в памяти/обучении.
Рисунок 5: Сбор тканей, гистологический анализ и исследования экспрессии генов в ГИПпокампе MS. Мозг ломтики, содержащие гиппокампа выбираются во время вскрытия (A) и гиппокампа и прилегающих области удаляется (красная коробка) для дальнейшего анализа. Иммуносохранение для PLP показали сохранение миелина во всех контроля (B) и 40% MS гиппокампа (C). Обширная демиелинизнация была обнаружена в 60%ms гиппокампа (D ). По сравнению с контролем гиппокампа (E, G, I), значительные потери нейронов не было обнаружено в CA1, CA3, или CA4 регионах демиелинизированных MS гиппокампа (F, H, J), как показано на иммуногистохимии HuR. Двойная маркировка иммунофлуоресценции для миелина (миелин основной белок (MBP), зеленый) и аксоны (SMI32, красный) показали потерю миелина (L) с относительной сохранением аксонов (N) в MS демиелинированный гиппокамп по сравнению с контролем гиппокампа ( MBP, K; SMI32, M). Двойная кластеризация уровней экспрессии мРНК организовала образцы в дискретные кластеры на основе статуса миелина (миелинированный и демиелинированный) и местоположения (гиппокамп против моторной коры) (O). Высокие уровни мРНК обозначены красным и синим цветами, что означает низкий уровень экспрессии. Панели C-O адаптированы из Dutta и др.8 с разрешения. B-D: 2 мм, E-J: 100 мкм, K-N: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Патологические корреляты МРТ изменяются12. Хотя МРТ является ценным показателем диагностики MS и ответ на лечение, а также предиктором прогрессирования болезни MS, патологические корреляты изменений МРТ плохо изучены. Наши посмертные МРТ-исследования были сосредоточены на двух МРТ-роуис. Церебральная белая материя ROIs, которые были только T2 гиперинтенсивных (T2 только) и ROIs, которые имели сочетание T1 гипоинтенсивность, T2 гиперинтенсивность, и снижение коэффициента передачи намагничиваемкости (MTR) (T2T1MTR). Приблизительно 45% церебрального белого вещества T2 только ROIs были миелинированы, подтверждающие их неспецифический характер. В отличие от этого, 83% T2T1MTR ROIs были хронически демиелинированы и появились как черные дыры. Значения T1 и MTR являются полуколичественными, и их значения сильно различаются в ROIs T2T1MTR. Если потеря миелина является единственным фактором, способствующим этим изменениям МРТ, то значения должны быть постоянными. Опухшие демиелинированные аксоны коррелируют со значениями T1 и MTR.
Рисунок 6: Коэффициенты переноса намагничивания (MTR) и коэффициентыконтрастности T1 линейно коррелируют с процентом Na q /K, аксонов ATPase-положительных при хронических поражениях MS. Хронически-демиелинированные поражения, окрашенные для Naq/K, АТПас (зеленый) варьировались от почти 100% (A) до нуля (B) в нейрофиламенте (красный). Многие аксоны без Naq/Kq ATPase имели увеличенные диаметры (B). Сравнение процентного соотношения naq/K- ATPase-положительных аксонов в хронически-демиелинизированных поражениях MS, коррелированных с количественными посмертными MTR (p qlt; 0.0001, C) и T1 контрастными коэффициентами (p q lt; 0.0006, D). Каждая точка данных происходит от одного поражения, и каждая уникальная цветово-символьная комбинация обозначает один из изученных мозгов. Весы баров 5 мкм. Воспроизводится из молодых и др.12 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Нейродегенерация не зависит от демиелинации11. Исторически, нейродегенерации в MS было полагают, в результате демиелинации. Исследования изображений мозга, однако, подняли возможность того, что нейродегенерации и демиелинации могут быть независимыми событиями. Недавно мы определили субпопуляцию пациентов с рассеянным склеистой инфекцией, которые имеют демиелинизацию спинного мозга и коры головного мозга, но не из белого вещества головного мозга. Мы придумали этот подтип MS как миелокортикальный MS (MCMS). Случаи MCMS предоставили платформу для исследования взаимосвязи между церебральным белым веществом демиелинации и корковой потери нейронов. По сравнению с контролем кортиков, корковые потери нейронов был значительно больше в КОРТики MCMS, чем в типичных кортиков MS. Контрольная ткань мозга была получена из патологического отделения клиники Кливленда. Это исследование предоставляет первые патологические доказательства нейродегенерации при отсутствии демиелинации.
Рисунок 7: Потеря нейронов при отсутствии демиелинации белого вещества. Кресил фиолетовый-окрашенные корональной полушарии раздел от отдельных классифицируется как имеющие типичные MS (A). Плотность нейронов сравнивалась в корковых слоях III, V и VI в каждой из пяти обозначенных областей. Нейроны с площадью более 60 мкм2 (желтый) показаны на репрезентативном изображении из верхней височной коры (B ). Маркировка для PLP и распределение демиелинизированных поражений (бело-материальная демиелинизнация выделена синим цветом; субпиальная демиелинизнациявыделена розовым цветом) в секциях полушария от лиц с типичным MS ( C) и миелокоркическим MS (D ) показаны. Значительная корреляция между снижением плотности корковых нейронов и увеличение мегенного белого вещества поражения был обнаружен в типичных MS, но не в миелокортикных MS (E); разбитые линии указывают 95% доверительный интервал (CI). IFG - нижняя лобная извилина. STG - превосходная височная извилина. ИНИ и низшие инсула. ИНН и превосходная инсула. CG и cingulate извилина. Воспроизведено из Траппа и др.11 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Продолжительность последовательности | Описание последовательности | Использование последовательности |
0:09 | Локализатор | Локализация для последующих последовательностей |
9:14 | 3D-намагнижение подготовило быстрое градиентное эхо (MPRAGE) | Структурная томная оценка структуры мозга |
5:14 | 3D-жидкость сослабленной инверсии восстановления (FLAIR) | Оценка резионного сегмента резконизации резкона резкона |
2:35 2035 | 2D T2 взвешенный | Оценка резионного сегмента резконизации резкона резкона |
5:12 17.04.2018 | 3D градиент-напомнил эхо с намагничиваемой передачи предварительного импульса , (MT-ON) | Предполагаемая мера содержания миелина в нормальном появлении и поражении тканей |
5:12 17.04.2018 | 3D градиент-напомнил эхо без намагничиваемого передачи передачи предварительного импульса , (MT-OFF) | |
0:27 | Диффузионное тензорное изображение (DTI) полекартирование | Измерение диффузии воды в тканях мозга, как считается, отражает целостность тканей мозга. |
10:27 20.04.2017 Источник: | Диффузионная тензорная визуализация (DTI) мультиоболочка | |
13:18 | Диффузионная тензорная визуализация (DTI) мультиоболочка | |
39:48:00 | СУБTOTAL: ЯДРО |
Таблица 1: Протокол посмертной визуализации.
Мы описываем протокол, который был использован для быстрого закупки и обработки тканей из более чем 150 человек с MS. Важной особенностью этого протокола является то, что ученые, которые используют ткани также отвечает за создание протокола и выполнения сбора тканей. Это обеспечивает гибкость в удовлетворении научных потребностей отдельных исследовательских проектов. Некоторые аспекты этого протокола повышают его полезность. Пациенты, как правило, хорошо характеризуются до смерти, так как многие из них были следуют неврологи в нашем центре. Важным шагом является обработка тканей пожертвования вскоре после смерти, что повышает качество замороженных тканей по сравнению с некоторыми другими банками мозга. Это позволяет молекулярные исследования, которые имеют большое значение в описании изменений в транскрипционных и трансляционных генных продуктов, которые имеют важное значение для обоснования гистологических и иммуноцитохимических наблюдений. Использование морфологических/иммуноцитохимических и молекулярных данных в нескольких случаях повышает надежность выводов. Это лучше всего иллюстрируется нашим описанием изменений митохондриального гена в коре головного мозга и нейрональных изменений генов в демиелинизированных гиппокампах. Новые протоколы профилирования генов разрабатываются быстрыми темпами, и замороженные ткани в нашем банке должны обеспечить высококачественную РНК для анализа тканей и одноклеточных клеток.
Другим ценным аспектом нашего протокола является короткий фиксированный мозг ломтиками. Эти ткани разрезаются на 30 мкм толщиной, свободно плавающие секции. Эти разделы идеально подходят для использования конфокальной микроскопии для анализа двух или более антигенов в трех измерениях. Хорошими примерами являются взаимодействие домиелинирующих процессов олигодендроцитов с дистрофическими аксонами при хронических поражениях РАССЕЯНного склерозом, а также выявление одноаксональных соединений с трансектированными аксонаальными лампами опрокидки. Это в отличие от обычного использования 7 мкм толщиной парафина разделов, где 3D-изображения не представляется возможным. Парафин-встроенные ткани имеют большое значение для некоторых вопросов, особенно количественной нейронной плотности в полушарии 7 мкм толщиной разделов. Поэтому наши протоколы обработки тканей разнообразны и обеспечивают гибкость для обеспечения фиксированных и быстро замороженных тканей.
Еще одной уникальной особенностью нашего протокола является посмертная МРТ головного мозга на месте. МРТ мозга являются незаменимым биомаркером болезни MS. Поэтому необходимо установить патологические корреляты аномальных сигналов МРТ. Наши исследования показали, что как T2 только и T2T1MTR ROIs часто миелинизированы. Этот вывод поддерживает необходимость более конкретных методов визуализации, которые надежно различать миелинированных и демиелинизированных мозгового белого вещества. МРТ, как представляется, чувствительны для обнаружения миелина, но наши исследования показывают, что даже сочетание T1/T2/MTR не является специфическим для выявления миелинации. Наш посмертный протокол обеспечивает идеальную платформу для тестирования способности новых методов визуализации различать миелинизированное и демиелинизированное церебристое белое вещество. МРТ также является идеальным средством для перевода результатов фундаментальной науки в клиническую практику, учитывая использование МРТ в наших трансляционных исследованиях и ее широкое клиническое применение у живых пациентов.
В то время как резки короткие и длинные фиксированные, а также замороженные ломтики предлагает преимущество для обработки тканей в нескольких режимах для различных исследований, Есть некоторые ограничения с этим методом. Оценка всей структуры может быть ограничена, поскольку ее части могут быть обработаны по-разному на смежных срезах. Большой объем ткани банка, однако, предлагает возможность исследовать структуру интереса в нескольких предметах для улучшения выборки. Еще одно общее ограничение исследований с использованием посмертных тканей заключается в том, что они являются поперечными. Выводы, касающиеся сроков и хода изменений, должны толковаться в этом контексте. Там может быть выбор смещения для пациентов, которые жертвуют свои ткани, которые могут ограничить обобщение данных для всех пациентов с MS. Поскольку большинство доноров умирают от осложнений передовых MS, это не может быть целесообразным экстраполировать выводы из этих пациентов на более ранних стадиях MS. Тем не менее, мы получили ткани от молодых пациентов, которые умерли от не связанных с МС условиях (т.е. острый инфаркт миокарда, передозировка наркотиков, самоубийство). Сфера действия нашего протокола не включает выборку других органов (например, желудочно-кишечного тракта и костного мозга), которые были вовлечены в РАССЕЯНный склепом. Мы считаем, что сильные стороны программы значительно перевешивают ее ограничения.
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Кристофера Нельсона за редакционную помощь. Программа вскрытия частично поддерживается R35 грант NS097303 в БДТ. Работа в лаборатории РД поддерживается грантами от NINDS (NS096148) и Национального общества рассеянного склероза, США (RG 5298).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400 mL/2 L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2 g/2 L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8 g/2 L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352 g/2 L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1,000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены