Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקולים אלה פותחו כדי לנתח מורפולוגיה עדשה קורטיקלית, שלמות מבנית של התפרים העדשה דג זברה בעדשות קבועות וחיות למדוד את המיקום של גרעין העדשה דג זברה לאורך הציר האחורי הקדמי.

Abstract

דג דג זברה מתאים באופן ייחודי מניפולציה גנטית vivo הדמיה, מה שהופך אותו מודל פופולרי יותר ויותר עבור מחקרים גנטיים הפוכה ועבור דור של transgenics עבור הדמיה vivo . אלה יכולות ייחודי להפוך את דג זברה פלטפורמה אידיאלית כדי ללמוד התפתחות עדשה עינית ופיזיולוגיה. הממצאים האחרונים שלנו כי aquפורטל in-0, Aqp0a, נדרש עבור היציבות של תפר העדשה הקדמית, כמו גם עבור שינוי של גרעין העדשה אל מרכז העדשה עם הגיל הובילו אותנו לפתח כלים במיוחד מתאים לנתח את המאפיינים של עדשות דג זברה. כאן אנו מתווה שיטות מפורטות לניתוח עדשות שניתן להחיל הן על הזחל והן עדשות למבוגרים, כדי להכין אותם ניתוח היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה והדמיה. אנו מתמקדים בניתוח של שלמות תפר עדשה ומורפולוגיה תא קורטיקלית ולהשוות נתונים שנוצרו מעדשות גזור עם נתונים שהתקבלו מתוך vivo הדמיה של מורפולוגיה עדשה האפשרי על ידי קו מגנטי הרומן הטרנסגניים עם מגנטית סמן פלורסנט מקודד. ניתוח לגזור עדשות בניצב הציר האופטי שלהם מאפשר כימות של המיקום היחסי של גרעין העדשה לאורך הציר הקדמי האחורי. התנועה של הגרעין העדשה מעמדה קדמית ראשונית למרכז נדרש עבור עדשה רגילה אופטיקה בוגרים zebrafish. כך, מידה כמותית של העמדה הגרעינית עדשה במישרין ישירות עם תכונות אופטיות שלה.

Introduction

דג דג זברה הוא מודל מעולה ללמוד פיתוח עדשות ופיזיולוגיה בשל הדמיון האנטומי לעדשות היונקים, קלות יחסית של מניפולציה גנטית ופרמקולוגית, מהירות של פיתוח עיניים עובריים, גודל קטן ושקיפות בשלבים המוקדמים המאפשרים הדמיה vivo . השיטות המתוארות כאן פותחו כדי לנתח את מורפולוגיה עדשה של דג דג זברה ב שלבים עובריים ומבוגרים עם דגש על שלמות sutural מורפולוגיה קרום הקליפת בתוך מבחנה ב vivo, ומיקום של מיקום העדשה גרעינית לאורך ה הצירים האחוריים לשעבר vivo. שיטות אלה משמשות כנקודת התחלה עבור מחקרים פונקציונליים של פיתוח עדשות ופיזיולוגיה, כמו גם מסכי גנטי הפוכה עבור פנוטיפים עדשה ב-zebrafish.

דימות מורפולוגיה של עדשות ההדמיה

אקופורטל 0 (AQP0) הוא חלבון ממברנה שופע ביותר העדשה הוא קריטי עבור הן, פיתוח עדשה ובהירות, בשל פונקציות חיוניות מרובות יונקים. Zebrafish יש שני Aqp0s (Aqp0a ו Aqp0b) ואנחנו פיתחנו שיטות לנתח את האובדן של הפונקציות שלהם בעדשות עובריים ולמבוגרים. מחקרים שלנו לגלות כי aqp0a-/-מוטציות לפתח אטימות הקוטב הקדמי עקב חוסר יציבות של תפר קדמי, ו aqp0a/b מוטציות כפולות לפתח אטימות גרעינית1. AQP0 הוכח לשחק תפקידים בתחבורה מים2, הדבקה3,4, השלד הציטומי עיגון5 והדור של מדד השבירה הדרגתי6, אבל מחקרים אלה בוצעו בעיקר ב . בעלי מבחנה דג דג זברה מספק הזדמנות ייחודית ללמוד כיצד אובדן פונקציה, או פונקציה מודאג של Aqp0a או Aqp0b ישפיע על מורפולוגיה ותפקוד בעדשה חיה. כדי להעריך מורפולוגיה של תא עדשה ושלמות sutural במהלך הפיתוח, אנו שונו הקיים שיטות מחוץ לתחום האימונוהיסטוכימיה7 לשימוש בעדשות עובריים ומבוגרים, ו transgenics שנוצר כדי לפקח על תהליך זה vivo .

אימונוהיסטוכימיה ניתוח של מבנה קרום הפלזמה ויושר שלמות התבצע בעוברים קבועים שלמים ועדשות מבוגרים. עדשות zebrafish הם קטנים מאוד (קוטר העדשה הוא ~ 100 יקרומטר בעוברים ועד 1 מ"מ בקרב מבוגרים) לעומת עמיתיהם היונקים שלהם יש תפר נקודה8, אשר נלכדו לעתים רחוקות ב קריודורים. לכן, עדשות שלמות חיוניים לניתוח שלמות. עבור בניתוח vivo של היווצרות תפר הקדמי, והדמיה של אדריכלות תא עדשה מדויקת, יצרנו transgenics המבטא mapple תיוג במיוחד ממברנות עדשה.

היתרונות של הדמיה חיה של העדשה ממברנה transgenics כוללים: 1) הימנעות ממצאים קיבעון, 2) לימוד שינויים דינמיים מורפולוגית בסרטים הזמן פקיעה, ו 3) המאפשר מחקרים האורך שבו ניתן לתאם אירועים מוקדמים יותר פנוטיפים. פיגמנטציה של הקשתית בדרך כלל מונע הדמיה ברורה של הפריפריה העדשה. תוספת של 1-פניקסיל 2-thiourea (PTU) לפני הפרידייה-5 (פרים-5) שלב9 מונע מלאנוגנזה ועין פיגמנטציה עד סביב 4 ימים הפריה (dpf). עם זאת, לאחר 4 dpf, הפריפריה העדשה מטושטשת בvivo, במיוחד בשלבים הישנים. יתר על כן, הצפיפות של העדשה עצמה מטשטש הדמיה של הקוטב האחורי שלה. לכן, כדי ללמוד מורפולוגיה של הפריפריה העדשה, או את התפר האחורי, לאחר 4 dpf, עדשות צריך להיות מסודר וקבוע.

שורות הטרנסגניים משמשות לניתוח מבנה קרום העדשה העובריים ב vivo10. Q01 טרנסגניים מבטאת חלבון פלורסנט ציאן התמזגו לרצף המיקוד של קרום, Gap43, מונע על ידי היזם EF1α והוא הרכיב של האלמנט DF4 pax6 שיפור אוביסקוטיות בתאי סיבים העדשה11. Q01 יש ביטוי אקסטרה מולקולרית, כולל תאים אמקרין ברשתית, אשר מוסיף אות ברקע אם העניין העיקרי הוא העדשה. פיתחנו קו טרנסגניים הרומן המבטא ממברנה קשור ממברנות במיוחד בעדשה, עם המטרה של הימנעות כל האות הנוספת העדשה.

לוקליזציה של גרעין העדשה

גילינו כי גרעין העדשה נע ממיקום הקדמי הראשוני בזחל הדגים למיקום מרכזי בציר הקדמי-אחורי של עדשות למבוגרים. זה משמרת במיקום של השבירה הגבוהה מדד העדשה הגרעין הוא חשב להיות דרישה להתפתחות נורמלית של עדשת העדשה של דג זברה1. השיטות שלנו מאפשרות לכמת את העדשה של צנטליזציה גרעינית ביחס לרדיוס העדשה. באמצעות שיטה זו, הראנו כי Aqp0a נדרש עבור העדשה ריכוז גרעיני1, ושיטה זו פשוטה ניתן להחיל על מחקרים אחרים של פיתוח ופיזיולוגיה של העדשה התכונות האופטיות שלה במודל דג זברה.

Protocol

הפרוטוקולים בעלי חיים המשמשים במחקר זה לדבוק הצהרת ARVO לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

1. גידול דגים והמתת חסד

  1. העלאה ושמירה של דג הזברפיש (המתח AB) תחת תנאי מעבדה סטנדרטיים12. העלאת עוברים במדיום העובר (EM)12. הוסף 0.003% PTU כדי EM מ 20-24 הפריה הדואר (לפני השלב של פרים 5) כדי למנוע היווצרות פיגמנט בעוברים12 המשמש לדימות בשלבים עובריים9. להעלות את הזחלים מ 6-30 ימים הפריה (dpf) על דיאטה של בעלי חיים עד 14 dpf, ולחיות ארטמיה לאחר 14 dpf12.
    זהירות: PTU הוא רעיל מאוד
  2. דג מורדם באמצעות tricaine עד שאינו מגיב למגע.
    1. להכין את המניה tricaine ידי שילוב 400 מ"ג של 3-הבנזואית שלושה אמינו acidethylester, עם 2.1 mL של 1 M טריס (pH 9), ב 100 mL של ddH2O. כוונון ל-pH 7.0 ולאחסן ב-20 ° c.
      זהירות: . טריקיין רעיל
    2. לדלל 4.2 mL של מלאי tricaine ב 100 מ ל של מי טנקים להרדמה הזחלים/מבוגרים או EM כדי לעבור עוברים למטה (הריכוז הסופי של tricaine ב 0.0165% w/v).

2. קיבוע של עוברים וזחלים

הערה: הפרוטוקולים האימונוהיסטוכימיים הותאמו מחומרים שפורסמו בעבר7.

  1. לתקן עוברים או הזחלים של עד 2 שבועות הפריה בתוך 4% (v/v) פאראפורמלדהיד (למעלה) בתמיסת מלח (PBS) ב -4 ° c על נדנדה.
    זהירות: היחידה למען הסדר. היא דליקה ומסרטנים
  2. רוחצים את העוברים שלוש פעמים עבור 10 דקות ב-PBS, והחדירות ב-PBS עם 10% טריטון ו-1% DMSO (PBS-T) לילה ב 4 ° c.
    זהירות: DMSO הוא רעיל, מזיק על ידי בליעה או ספיגת העור, נושאת חומרים מסוכנים דרך העור, והוא דליק. טריטון רעיל, מאכל ומסוכן. בסביבות מימיות

3. חיתוך של זחל ולמבוגרים עדשות דגים

  1. דג מורדם מ 6 הזחלים לבגרות עם tricaine עד שאינו מגיב למגע אך עדיין מראה פעימת לב חזקה. למדוד את אורך בתקן הדג לפי שילינג (2002) עבור האחסון הזמני13.
  2. עיניים בורקות מיד שימוש במספריים לחיתוך מיקרו ומניחים לתוך צלחת לחיתוך ב-PBS (איור 2 המוצג לעיניים בוגרות).
    1. הפוך צלחת 35 mm מותאמת אישית מלא סיליקון לניתוח עדשות. לאחר הסיליקון הגדיר, בבלו דיבוט סביב 2-3 מ"מ קוטר ו 0.5 mm עמוק לשתק עיניים מבוגרים/עדשות במהלך הניתוח.
  3. חיתוך של עדשות בוגרים מדגים
    1. הניחו עין מבוגרת בתוך המנה הצדדית המלאה של הערוץ. לשתק את העין על ידי החדרת מלקחיים בזווית < 45 ° דרך הדיסק האופטי. להיזהר לא ניק או לדחוס את העדשה. הפוך שניים או שלושה חתכים רדיאליים דרך הרשתית והsclera מהדיסק האופטי לאזור הסיליארי עם מספריים לחיתוך.
    2. קליפת לאחור את הרשתית ואת sclera כמו כותרת פרח להפוך את העין, הקרנית בצד למעלה. לשתק את העדשה בעקיפין באמצעות מניפולציה של sclera ו קרנית עם הצד השטוח של המספריים, תוך משיכת הרשתית ואת הרקמות המצורפת עם מלקחיים. לקצץ בזהירות רקמות עודף מן העדשה.
      הערה: זה חיוני כדי לנתח בקפידה כדי להשיג עדשות בריאים בעקביות.
  4. חיתוך עדשות זחל מדגים
    1. מקום עין זחל האחורי למעלה אל החלק השטוח של צלחת הסיליקון מלא PBS ולהשתמש מחט טונגסטן מחודדים לעשות חתכים רדיאליים דרך הרשתית ואת sclera תוך השתק את העין עם מחט טונגסטן אחר או מלקחיים.
      הערה: להיזהר לא לפגוע בעדשה.
      1. לחדד את הקצה של 2 ס"מ באורך של 0.1 מ"מ חוט טונגסטן באופן אלקטרוסטי על ידי השעיית קצה החוט לתוך 10% (w/v) NaOH והחלת מתח נמוך לסירוגין הנוכחית14. על ידי המסת הזכוכית. בעזרת מבער באנסן
        הערה: ניתן להשתמש גם בכלי ניתוח חלופיים משובחים.
        זהירות: . נאאה הוא מאכל
    2. בעדינות להוציא את העדשה מן העין הנתק עם צד קהה של המחט, ובזהירות למשוך את הרקמה המצורפת.

4. קיבוע של עדשות גזור

  1. מיד לתקן עדשות גזור ב-1.5% (v/v) כלפי מע ב PBS עבור 24 h בטמפרטורת החדר (RT). שטוף עדשות שלוש פעמים ב-PBS עבור 10 דקות כל אחד.
  2. עדשות מאופקות לניתוח מטען מלא או קריואופרזציה להקפאה (ראו סעיף 8).
    1. עדשות החדירות ב-PBS-T לילה ב 4 ° c.

5. עדשות אימונוהיסטוכימיה

  1. ממברנות תוויות של העובר קבוע/זחל או עדשות למבוגרים על ידי דגירה ב Phalloidin-אלקסה Fluor 546 (1:200) ו גרעיני תא עם dapi (1:1000 של 5 מ"ג/mL מניות) ב PBS-T לילה ב 4 ° c.
    זהירות: DAPI הוא מטרד לעור ולעיניים.
  2. לרחוץ שלוש פעמים עם PBS-T עבור 10 דקות כל אחד. רקמות ברורות על ידי דגירה 30%, 50% ו 70% גליצרול ב-PBS-T (v/v) עבור לפחות 1 h ב-RT כל אחד, או לילה ב 4 ° c.
  3. הר דגים ב 70% גליצרול ב PBS-T (v/v) אל התחתון זכוכית 35 מ"מ מנות למיקרוגל עם עיניים כמו שטוח ישר נגד שובר הכיסוי ככל האפשר. עבור דג צעיר יותר, הטיה לרוחב הקדמי קל עשוי לעזור המזרח העדשה תפר להיות מקביל את coverslip.

6. ניתוח של העדשה Zebrafish הקדמי באמצעות קו טרנסגניים בVivo

  1. הפקת קווים Tg (βB1cry: מפלט) באמצעות ערכת Tol215. מערכת אלמנט Tol2 סיבל15 מאפשר שילוב יציב של המבנה שבו mapple מונע על ידי 300 bp של האדם βB1-crystallin יזם16 קשור הממברנה על ידי רצף caax וכתוצאה מכך ביטוי במיוחד בקרום העדשה סיבי תאים.
    הערה: מבנה זה (ID: 122451) זמין לרכישה.
    1. בבוקר של הזרקה, להכין את תערובת ההזרקה ולשמור על קרח. כדי להגיע לנפח הסופי של 10 μL של המכיל RNase-and DNase-H חינם2O, להוסיף: 1.5 μl של huβB1Cry: מייפלט DNA לבנות ב 50 ng/μl-[0.375-0.75 pg/הזריקה הסופית], 1.5 μl של Tol2 טרנספט mrna ב 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 pg/ הזריקה הסופית], ו 1 μL של אינדיקטור אדום פנול ב 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/הזריקה הסופית].
    2. הכנס 50-100 pL של תערובת הזרקה לעוברים בשלב 1 תא12.
  2. למדוד יעילות טרנסגנזה ב F0 מוזרק העוברים על ידי מדידת תדירות של עוברים עם עדשות מהאפל ב 3 dpf.
    הערה: יש לצפות ש> 80% יעילות טרנסגנזה בשיטה זו. פסיפסים F0 לאפשר ניתוח מפורט של מורפולוגיות קרום של תאים בודדים. רמות שונות של פסיפס מאפשר לדמות את המורפולוגיות של קבוצות יחיד או קטנות של תאים, בעוד ביטוי עדשה גלובלית יותר מאפשר ניתוח של מבנים רב-תאיים כמו תפרים עדשה ב vivo.
  3. Outcross F0 דגים פסיפס כדי ליצור קווים יציבים, אשר תווית כל קרום התא סיבים. מייסדי F0 עם הטרנסגנים משולבים ב-germline יפיק צאצאים עם שילובים יציבים שניתן לשמור כקווים טרנסגניים.

7. אנליזה של העדשה Zebrafish הקדמי באמצעות קו טרנסגניים בVivo

  1. שנרלים 3 dpf או פסיפס מבוגר או דגים הטרנסגניים יציב ו-1% נמוך להמיס agarose (LMA) עם tricaine עם העין שטוח נגד העטיפה של המכסה של הזכוכית התחתית מנות למיקרוגל.
    1. מפזר 1 גר' LMA ב 100 mL של EM (ללא מתילן כחול) כדי לבצע 1% LMA. חנות לטווח ארוך כ 15 מ"ל מניות ב 4 ° c. מיקרוגל להמיס מלאי ולאחסן ב 42 ° צ' עד כל שפופרת משמש.
  2. לכסות דגים עד 6 dpf עם EM עם tricaine, או עם מי טנקים עם tricaine עבור מבוגרים כאשר LMA מוגדר.
    1. מערבבים 5 מ ל EM ללא מתילן כחול או מים טנקים עם 250 μL של מלאי tricaine ו -7 μL של PTU אם הדמיה PTU התמונה דגים מטופלים.

8. העדשה קריוסטאז ואימונוהיסטוכימיה

  1. הקפאה של עוברים קבועים או עדשות מבוגרים על ידי הצבת 10% סוכות ב-PBS (w/v), 20% סוכרוז עבור 1 h ב-RT כל אחד (או לילה ב -4 ° c) ולילה ב 30% סוכרוז ב -4 ° c.
  2. הטמע רקמות ב-oct בתבניות בסיס, ולאחר מכן הקפא על הצ'קו עם OCT. קריודור ב 12-14 יקרומטר ולאסוף על מגלשות מיקרוסקופ rost/Plus. מקטעים חמים על שקופית עבור 10 דקות על מחמם שקופית מראש עד ~ 35 ° c.
  3. שטוף מקטעים שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד. מקטעי תווית עם Phalloidin-אלקסה קמח 546 (1:200) עם DAPI (1:1000) או WGA-אלקסה קמח 594 (1:200), ואחריו שלושה שוטף PBS. הר עם בינוני הרכבה אנטי לדעוך, ו חותם שמיכות עם לק ציפורניים.

9. הדמיה

  1. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. לרכוש z-ערימות או פרוסות אופטיות באמצעות 60x N/A 1.2 מטרה לטבילה במים, או דומה, באזורים מסוימים מתוך הקוטב הקדמי עד העדשה האחורי. השתמש בהגדרות הרכישה הבאות: 1.2 מאוורר דיסק באמצעות לייזר מ561 nm, טקסס מסנן אדום עבור phalloidin-אלקסה קמח 546 או מאפל, או לייזר 405 עם מסנן UV עבור DAPI.
  2. תיקון z בעוצמה לייזר כוח כדי לנטרל את אובדן האות עם עומק לתוך העדשה. זה מאפשר אות חזק בקוטב האחורי של קבוע לחיות 3 העוברים dpf, ואות חזק פרוסות אופטיות המשוונית בעדשות דגים למבוגרים.
  3. בצע קומפילציה והצג תמונות באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות.

10. מדידת הלוקליזציה של גרעין העדשה בציר הקדמי-אחורי

  1. אוריינט עדשות טרי מחדש axially ב-PBS בצלחת 35 מ"מ עם התחתון coverglass, עם מוטות ותפרים מונחה במקביל למישור המיקוד. חפש הבדל במדד השבירה, אשר מתרחשת בדרך כלל בממשק של קליפת העדשה וגרעין העדשה כדי לזהות את גרעין העדשה.
    הערה: בריא מסוג פראי עדשות מבוגרים שקופים מאוד מקשה לראות את התפרים העדשה ואת הגרעין, או כדי לקבוע את כיוון העדשה. במקרה זה, ניק קל עם מלקחיים כדי קפסולת העדשה גורמת נזק קטין, מה שהופך את התפרים ואת הגרעין העדשה לכאורה ב 10 דקות עוזר האוריינט העדשה עבור מדידה זו. עם זאת, העדשות להפוך לבלתי שמיש עבור יישומים במורד כפי שהם פגומים עכשיו.
  2. קח תמונות של עדשות עם הגרעין העדשה בפוקוס תחת התאורה באור שדה בהיר עם או בלי אופטיקה DIC באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה עם מצלמה מחוברת. התמונה מיקרומטר תחת אותה הגדלה לכיול.
    1. לחץ על לחצן תצוגה חיה, להתאים את הגדרות החשיפה כדי להמחיש את הגרעין העדשה הפריפריה העדשה, ולקחת תמונה על ידי לחיצה על כפתור לצלם. שמור כקובץ tif.
    2. השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי לכייל את תמונות העדשה הנרכשת. בחרו בכלי קו ישר וציירו קו אורך ידוע בתמונת המיקרומטר, לחצו על הלחצן ' ניתוח ' | קביעת קנה המידה. הזן מרחק ידוע, יחידות ובחר כיול ' כללי ' ולחץ על הלחצן ' אשר '.
  3. למדוד את המרחק של מרכז גרעין העדשה אל הקוטב הקדמי (a-r).
    1. השתמש בכלי קו ישר בתוכנת עיבוד תמונה כדי לשרטט קו על פני מרכז הדימות של גרעין העדשה בכיוון צירית. קח את המרכז של הקו הזה כמרכז של גרעין העדשה.
    2. צייר קו אחר מנקודה זו אל הקוטב הקדמי של העדשה ובחר ' מדידה ' בתפריט ' לנתח ' כדי למדוד את המרחק (a-r), שם הוא רדיוס של העדשה ו- r הוא המרחק ממרכז העדשה למרכז ה גרעין.
    3. ציירו קו נוסף מהקדמית לקטבים האחוריים ולמדוד את המרחק הזה כמו קוטר העדשה (2a). העתק אורכים אלה מחלון ' תוצאות ' והעבר לתוכנית גיליון אלקטרוני או סטטיסטיקה.
      הערה: קל יותר למדוד בדיוק ממרכז הגרעין אל הקוטב הקדמי, מאשר מדידה ממרכז הגרעין של העדשה למרכז העדשה. מדידה זו מומרת על ידי הנוסחה בשלב 10.3.5 כדי לדווח על המרחק של מרכז גרעין העדשה למרכז העדשה. השתמש תמיד בגרעין המבוגר למדידות, גם אם הגרעין העובריים ניכר.
    4. לחלק את הקוטר ב 2, כדי לחשב את רדיוס העדשה, a.
    5. חשב r/a, כפי figure-protocol-10846 שהוא הלוקליזציה המנורמל של גרעין העדשה ביחס לרדיוס העדשה.
      הערה: עבור גרעין שמוקם קרוב יותר לקוטב הקדמי, r/a יהיה > 0.0, בעוד שהגרעין המותאם לשפה המקומית יהיה r/a של 0.0.
  4. גרף את היומן של המדידה של גרעין הציר המנורמל כפונקציה של האורך הסטנדרטי כדי לקבוע שינויים בלוקליזציה של גרעין העדשה במהלך התפתחות הדגים.

תוצאות

האנטומיה של עיניים בוגרים דומה מאוד לזו של יונקים (איור 1A). למרות הבדלים מסוימים בין הדגים הזברזיים ועיני היונקים, כגון האזור הסילימארי במקום גוף מעונה17, הבדלים בתכונות אופטיות18, והבדלים מורפולגנזה במהלך התפתחות מתחלקים

Discussion

ניתוח של מורפולוגיה עדשה דג זברה הוא הצעד הראשון הבנת פנוטיפים המוטציות, או את ההשפעות של התערבויות תרופתי מכוון ללמוד ביולוגיה של העדשה העינית. אנו מתווה שיטות לניתוח תפרים עדשה, מורפולוגיה תא הקליפת סיבים והיבטים של גרעין העדשה. גישות אלה הן שילוב של מבחנה ב - vivo (בהשוואה לט...

Disclosures

. אין לנו כל גילוי

Acknowledgements

היינו רוצים להכיר את מקור המימון שלנו: NIH R01 EY05661 ל-J. E. H, Ines Gehring לסיוע ביצירת המוטנטים aqp0a/b כפול וגידול בדגים, ד ר דניאל נדרנוב לדיונים המובילים ליצירת הטרנסגנאנים, ד ר ברוס בלומברג ומעבדות ד ר קן צ'ו לשימוש הניתוח שלהם מיקרוסקופ, ד ר מייגן סמית לעזרה עם אנליזה סטטיסטית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-phenyl-2-thiourea (PTU)SigmaP7629CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy SciencesRT 157-4CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050SObjective and chamber temperature set to -21˚C
DAPIInvitrogenD1306CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base moldVWR Scientific15154-631
Disposable Pasteur glass pipetsFisherbrand13-678-20A
Dumont # 5 forcepsDumont & FilsKeep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)Sigma-AldrichA5040CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GlycerolSigmaG2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA constructAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements AR softwareNikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controllerOlympus CorpDP70
Olympus microscope Olympus CorpSZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546Thermo FisherA22283
Phenol Red indicator (1% w/v)Ricca Chemical Company5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Photoshop softwareAdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objectiveNikon
Power sourceWild HeerbruggMTr 22Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FSFisher Scientific12-594
Sodium Hydroxide beadsFisher ScientificS612-3CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slideFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow CorningWorld Prevision InstrumentsSYLG184
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissorsTed Pella Inc1346Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting mediumVector laboratoriesH-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
  13. Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147ZebrafishAQP0MIP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved